人类脐带沃顿Jelly-Derived成人间充质干细胞,以合成支架为实验皮肤再生

文摘

皮肤组织工程的最终目标是再生皮肤损伤,允许形态和功能属性的完整恢复像以前受伤。为此,我们已经组建了一个新的原型的仿生成年人类脐带间充质干细胞(hUCMS) / fibrin-based脚手架。我们有充分的特点提出真皮等效(DE)体外评估形态,功能,和包裹细胞的生物学特性。我们将DE皮下移植到免疫活性的啮齿动物,以验证其生物相容性。最后,我们研究了DE贪污影响全层的伤口,在免疫活性的老鼠来演示其功能驱动愈合过程没有明显的疤痕组织。这些体内研究燃料的优秀结果希望这种新方法,基于生物合成,可能应用于手术治疗皮肤损伤(即。,糖尿病足溃疡和伯恩斯)人。

1。介绍

皮肤再生,尽管稳步推进,充满了许多未解决的问题。自体皮肤移植是传统治疗伤口修复,虽然背负一些限制,从发病率施主能级不可能治疗大伤口导致贫穷美的结果。皮肤组织工程的最终目标是再生皮肤允许受伤区域的完整的结构和功能性质回到他们之前受伤。

在这项研究中,我们旨在开发一种新的再生仿生hUCMS / fibrin-based脚手架(DE)。这个真皮相当于人类应该由hUCMS和纤维蛋白。众所周知,一个最佳的治疗伤口的再生,没有发生不必要的疤痕,应该包括调制的炎症,诱导组织再生,减轻机械力量,营业额和ECM重塑[1- - - - - -3]。DE原型提出的目的是满足这些目标通过提供一个暂时的保护涂层和组织结合刺激经济增长。

干细胞是一种独特的细胞群品质的自我更新和细胞分化能力。这些性质使其再生治疗皮肤损伤和一个有吸引力的选择整形手术的审美过程。特别是,hUCMS(人类脐带沃顿jelly-derived间充质干细胞)成体干细胞,认为能够区分,在体外和体内,分成几个细胞表型(4- - - - - -6]。hUCMS归航的态度很可能与趋化因子受体和粘附分子的表达(7]。进一步的临床兴趣推动了观察hUCMS immunoprivileged,由于缺少HLA-DR II级,而与免疫调节相关的属性(8- - - - - -10]。这些特性似乎与体液因素释放hUCMS (TGF -β1、进气阀打开,白细胞介素6、PGE2 HGF, VEGF) [11,12和与目标细胞的相互作用13,14]。此外,hUCMS表达HLA的所有三种,即HLA-E HLA-F, HLA-G家庭。这些分子参与耐受性过程发生母婴接口(影响15]。特别是,它被描述HLA-G释放人类的间充质干细胞使扩张Treg细胞(16]。我们最近hUCMS的免疫调节特性显示在两个自身免疫性疾病如1型糖尿病(近年来)和干燥综合征(压)10,17]。hUCMS可以帮助控制炎症和刺激伤口再生,恢复整个皮肤组件。

纤维蛋白来源于人类的血液,在未来临床应用的观点,是获得来自同一主题的应用。纤维蛋白是一个合适的分子用于细胞时体现:事实上,它不仅充当支架的细胞可以很容易地适应但还提供了分子信号来调节细胞的功能,因为它包含整合蛋白的结合位点,生长因子,和其他ECM组件包括纤连蛋白和胶原蛋白。体内纤维蛋白沉积可能有助于恢复组织的恒定性和调制的炎症18]。德的身体上,即将到来的存在受伤区域能够减弱机械拉力(19]。事实上,有一个倾向形成瘢痕疙瘩和肥厚性疤痕地区在高拉伸/收缩张力[20.]。

最后,这个支架位于它的简单和可再生的创新组合的过程。

我们旨在探索准备合适的德的可能性,这可能促进壁厚皮肤损伤的修复和再生,以最小的疤痕组织,没有感染或拒绝,并创建一个low-inflammation伤口环境。我们有充分的特点提出bioscaffold至于体外检查和免疫活性的啮齿动物体内研究。

2。材料和方法

2.1。hUCMS隔离和细胞培养

我们从检索孤立hUCMS产后人类脐带被Montanucci et al。4]。孤立的细胞被播种在6000 - 8000的浓度/厘米²每聚苯乙烯有核细胞细胞培养瓶,瓶预处理和透明质酸(HA)在1毫克/毫升瓶,1066年CMRL介质(Gibco,英杰公司)补充10%胎牛血清,2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素和链霉素,50μg / ml阿米卡星和5μg / ml环丙沙星(普通介质(NM))在37°C和5%的公司₂。这些细胞被维持在37°C湿润空气的95%。细胞扩张,直到80%融合通过治疗0.05%胰蛋白酶/ EDTA (Gibco) 3在37°C。血清随后添加到块胰蛋白酶活性。细胞IV-VIII文化被用来准备通过纤维蛋白支架(S)和真皮等价物(DE)。

2.2。制备纤维蛋白支架和真皮的等价物

纤维蛋白凝胶形成的支架是由混合两种解决方案。一个卷的等离子体(离心获得的健康的捐赠者的新鲜血液和过滤的0.45μ米孔隙过滤器)添加0.9%氯化钠hUCMS 1.3卷。后者被添加到纤维蛋白凝胶的最终浓度0.9%的氯化钠2.2×10⁵细胞/毫升。解决方案2是由混合二十卷的氯化钙(1% CaCl₂在0.9%氯化钠)一个卷的氨甲环酸(100毫克/毫升氨甲环酸在0.9%氯化钠)。细胞的1.8毫升/等离子体混合物注入12-well文化板块之一。我们获得的凝固孵化cell /等离子体解决方案2分钟37°C在湿润的气氛中。然后,正常培养基添加到支架。18小时后纤维蛋白支架的生产,DEs组装:6×10⁵hUCMS被播种在每个支架和培养7/10天在海里。每两天中被改变。

2.3。组织学和免疫组织化学分析(包含IHC)

组织学和免疫组织化学分析,DEs在10%的中性缓冲福尔马林固定24小时在室温下,脱水,石蜡包埋。石蜡包埋标本切旋转切片机(3.5μ米厚片)和苏木精和伊红染色,马森的三色的,细胞角蛋白染色和荧光桃红B-Orange G-Alcian蓝色。根据标准组织学染色进行协议。表皮厚度是评估通过Photoshop软件(Adobe)故事采取幻灯片9日沾):他们是均匀分布从边缘到中心的伤口;在伤口面积,选择三个字段和5厚度进行的评估完成。数据标准化的平均数±标准差正常表皮(z分数)。至于胶原蛋白评价,我们分析了幻灯片的故事在马森的三色的染色Photoshop软件:我们选择和计算,在伤口区域,相同颜色的范围内的所有像素邻近正常皮肤,兼容特定的胶原染色。区域的像素数量是规范化的价值进行评估。像素相关匹配的正常皮肤领域也算和规范化如上表示。进行这种分析5张幻灯片均匀分布从边缘到中心的伤口每个样本。获得的值,相对于在同一实验样本点(从两只老鼠在21天,两只老鼠在36天),计算和归一化对正常的皮肤区域值。数据提出了作为检测胶原蛋白的百分比,相比,与正常皮肤。

免疫组织化学分析是3.5μm幻灯片使用主要抗体,特定的人类ki - 67;平滑肌肌动蛋白(SMA);CK19;波形蛋白;钙粘蛋白;层粘连蛋白;肌间线蛋白;或鼠标CD3、CD11b或CD20。自动免疫组织化学分析使用自动徕卡键系统(英国纽卡斯尔徕卡生物系统有限公司)在徕卡BOND-III乐器。幻灯片和苏木精复染色。

细胞在德比保持在海里的文化。在这个目的,采用单元块的方法。细胞培养在烧瓶内处理0.05%胰蛋白酶/ EDTA 3分钟37°C,其活动被血清;用0.9%的生理盐水;在10%的中性缓冲福尔马林固定24小时,在室温下;并接受以下使用主要抗体特定免疫组织化学分析相同的标记分析德。ki - 67阳性细胞计数,每单元块8字段选择(40 x放大),4 - 5个字段(20 x放大)内部支架的表面和5 (40 x放大)。

2.4。免疫荧光

免疫荧光分析,我们清除从标本石蜡和脱水部分。然后,一夜之间抗原检索是由孵化Tris-EDTA (pH值9.0)缓冲在37°C在湿润的气氛中。透化作用与特里同x - 100在D-PBS 10 0.01%并与1% BSA D-PBS 45块被执行。主要抗体是一夜之间添加+ 4°C,同时增加了二次抗体1 h和30 。主要抗体特定人类ku80。细胞核与碘化propidium复染色(σ)和最后幻灯片与Mowiol安装4 - 88 (Calbiochem),准备根据制造商的指示,而0.6% 1,4-diazabicyclo(2.2.2)辛烷(DABCO;σ)是用作抗衰落的代理。图片收集在一个Axio观察者A1荧光显微镜(蔡司)配备一个AxioVision其中相机。

2.5。可行性分析

的CellTiter-Glo®3 d细胞生存能力分析(Promega)和GloMax®发现系统(Promega)被用来评估细胞生存能力;他们是基于目前ATP的量化,这是一个标志,证据新陈代谢活跃的细胞。

2.6。透射电子显微镜(TEM)和扫描电镜(SEM)

样本前缀2%戊二醛;与0.2 Na甲次砷酸盐缓冲(pH值7.4)2 h在4°C;在同一个缓冲区冲洗;四氧化锇后缀与2%,同样的缓冲2 h;脱水ethanol-graded系列;和嵌入在环氧树脂环氧树脂。超薄部分与醋酸双氧铀染色和柠檬酸铅和TEM研究400 t飞利浦飞利浦(B) 60千伏。

样本前缀2%戊二醛;与0.2 Na甲次砷酸盐缓冲(pH值7.4)2 h在4°C;在同一个缓冲区冲洗;四氧化锇后缀与2%,同样的缓冲2 h;脱水ethanol-graded系列;和极度point-dried涂上金钯。检查下的样品进行了扫描电镜(荷兰飞利浦,飞利浦扫描电子显微镜,B)在15千伏。

2.7。通过rt - pcr和qPCR转录表达分析

培养细胞的细胞总RNA提取使用三试剂方法(Bio-Rad实验室、米兰、意大利),苯酚:氯仿提取和乙醇降雨雪。0.5 - 1的互补脱氧核糖核酸合成μ使用iScript cDNA g总RNA合成装备(Bio-Rad实验室)。获得cDNA被用作模板的PCR反应,包含400海里的引物对扩增的基因产物(补充表表示1)。

qPCR放大进行了通过使用SsoFast EvaGreen Supermix由制造商(Bio-Rad实验室)。3000 Stratagene MxPro放大进行优化,并分析运行在一式三份,两步PCR反应在以下条件下:Taq激活30 95°C ,紧随其后的是降价周期10的95°C ,和退火温度在60°C 10 。PCR产品被证明是一个融化曲线和PCR产物的电泳分析。每个基因的mRNA的相对量化是由比较2^−ΔΔCt方法,目标是参考基因HPRT1规范化。统计学意义是由计算95%置信区间(21]。

2.8。细胞因子测定

一只老鼠细胞因子数组mIL1b mIL6, mIL10 (Aushon Ciraplex™)购买从特马Ricerca Srl(意大利)。

2.9。动物

所有免疫活性的CD1小鼠被安置在佩鲁贾大学兽医服务中心按照institution-approved动物保健指南。所有程序都是佩鲁贾大学动物福利委员会的批准。

2.10。手术技术

2.10.1。皮下移植

背是准备和聚乙烯吡咯酮碘擦洗。背部皮下口袋里准备。德被放进口袋,4 - 0 polyglactin打断了缝合的皮肤缝合。

2.10.2。全层损伤嫁接

背是准备和聚乙烯吡咯酮碘擦洗。一个圆形的全层皮肤样本(直径1.5厘米)切除背地区。德或细胞支架(S)与4 - 0 polyglactin缝合的伤口。手术部位被覆盖上了一层薄纱油脂敷料。控制,一个圆形的全层皮肤样本(直径1.5厘米)切除背地区。直接与担保薄纱油脂、伤口穿着。

2.11。统计分析

胶原蛋白表皮厚度测量和评估,分布的变量被Shapiro-Wilk评估测试和数据标准化,对于每一个治疗,意味着和SD正常的皮肤厚度(z分数)。双向方差分析重复措施(RM-ANOVA)是用于检测各组之间的差异。小动物——一张长有值< 0.05被认为是显著的。qPCR数据表示为平均值±标准偏差(SD)最后三个独立的实验。统计学意义是由计算95%置信区间。

可行性数据表示为平均值±标准偏差(SD)最后三个独立的实验。双面的学生的t以及用于对比组。显著性水平是设定在 。统计分析使用IBM spss 21.0版(美国IBM公司,位于纽约阿蒙克市,2011年)。

3所示。结果

3.1。发展和特征真皮当量(反)

hUCMS是由我们的方法4)和扩展体外CMRL补充10%胎牛血清的边后卫在聚苯乙烯的玻璃瓶,使用透明质酸(HA)(图1(一))。文化对HA允许更高的ECM比未经处理的生产(数据没有显示)。生成德,我们使用IV-VIII通过培养hUCMS。最初,一个包含细胞生成纤维蛋白支架;此后,在O / N孵化,其他细胞支架(图上的多个分层1 (b))。细胞形态是第一个通过相差显微镜检查评估。纤维蛋白matrix-entrapped细胞出现纺锤状,均匀分布在整个支架(图1 (b))。扫描电子显微镜(SEM)展示了细胞体现在纤维蛋白+支架的结构,在聚合创建一个密集的网络细胞和允许气体/营养扩散(图1 (d))。内圆)染色证实细胞均匀分布(图1 (e))。体现在细胞支架防止自己的退化在文化维护。事实上,没有细胞含有纤维蛋白支架发生退化在文化(数据没有显示)。另一方面,细胞随后添加不穿透内支架,而是接触表面形成致密层(图1 (e))。

细胞生存能力保持不变(图7天的文化1 (c)),48小时相比,一个简单的支架和德,表明细胞群未经凋亡或过度增长。TEM证据的外层纤维蛋白原纤维(图多细胞构造席位1 (f))。两个相邻细胞及其膜接触没有开发专门的时刻。细胞超微结构显示形态保存完好的内质网(ER)表明DE表面细胞新陈代谢在健康和活跃。细胞在纤维蛋白支架上覆盖物,倾向于形式,在文化的日子,一个多细胞结构。在这里,至少可识别的三个部分:(a)上部分是由flat-spindled细胞;(b)较低的部分是由圆/ polygonal-shaped细胞无序分布;和(c)此外,在两个部分的边界,面积由一些细胞含有无定形材料被确认在三色的染色酸性黏多糖。事实上,hUCMS躺在德表面形成一个由特定细胞多层表达角蛋白染色(图1 (e))。DEs免疫组织化学是用来评估三维结构是否会影响细胞分化培养控制相比,细胞(图1 (g))。hUCMS积极染色为SMA(平滑肌肌动蛋白)、波形蛋白,和CK19代表假定这些干细胞的特定标记:积极性保持稳定也当细胞形成了德(尽管不是所有德表面细胞保持SMA阳性和波形蛋白)。在基底和内德,hUCMS表达层粘连蛋白过量;这ECM糖蛋白的形式与蛋白聚糖复合物,胶原蛋白,另一个矩阵的组件。然而,无论是hUCMS还是DE钙粘蛋白阳性表达,典型的上皮细胞,蛋白质或肌间线蛋白,肌样细胞的典型标记表明肌细胞表型的诱导。我们终于Ki67的表达研究,核蛋白质表达的增殖(在有丝分裂周期的所有步骤)但不是静止的细胞。细胞培养在透明质酸Ki67阳性(71.12%),内德,积极性是4.67%和10.46%(内外区、职责)。因此,德细胞可能与扩散能力下降有关。

qPCR表明,胶原蛋白的纤维蛋白基质明显提高细胞信使rna表达1、3和4以及金属蛋白酶,改造它(图1 (h))。细胞角蛋白mrna,最初由hUCMS表示,增加。KLF4 mRNA表达诱导在德比培养细胞。KLF4是负的细胞周期的监管机构,但它也扮演着重要的角色在细胞分化的器官发生皮肤,结肠,和眼睛。SMA是一个典型的标志myofibroblasts因此hUCMS;当这些细胞组织内德,相对mRNA表达往往会下降。信使rna表达的转录因子OCT4 NANOG,涉及维护细胞多能性和自我更新,强烈调节相比,在培养细胞。qPCR和世行被用来评估如果德形成干扰(图S1A, B)细胞免疫调节能力。一般来说,德建设增加了分子与免疫调节相关的生产(图S1A, B)。

3.2。皮下移植

确定DE充满奇妙生物相容性和免疫能力,这是嫁接皮下注射,在免疫活性的CD1小鼠(图2(一个))。后7、14、21和42 d Tx,动物被抽血的等离子体收集和贪污是仔细检查(图删除2 (d))。在任何时间点的贪污,皮下植入是没有任何炎症反应。在牺牲,德显然是辨认和涂覆的皮肤,而不是底层的肌肉组织,而neovessel周围形成强烈的Tx的7天,从而消失(可能与手术)。没有明显的纤维组织。德显示与时间相关的大小可能与纤维蛋白降解减少。在平行,马森和特殊的组织学染色显示逐步增加弹性纤维建议更换与胶原纤维蛋白。人类的核内蛋白Ku80是专门用于标识hUCMS(数据2 (b)和2 (c));这个标志体现在边境地区,hUCMS涨跌互现,清白的(可能是鼠)细胞(图2 (d))。的时候,逐步导致很难区分德边界从脚手架的核心是唯一well-identifiable结构本质上是由一些细胞和大ECM。在外植体在42天,Ku80信号丢失。

图3,德42 d,描绘了广泛组织新生周围其余DE。这样的组织看上去富含血管和最重要的是展示了头发和皮下腺体出芽。德内细胞类似于preadipocytes,元素检测。这些出现在21 d的TX(数据没有显示)。因此,在42 d,外植体的形态似乎表明DE增强小鼠皮肤附件的一代。

CD3、CD11b和CD20 immunophenotyping(图S2),在不同的时间内德,显示非常微弱的T细胞和B细胞或巨噬细胞异种移植的确认完整的生物相容性。这些部分的放大显示小鼠组织之间的亲密联系发达和德。

摘要意思的减少β在血清白细胞介素6,评估牺牲,在整个研究证实,没有拒绝。增加IL10水平与免疫耐受在42 d相比的控制(数据未显示)。

3.3。全层损伤嫁接

图4(一)表明DE的嫁接方法植入在全层损伤的老鼠的脖子。病变的平均1.5±0.1厘米直径。伤口治疗与支架移植(S),而对照组是处理简单的薄纱油脂药物(W)。嫁接动物进行外植体在15日,21岁,36 d。伤口处理德似乎治愈慢于那些只接受支架或虚假,虽然伤口看起来更更好的最后结果(图4 (b))。在治疗过程中,伤口边缘是常规和厚度,估计通过皮肤透明度为外植体,类似皮肤再生和邻近正常皮肤。没有炎症反应观察(图4 (b))。wound-containing皮肤切除,病理组织评估。在不同时期,中央组织切片,染色),马森,或角蛋白,而控制如图5。支架移植物(S)与皮薄无皮下组织的生成(S21d和S36d)。

特别是德显示大量的粒状组织15岁,21岁,和36天:事实上,DE允许再生的真皮,均匀的方式,可能会延迟愈合。没有收缩现象,否则可见的伤口(21和W36)以及支架(S21和S36)。高倍率检查图6(一)关注的核心在伤口治疗21天比未经处理的伤口后染色)。小鼠真皮,DE治疗后,与控制,似乎是非常均匀的头发出芽。在(图36天6 (b)),伤口完全愈合在控制和接受者,尽管后者,表皮均匀、厚度、和皮肤充满弹性纤维整齐地排成一观察与控制。

表皮厚度、水平的一半的伤口,在接受者,连续幻灯片,相比,在未经处理的控制,排名变化意味着健康的皮肤厚度值,表现出(z分数)(数据6(一)和6 (b))。健康的皮肤表皮之间的差距和治疗皮肤厚度增加稳步进入伤口治疗动物的核心在21天。这样一个不同的趋势表明,控制动物,伤口收缩的存在在德不在收件人(只有愈合延迟存在)。在36天,表皮厚度的变化(在健康的皮肤相比)是减少和齐次整个DE伤口治疗。控制动物,厚度变化是不变,增加向伤口中心。这个数据可能显示,两个动物组织的愈合过程是不同的:未经处理的伤口愈合迅速但无序,由于伤口收缩成伤疤。相反,DE-treated伤口愈合缓慢,它允许正则系综的皮肤部分没有疤痕。这是证实了高倍率的幻灯片沾马森染色(在两次引用)是一致的,在酸性胶原纤维有序组装的德(与控制)治疗动物(数字6 (c)和6 (d))。图6 (e)还表明,胶原蛋白的比例在伤口比较两者之间的实验动物组:标准差确认两种治疗之间的主要区别是定性的而不是定量的。图6 (f)显示了高放大率、圆)染色后,中央伤口面积和证据的形成新的皮肤附属物在任何时间。

4所示。讨论

伤口愈合是一个复杂的过程,需要协调ECM的相互作用,生长因子,细胞。尽管近年来无数生物材料科学的进步,大多数的生物材料用于伤口愈合继续不足,由于政府的困难/交付,生物相容性差,或其他因素。

在这里,我们表明,纤维蛋白和间充质成年干细胞表皮等效能够驱动伤口愈合没有疤痕形成。雇佣德与几个特点:它含有纤维蛋白来源于同一个病人的复杂的应用;因此,不良反应和免疫排斥的风险将是很小的。此外,聚合过程控制,由调制的Ca^{2 +}浓度和温度,创造支架所需的属性。纤维蛋白与优秀的止血能力,形成DE好的3 d配置。DE高度多孔的,事实上,我们的相互关联的一个清晰的三维结构,陷阱里面的细胞,但同时允许营养物质和气体的自由流通。然而,纤维蛋白单独与有限的机械强度(22]。为了克服这个障碍,我们继续文化DE体外10天,使合并hUCMS产生ECM带来额外的机械强度。这些技能帮助减少皮肤拉伸/收缩的现象,会导致疤痕和瘢痕疙瘩的形成20.]。最近的报告表明,培养巨噬细胞在纤维蛋白凝胶,所使用的纤维蛋白原结合thrombin-stimulated抗炎细胞因子的分泌,如白介素10 (IL10)。相比之下,暴露的巨噬细胞可溶性纤维蛋白原刺激高水平的炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF -α)[23]。因此,DEs(本身)提供一个有价值的免疫调节支持组织愈合和再生。此外,新生成的透明质酸的存在可能会增加的旁分泌活动hUCMS(下面讨论)增加治疗效果在伤口愈合24]。

目前,大多数的相关研究msc在伤口皮肤临床治疗相关BM-MSCs;只有有限的研究中提到的应用hUCMS [25,26]。然而,获得hUCMS是容易得多的过程4),不伤害捐献者,而获得其他间充质细胞类型的过程中,除了那些从脂肪组织中检索。然而,虽然使用自体的细胞可能会更好,在检索或文化上维护或支架制造、时机仍将是一个障碍。事实上,溃疡或病变必须尽快治疗。此外,hUCMS容易冻结和解冻,它允许访问手机银行,在准确的微生物学的筛查,提供的产品将可以应用于一代的表皮等价物。另一个有趣的细胞类型,在这的目的,可能是胎儿成纤维细胞。他们有效地应用于糖尿病伤口的治疗由于其免疫调节特性和细胞基质生产(27,28]。我们相信,后者使用hUCMS报告进一步加强的原则:事实上,它们与胎儿成纤维细胞分享一些属性,如免疫调节活动,胎儿起源,myofibroblast身份。hUCMS表达阳性的细胞骨架纤维支持他们的“myofibroblast”特性(一个词由Majno et al。29日)定义细胞表达,在超微结构水平,平滑肌细胞和成纤维细胞)的共同属性。特别是,收缩的肌间线蛋白等蛋白质和alpha-actin平滑肌(myofibroblasts的标志),这些细胞表达的不是肌肉肌凝蛋白(4),而肌凝蛋白是缺席。此外,这些细胞也表达波形蛋白(4),中间丝蛋白,是典型的间充质来源的成纤维细胞,但波形蛋白不表达的平滑肌细胞。Coexpression这些细胞波形蛋白和肌间线蛋白的支持,他们本质上是myofibroblasts。其他有趣的中间丝表达了hUCMS由上皮细胞表达细胞角蛋白,正常情况下endodermic ectodermic起源。最后,细胞产生细胞外基质、成纤维细胞一样。

hUCMS从本质上是低免疫原性,能减轻伤口的炎症环境分泌的各种免疫调节分子。此外,hUCMS表达分子出席参与耐受性的母胎界面过程:HLA-E, HLA-F, HLA-G [15]。特别是,它被描述,HLA-G可以刺激调节性T细胞的释放,也显示我们(10,17]。

我们知道衰减的免疫反应是一个重要因素,确保正常改造受伤而持续的炎症伤口创造了一连串的事件,使得无法愈合状态。此外,促进环境耐受性结果从hUCMS旁分泌因子的分泌,可以回忆起许多细胞类型,包括上皮细胞、内皮细胞、角质细胞,成纤维细胞,和管理许多不同的细胞反应有关的细胞生存、增殖、迁移和基因表达30.]。

进一步的调查显示,真皮成纤维细胞分泌大量胶原蛋白I型和增加改变基因表达,以应对msc (31日]。我们认为,在我们的案例中,这种调制的能力取决于独立hUCMS分泌基质。事实上,纤维蛋白支架,在天的离体培养,移植前的动物,充满了胶原蛋白和透明质酸。我们知道胚胎,没有疤痕的伤口愈合的能力将减轻炎症环境(32)和生产能力比成年人(ECM成分不同2,33]。

我们的细胞是很适合脚手架创建;DE形态特征从而获得让人想起那些正常的人类皮肤。事实上,hUCMS播种在纤维蛋白支架表面保持他们组织形成多层结构,就是明证染色)。

此外,通过马森的三色的和qPCR分析,那里已经急剧增加,胶原蛋白的表达类型III和IV和metalloproteases,我们已经表明,这些细胞诱导合成大量的细胞外基质(ECM)。

根据qPCR数据相对于Klf4信使的增加与减少的百分比ki - 67表达,维持生存,和减少平滑肌肌动蛋白(SMA)的信使,我们可以假设DE细胞开始诱导上皮分化。事实上,最近的文献描述了Klf4必要上皮分化的增加,因为,它刺激生产的各种类型的成熟的上皮细胞(细胞角蛋白34]。

然而,获得的数据表明,hUCMS由多层和well-compacted细胞,缺乏差异化的well-recognizable层皮肤。此外,qPCR使者的分析显示缺乏表达细胞角蛋白5和14个典型的成熟表皮的基底层。细胞水凝胶显示相关转录因子的表达增加了hUCMS维持多能性和自我更新(Oct4、Nanog)相比,在标准条件下细胞生长。

分化和旁分泌信号都被牵连msc改善组织修复的机制。我们的数据表明,在42天的皮下组织移植,hUCMS完全消失(缺乏Ku80表达式),但有一个显著的新生小鼠皮肤附件的毛,腺体。因此推测,他们的行动是有效的旁分泌信号调节当地细胞反应损伤比的水平分化转移(35]。相关性与新生的头发灯泡在伤口愈合过程中,对成肌细胞重编程(位于脂肪组织)与相应的疤痕最小化,由于真皮再生,最近强调[36]。这是一个有趣的特性我们的细胞,因为传统的真皮替代不能再生。此外,头发再生给我们完整的皮肤再生的外观。全层的伤口,厚和齐次表皮获得比控制。可能,hUCMS可能刺激小鼠居民干细胞(推定地鼠myofibroblasts)皮肤和诱导其增殖和分化。

最好的伤口愈合是组织学部分所示显示弹性纤维经过36天的移植与伤口本身和缺乏疤痕的事件。

5。结论

hUCMS仿生支架组成,纤维蛋白(DE)是简单的制造,它类似于正常皮肤架构。DE高度生物相容性,刺激皮肤附件的再生,并能提高伤口愈合没有疤痕形成。

这些发现使我们相信德提出的模型可以代表一个有前途的工具治疗全层的表皮损伤,可预见与临床应用,例如,糖尿病足溃疡的治疗。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

朱塞佩Basta和里卡多。高级coauthorship Calafiore分享。

确认

Altucell Inc .)的支持,阿斯特法院3日,迪克斯丘陵,纽约,纽约,美国(11746年),和“Consorzio Interuniversitario Trapianti d 'Organo,”罗马,意大利,请承认。

补充材料

补充表1:qPCR中使用的引物。图S1:体外表征的皮肤相比,支架。图S2: CD3、CD11b和CD20 immunophenotyping DE细胞。图S3:全层损伤DE嫁接。(补充材料)

引用

1. “m·w·弗格森和s•欧凯恩称无疤痕愈合:从胚胎成人治疗干预机制,“英国皇家学会哲学学报B生物科学,卷359,不。1445年,第850 - 839页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. j·古德温,d . Kuraitis和n .罗森塔尔细胞外,“无疤痕修复和再生矩阵注意事项:见解从再生多样性在脊椎动物中,“国际生物化学与细胞生物学杂志》上卷,56 47-55,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. g . c . Gurtner r·h·Dauskardt v . w . Wong et al .,“改善皮肤疤痕形成通过控制机械环境:大型动物和第一阶段研究,“年报的手术,卷254,不。2、217 - 225年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. p . Montanucci g . Basta t·佩斯卡拉Pennoni, f . Di Giovanni和r . Calafiore”和快速简便的新方法净化间充质干细胞的人类脐带沃顿胶”组织工程部分,17卷,不。21 - 22日举行,2651 - 2661年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. m . f . Pittenger a . m .麦凯s c·贝克et al .,“Multilineage成年人类间充质干细胞的潜力。”科学,卷284,不。5411年,第147 - 143页,1999年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. 陆j .江m . Au k . et al .,“分泌胰岛素的胰岛代集群从人类胚胎干细胞”干细胞,25卷,不。8,1940 - 1953年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. c . Ganta d . Chiyo r . Ayuzawa et al .,”老鼠脐带干细胞完全废除鼠乳腺癌转移或复发的没有证据post-tumor细胞接种,100天”癌症研究,卷69,不。5,1815 - 1820年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. 巴塞洛缪,c .鲟鱼,m . Siatskas et al .,“间充质干细胞在体外抑制淋巴细胞增殖,延长皮肤移植体内生存,”实验血液学,30卷,不。1,42-48,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. m . Di尼古拉·c . Carlo-Stella m·马尼et al .,“人类骨髓基质细胞抑制t淋巴球增生引起的细胞或非特异性促有丝分裂的刺激,“血,卷99,不。10日,3838 - 3843年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. a . Alunno p . Montanucci o . Bistoni et al .,“体外免疫调节的影响microencapsulated脐带沃顿jelly-derived间充质干细胞在原发性干燥综合征”风湿病学,54卷,不。1,第168 - 163页,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 佐藤k, k . Ozaki i哦et al .,“一氧化氮起着至关重要的作用在抑制t细胞增殖的间充质干细胞,”血,卷109,不。1,第234 - 228页,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. f . Djouad l . m . Charbonnier c Bouffi et al .,“间充质干细胞通过interleukin-6-dependent抑制树突状细胞的分化机制,“干细胞,25卷,不。8,2025 - 2032年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. 英国英语,f·p·巴里,c·p·Field-Corbett b . p .马洪,“干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α不同调节小鼠间充质干细胞免疫调节的。”免疫学的信,卷110,不。2、91 - 100年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. 任g . g .徐l . Zhang et al .,“克隆骨髓间充质干细胞的免疫抑制特性,”细胞研究,17卷,不。3、240 - 248年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. g .拉罗卡s Corrao m . Lo Iacono t . Corsello f .淀粉和r . Anzalone”小说表达的免疫调节标记人类WJ-MSC:再生和修复医学的最新综述,”开放的组织工程和再生医学》杂志上,5卷,不。1、58、2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. z Selmani, a·纳吉·i Zidi et al .,“人类白细胞antigen-G5需要由人类间充质干细胞分泌抑制T淋巴细胞和自然杀伤细胞功能和诱导CD4⁺CD25^高FOXP3⁺调节性T细胞,”干细胞,26卷,不。1,第222 - 212页,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. p . Montanucci a . Alunno g . Basta et al .,”t细胞恢复路径替换的1型糖尿病患者microencapsulated人类脐带沃顿jelly-derived:间充质干细胞的体外研究中,“临床免疫学,卷163,41,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. 诉Reyhani, p . Seddigh b .连r . Gustafsson l·拉斯克和k·鲁宾,“纤维蛋白与胶原蛋白结合,提供了一个桥梁αVβ3 integrin-dependent胶原凝胶收缩。”生物化学杂志,卷462,不。1,第123 - 113页,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. 美国Ud-Din、s w·沃尔克和a .到了“再生愈合,无疤痕愈合和疤痕形成物种:当前概念和未来的观点,“实验皮肤病学,23卷,不。9日,第619 - 615页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. r·小川,该案k . f . Tokumura et al .,”之间的关系皮肤拉伸/收缩和病理性瘢痕:瘢痕疙瘩一代机械力量的重要作用,“伤口修复和再生,20卷,不。2、149 - 157年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. e . Willems l . Leyns, j . Vandesompele“标准化实时PCR基因表达数据的独立的生物复制,”分析生物化学,卷379,不。1,第129 - 127页,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. d·惠兰n . m . Caplice, a . j .三叶草”纤维蛋白作为输送系统在伤口愈合组织工程应用中,“《控释卷,196年,页1 - 8,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. j.y.谢长廷,t·d·史密斯,v . s .梅丽莎,t . n . Tran e . l . Botvinick和w·f·刘,“微分调节巨噬细胞炎症激活纤维蛋白和纤维蛋白原,“Acta Biomaterialia卷,47岁,14 - 24,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. A . Skardal美国诉墨菲,k . Crowell d·马克安东尼,和美国索克,”可调水凝胶系统长期释放细胞分泌细胞因子和打印原位伤口细胞交付。”《生物医学材料研究:B部分应用生物材料,卷105,不。7,1986 - 2000年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. a . Rostamzadeh m . Anjomshoa s库尔德人et al .,”沃顿商学院的果冻的角色间充质干细胞在皮肤重建,”皮肤和干细胞》杂志上,卷2,不。2篇文章e30347 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. a . Krasnodembskaya y的歌,x方et al .,“人类间充质干细胞介导的抗菌效应分泌的抗菌肽LL-37一部分,”干细胞,28卷,不。12日,第2238 - 2229页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. 拉里贾尼,a . Ghahari g·l·沃诺克et al .,“人类胎儿皮肤成纤维细胞:非常有力和外源的候选治疗糖尿病伤口,“医学假说,卷84,不。6,577 - 579年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. t . Zuliani s Saiagh a . c . Knol j . Esbelin和b . Dreno“胎儿成纤维细胞和角质细胞对同种异体细胞伤口治疗免疫抑制特性,”《公共科学图书馆•综合》,8卷,不。7篇文章e70408 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. g . Majno g . Gabbiani, b . j . Hirschel“收缩肉芽组织体外:平滑肌相似,“科学,卷173,不。3996年,第550 - 548页,1971年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. a . m .霍金和n s纪伯伦:间充质干细胞旁分泌信号和分化在皮肤伤口修复,”实验细胞研究,卷316,不。14日,第2219 - 2213页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. a . n .史密斯、e·威利斯和v . t . Chan“间充质干细胞诱导真皮成纤维细胞对损伤的反应,”实验细胞研究,卷316,不。1,48-54,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. m . j . Regulski炎症的“间充质干细胞:“监护人”、“伤口卷,29号1日相较2017页。视图:谷歌学术搜索
33. k·j·罗尔夫和A·o . 10“胎儿无疤愈合的审查,”ISRN皮肤病ID 698034条,卷。2012年,9页,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. 陈x, e·m·惠特尼郑胜耀高,和v . w .杨“转录剖析Kruppel-like因子4显示一个函数在细胞周期调控和上皮分化,“分子生物学杂志,卷326,不。3、665 - 677年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. s .马克松e·a·洛佩兹,d . Yoo a . Danilkovitch-Miagkova和m . a . Leroux“间充质干细胞在创伤修复中的作用。”干细胞转化医学,1卷,不。2、142 - 149年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. m . v . Plikus c . f . Guerrero-Juarez m . Ito et al .,“脂肪细胞的再生myofibroblasts伤口愈合期间,“科学,卷355,不。6326年,第752 - 748页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2017 Pia Montanucci et al。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。