文摘

间充质干细胞已确定滑液的几个物种。本研究进行了描述chondroprogenitor (CP)马滑液细胞(SF)和决定的影响纤维母细胞生长因子2 (FGF-2) SF-CP单层核扩散和随后的软骨形成。我们假设FGF-2刺激SF-CP核扩散和postexpansion软骨形成。科幻吸入收集从成年马关节。克隆形成单位(CFU)分析中主要的文化。起初,SF-cells被播种在低密度,有或没有FGF-2。单层扩张和串行immunophenotyping后,细胞被转移到chondrogenic小球的文化。分析了颗粒chondrogenic mRNA表达和软骨基质分泌。有一个平均的59.2 CFU /毫升的科幻小说。FGF-2增加人口倍增的数量在两个单层段落和一半人口翻倍。 FGF-2 did not alter the immunophenotype of SF-CPs during monolayer expansion, nor did FGF-2 compromise chondrogenesis. Hypertrophic phenotypic markers were not expressed in control or FGF-2 groups. FGF-2 did prevent the development of a “fibroblastic” cell layer around pellet periphery. FGF-2 significantly accelerates in vitro SF-CP expansion, the major hurdle to clinical application of this cell population, without detrimentally affecting subsequent chondrogenic capacity.

1。介绍

关节软骨是一个高度专业化的结缔组织,负责均衡负载在关节表面和减少摩擦在关节运动。软骨是一种alymphatic、股骨头,aneural组织,细胞密度相对较低。这些特点限制了内在修复关节软骨的能力(1]。目前手术治疗关节软骨损伤(2- - - - - -4)不可靠地恢复功能和表型稳定的软骨基质。此外,体外软骨细胞的扩张,再植术成软骨病变之前,妥协这些细胞的特殊表型(5,6]。

间充质干细胞(msc)代表一个有前途的替代资源软骨修复,考虑到他们chondrogenic潜力,大量增殖能力扩张,易于访问和免疫原性属性。大部分的初始研究干细胞软骨形成进行了使用骨骨髓来源干细胞(7,8),但现在认识到,祖细胞存在于大多数组织和体液,尽管非常低的数字,这些祖细胞数量的chondrogenic能力相差很大(9- - - - - -14]。大部分的MSC在肥厚性高潮的人群进行软骨形成表型(8,10,15- - - - - -17),不是最优关节软骨修复。

最近的一些研究,利用滑液吸入物从一系列物种已经证明,祖细胞可以从滑液分离(SF-CP),扩大体外(18- - - - - -22)和适当的培养条件下,诱导表达nonhypertrophic chondrogenic更符合关节软骨细胞表型特征(19,23- - - - - -26]。一致,SF-CP浓度增加关节炎的条件(18- - - - - -22),这表明这些细胞的作用在宿主反应联合创伤和/或变性。接受他们的表型适用性,这些细胞的数量非常低的滑液(19,22,23,26和内在限制扩散20.,27)代表主要障碍的潜在临床应用SF-CPs [20.,28,29日]。

纤维母细胞生长因子2 (FGF-2),也称为碱性纤维母细胞生长因子,是一种有效的促分裂原在许多细胞类型和也增加软骨形成和软骨基质形成一些祖人口(30.- - - - - -32]。本研究的目的是确定FGF-2马SF-CP单层扩张的影响和随后chondrogenic分化。我们假设FGF-2将刺激SF-CP扩散和提高postexpansion软骨形成。

2。材料和方法

2.1。集合

这个研究与伊利诺伊大学的IACUC的批准。滑液样本收集无菌tibiotarsal或metacarpotarsophalangeal关节的成年马(18标准竞赛用马,两个纯种动物,七季马)。有15个小姑娘们晃动着/母马,四/公马,和8个阉,年龄2 - 4年。滑液吸入物收集立即切除骨软骨病变的关节镜前。骨关节炎的关节有最小的临床或关节镜证据。

2.2。细胞培养

2毫升的滑液镀在10毫升的低糖杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)补充10%胎牛血清,100 U的青霉素钠/毫升,100μ硫酸链霉素的g / mL。主要的文化在37°C 5%孵化有限公司2湿度为90%。菌落(CFU),定义为焦点的25或更多的细胞(反映四个或更多的细胞分裂),监控每道菜中第一个七天在文化和7天计算。

2.3。细胞扩张

主层融合,使胰蛋白酶化约80%计算,山肩1 104细胞/厘米2。细胞生存能力是由台盼蓝排斥。首次通过细胞生长培养基中维护(如上所述)或中等FGF-2补充100 ng / mL。在先前的研究中,发现这FGF-2剂量最佳刺激软骨形成的马骨骨髓来源msc (32]。媒介是改变每2到3天,直到80%的融合。金属堆焊持续了两个段落,为随后的软骨形成实验产生足够的细胞数量。在每个通道倍增人口计算使用以下公式:日志2(收获细胞数量/种子细胞数量)。人口翻倍在每个通道计算每个通道的时间除以人口翻倍的价值。

2.4。Immunophenotypic分析

流式细胞仪是用来评估SF-CP immunophenotype (CD29、CD44和CD90)在单层扩张,后以前公布的建议(33,34]。CD45造血祖细胞作为消极的控制。在每个通道,2 106SF-CPs resuspended在DMEM媒体有1% BSA (34]。下面的抗体被用于根据制造商的建议:反共轭anti-CD29-Alexa 488 (BioLegend,圣地亚哥,CA);anti-horse共轭anti-CD44-RPE (AbD Serotec BioRad,大力神,CA);anti-horse nonconjugated anti-CD90-Alexa 647(准确的化学和科学公司,韦斯特伯里,纽约);和反共轭anti-CD45-Alexa 488 (AbD Serotec BioRad,大力神,CA) (34]。来源于msc的骨和软骨细胞被用作生物控制。以下过滤器是用于流式细胞分析仪(Accuri C6, BD生物科学,CA)隔离共轭荧光染料的发射波长:FL-1 (510 nm和545 nm波长的光)对CD29(519海里排放)和CD45(519海里排放),FL-2 (560 - 580 nm波长)CD44(578海里排放),和FL-4 (665 - 695 nm波长)CD90排放(668海里)。发射后分析”FCS表达(流研究版),“数据表示为“比例的偏离控制抗体组。”

2.5。体外软骨形成

单层扩张后通过两个段落没有或FGF-2面前,这些细胞被使胰蛋白酶化和resuspended 5 105细胞/毫升chondrogenic介质(high-glucose glutamine-sodium pyruvate-DMEM包含5 ng TGF -β1 /毫升,37.5μg(抗坏血酸/毫升,10−76.25 M地塞米松,μ6.25 g的胰岛素/ mL,μ转铁蛋白g / mL,亚硒酸6.25 ng / mL, 300μ谷酰胺g / mL, 100 U的青霉素钠/毫升,100μ硫酸链霉素的g / mL)。五百毫升的媒介,包含2.5 105细胞,离心机在390 rfu 5分钟1.5毫升微型离心机管。微型离心机的帽管与18 g针穿刺后造粒允许气体交换。在离心管3天之后,颗粒被轻轻吸气管和转移到6 -或24-well超低附件文化板块(纽约康宁公司,康宁公司)。颗粒保持在chondrogenic媒介,改变每48 - 72小时。天10和20,每组一个代表颗粒固定在4%多聚甲醛进行组织学处理。剩下的球snap-frozen在液氮和存储−80摄氏度进行进一步的分析。

2.6。粒DNA内容

赫斯特荧光分析(35)是用来测量DNA丸的内容。三个球在250年被消化μL的木瓜蛋白酶消化(0.15毫克/毫升;σ化学MPC,圣路易斯,密苏里州)16小时在65°C。连续稀释的小牛胸腺DNA被用来生成一个标准曲线。重复10μL整除的每个样本和标准用移液器吸取到黑色96 -微型板块。赫斯特33258年荧光染料添加在每个好,光密度测量在485 nm波长(FLUOstar最适条件微型板块读者,BMG LABTECH,达勒姆,NC)。值调整为“μ克每粒DNA。”

2.7。颗粒胶原蛋白II型的内容

三个小球从每个治疗组/时间点在50消化μL pepsin-acetic酸(0.5毫克/毫升)在4°C一夜之间,连续旋转混合。后的第二天,球被转移到一个弹性蛋白酶消化解决方案(1毫克/毫升胰弹性蛋白酶1 x TBS) 24 h。商业ELISA试验是用来测量胶原蛋白II型蛋白质在每个样本,按照制造商的推荐方案(Chondrex Inc .,雷蒙德,佤邦)。简单地说,100年μL的捕获抗体的解决方案是在每个用移液器吸取96 -孔板和孵化一夜之间在4°C。第二天,井是洗前添加50μL样品消化和II型胶原蛋白的标准。孵化在室温下2小时后,检测抗体(50的解决方案μL)添加到每个好,其次是第二个孵化。链霉亲和素过氧化物酶解决方案(100μL)当时说,其次是一小时孵化。最后,100年μL的染色质稀释缓冲溶液添加到每个。经过30分钟的孵化,50μL停止解决方案(2 n硫酸)被添加到每个好,光密度测量spectrometrically在405 nm使用FLUOstar最适条件标(BMG LABTECH、杜伦、数控)。胶原蛋白II型值被转换为“μ克/粒。”

2.8。颗粒硫酸粘多糖含量

二甲亚甲蓝染色法(DMMB)分析方法被用来衡量硫酸粘多糖(sGAG)颗粒(36]。三个小球从每个/时间治疗组在250年被消化μL(0.15毫克/毫升木瓜蛋白酶消化缓冲区(σ化学MPC,圣路易斯,密苏里州)一夜之间在65°C为16小时。第二天,样品消化与DNAse 37°C 20分钟。二百毫升的DMMB试剂添加到50μL消化样品的光学密度测量在530 nm (FLUOstar最适条件微型板块读者,BMG LABTECH,达勒姆,NC),连同连续稀释的硫酸软骨素的标准。“sGAG”值被表示为“μg sGAG /丸。”

2.9。RNA隔离、反转录PCR扩增

总RNA提取使用商业胍盐thiocyanate-phenol试剂(试剂盒,英杰公司Corp .)、生活技术,大岛,纽约),遵循制造商的指示。分离纯化在二氧化硅列(RNeasy试剂盒Inc .)、希尔登,德国)。一微克的总RNA从每个样本reverse-transcribed(上标二世,英杰公司Corp .)、生活技术,大岛,纽约),使用标准的协议和oligo-dT引物。

aggrecan Gene-specific引物对胶原蛋白II型,碱性磷酸酶(ALP)、胶原类型X, Sox9, Mef2C和Runx2(表1)被设计使用ClustalW从可用的序列发表在基因库和多重序列比对(可用http://www.ebi.ac.uk/)和引物3软件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。证实了引物特异性融化曲线特异性和克隆和测序扩增子在优化实验。PCR扩增被聚合催化DNA聚合酶(BioRad iCycler, BioRad实验室、大力神,CA)在Sybr绿色。相对基因表达是量化的使用 方法(37为放大效率),纠正,标准化的参考基因的表达,伸长因子- 1α(EF1α)。

表1
引物用于qPCR反应。
2.10。组织学检查

一个代表颗粒/时间从每个治疗组在4%多聚甲醛固定24小时。球被固定在磁带使用HistoGel (richard allan科学、二、PA),转移到PBS溶液,并存储在4°C。球是在酒精脱水,嵌入在石蜡,切割8点μ米,并与甲苯胺蓝染色。组织学图像获得使用20和40 x目标,利用Nanozoomer 2.0 HT数字病理系统机(滨松光学株式会社日本滨松)。

2.11。统计分析

常态分布的量化数据(单层增殖,颗粒DNA含量、颗粒sGAG内容,小球胶原蛋白II型的内容,和相对mRNA表达)是使用Shapiro-Wilk测试证实,贝尔直方图,正常qq情节(IBM SPSS统计)。数据被表示为”的意思 标准差。“成对的学生的 测试是用来评估FGF-2人口增加和人口增加的影响。双向重复测量方差分析是用来评估FGF-2跨越时间对细胞增殖的影响,颗粒DNA含量、颗粒sGAG内容,小球胶原蛋白II型的内容,和相对mRNA的表达。一个 值≤0.05被认为是显著的。

3所示。结果与讨论

3.1。结果
3.1.1。细胞扩张

平均有59.2 cfu /毫升的滑液(范围25.2 - -178.7 cfu /毫升; 在吸入的主要文化。之间的时间的初始播种送气和near-confluence主要文化是17.1 5.2天。补充媒体FGF-2显著增加在第一(2.59人口翻了一番 1.29和3.34控制文化 1.43 FGF-2文化; , (1.86)和第二 1.13和2.53控制文化 0.93 FGF-2文化; , ;图1(一))的段落。接受响应的变化,这是一个近似FGF-2细胞数增加1.6倍反应在两个段落。FGF-2也显著降低人口翻倍(图1 (b))。在第一段,控制文化需要5.6 3.60天为每个人口翻倍,而文化对待FGF-2需要大约一半(2.88 1.93天; , )。在第二段,意味着人口倍增时间控制文化增加到10.25 + 9.25天。再次,FGF-2政府倍增时间减少了约50%(4.48±3.42天)在第二段的文化。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
FGF-2补充对SF-CP扩散的影响。人口倍增(a)和(b)人口翻倍(PD),在第一次(P1)和第二次(P2)段落,没有酒吧(白色)或存在(黑条)FGF-2(平均数±标准差; )。在这两个数字,星号显示显著差异之间的控制和FGF-treated文化在每个通道。
3.1.2。Immunophenotypic分析

SF-CPs immunopositive了三个细胞表面标记CD29、CD44, CD90描述马msc (33,34CD45)和消极的造血标记。FGF-2政府期间不影响immunophenotype SF-CPs单层扩张(图2)。进一步,immunophenotype SF-CPs在两组的段落没有明显变化。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
SF-CP immunophenotype鉴定。(一)代表immune-phenotypic概要文件的1 SF-CPs(马2),与FGF-2补充。(b) Immunophenotypic特性(均值±SD)的SF-CPs通道0,1和2,以及骨髓(BM) msc和软骨细胞控制人口( )。
3.1.3。粒DNA内容

单层的扩张SF-CPs FGF-2没有存在的重大“延续”效应的DNA含量chondrogenic小球在时间点(图3; ; )。在控制和FGF-2丸,DNA含量稳定在大约3μ克/粒在整个时间的实验。


图3
DNA内容(μ10和20克/粒)天chondrogenic文化,与(白色)或没有(黑)FGF-2补充( )。
3.1.4。Chondrogenic基因表达

FGF-2显著增加Sox9 mRNA表达在20天(1.5水平 控制颗粒与3.5中增加0.6倍 增加1.05倍FGF-2丸, ;图4(一)),但没有影响转录因子的表达Runx2和Mef2c(数字4 (b)和4 (c)肥厚性分化(所需),38- - - - - -41]。FGF-2增加胶原蛋白II型mRNA水平2-3-fold 10天(10.8±13倍增加控制球和31.3 39倍增加FGF-2丸)和20天(18.9 控制颗粒与36.6中增加20.7倍 增加40.7倍FGF-2颗粒);然而这些差异没有统计学意义,由于高interdonor可变性(图5(一个))。稳态aggrecan mRNA水平增加约500倍的第十天在控制(458±765倍增加)和FGF-2(473±726倍增加)组、未分化SF-CPs相比,这upregulation持续20天。FGF-2 aggrecan表达式(图上没有显著的影响5 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图4
Runx2 Sox9 (a) (b),和Mef2c (c) mRNA表达(成倍增加)天10和20 chondrogenic文化(白色)或没有(黑)FGF-2补充( ;3;3)。
(一)
(一)
(b)
(b)
图5
胶原蛋白II型(a)和aggrecan (b) mRNA表达(成倍增加)天10和20 chondrogenic文化(白色)或没有(黑)FGF-2补充( ;5)。

胶原蛋白类型X和高山转录水平极低的颗粒实验(阈值周期通常是8 - 10高于细胞群肥厚性分化的能力;数据6(一)和6 (b))。在控制球,胶原蛋白类型X转录水平下降在20天文化时期在10天(0.63±0.81倍和0.37±0.36倍20天),而高山mRNA水平仅略有增加10天(25.3±42.67,29.3±38.33 20天)。FGF-2不会大幅改变X型胶原的表达在10天(0.33±0.43倍和0.25±0.20倍20天)或高山10天(28.0±42.67倍和39.33±66.67倍20天),与Mef2c和Runx2的结果一致。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
X型胶原(a)和高山(b) mRNA表达(成倍增加)天10和20 chondrogenic文化(白色)或没有(黑)FGF-2补充( ;5)。
3.1.5。粒矩阵内容

FGF-2政府并不影响胶原蛋白II型蛋白质(10:天0.20±0.04μ克/粒控制球和0.19±0.06μ克/粒FGF-2丸;在20天:0.22±0.02μ克/粒控制球和0.23±0.01μ克/粒FGF-2丸)或sGAG(10:天12.8±4.5μ克/粒控制球和10.9±1.8μ克/粒FGF-2丸;在20天:14.5±5.7μ克/粒控制FGF-2丸丸和12.65±4.7)内容在球时间点(数据7(一)和7 (b)),与qPCR结果一致。

(一)
(一)
(b)
(b)
图7
胶原蛋白II型(a)和sGAG (b)蛋白质含量(μ10和20克/粒)天chondrogenic文化(白色)或没有(黑)FGF-2补充( )。
3.1.6。颗粒组织学

甲苯胺蓝染色强度,反映了sGAG内容,并不影响FGF-2政府在单层扩张。整体颗粒大小也没有改变。引人注目,然而,FGF-2补充预防的发展一个扁平的“成纤维细胞的细胞层,100年占领外围μ控制颗粒(图8)。没有迹象表明中央肥厚性分化的两组,与qPCR数据一致。

(一)
(一)
(b)
(b)
图8
在20天组织学部分chondrogenic丸。球从细胞扩大控制介质(a)或中等补充FGF-2 (b)与甲苯胺蓝染色。
3.2。讨论

符合我们之前的研究(26)和其他几个团体报道(18- - - - - -25),马SF-CPs能够相当大的体外增殖(图1)和随后的chondrogenic分化(数字7和8)。有相当数量的变化cfu /毫升的滑液和建立所需的时间主要SF-CP文化。这些结果是一致的与其他报告19,20.,22),有可能影响克隆细胞群体的初始分布不均在板的表面和在当地细胞密度随之变化。根据这一点,“80%融合”指定为主要文化段落应该考虑一个名义值。

单层扩张中补充了FGF-2显著增加人口翻倍,一半人口在段落翻倍。在这方面,假设解决FGF-2对SF-CP扩散的影响被接受。这种有效的促有丝分裂的效应也被报道在一些先前的研究在人类骨骨髓来源干细胞(30.,42- - - - - -45)与2-3-fold增加扩散率报告。FGF-2发挥其促有丝分裂的影响通过MAPK信号通路(30.,42,46],加快交通通过细胞周期G1期(47]。的增殖活动控制文化在通道2明显小于在通道1,反映在减少人口倍增和增加两倍PD(图1)。尽管所有的控制文化达到融合在P2,这些结果表明,控制文化接近衰老。增生性的失败是由Kurose et al ., 2010年6 25人膝OA患者滑液样本(20.]。FGF-2补充减缓衰老的发展增生骨骨髓来源干细胞的数量(48- - - - - -50),很有可能从滑液同样FGF-2祖细胞的影响。集体,在通过倍增增加人口,人口翻倍刺激减少了FGF-2减轻SF-CPs的主要障碍使用潜在的临床应用,如内在软骨修复,组织工程软骨,类风湿性关节炎的免疫调节20.,28,29日]。

接受物种差异immunoprofiles祖细胞,细胞表面标记资料从马SF-CPs与其他研究结果一致(20.,27- - - - - -29日)和马msc的特征(CD90 + + CD29、CD44 +, CD45−;(33,34])。FGF-2对SF-CP扩散的影响没有负面影响的immunophenotype扩大细胞群。特别感兴趣的,这些干细胞标记的相对表达在多个段落没有明显变化,表明没有发生“浓缩”过程通过选择性抑制细胞增殖。相反,immunophenotypic段落一致性表明SF-CPs从事人口膨胀的主要细胞类型在主文化和随后的段落。

FGF-2政府在单层扩张并未产生负面影响后续SF-CP软骨形成,尽管长期扩张的报道不利影响MSC chondrogenic能力(42)和更一般的“去分化”效应延长单层扩张施加在chondrocytic表型(5,6]。FGF-2增加稳态chondrogenic转录因子mRNA水平,Sox9, 20天,胶原蛋白II型和aggrecan成绩单也增加了FGF-2,虽然没有统计上显著的程度。尽管这些影响,FGF政府并没有改变胶原蛋白II型蛋白质或sGAG沉积颗粒内矩阵。根据这些结果,假设解决FGF-2影响SF-CP软骨形成将被拒绝。转录和转译生产力之间的这种“断开”是一种常见的观察干细胞/组织工程生物和表明新体外分化msc的生物合成能力不匹配的完全分化的细胞群(42,51]。这种限制将需要解决干细胞在组织工程应用中成功应用。

尽管没有量化影响软骨基质生产、FGF-2明显改善的组织学特征和细胞形态学chondrogenic丸,防止一个区域的发展在颗粒表面扁平细胞,大约100μ米深(图8)。这周边区域被夷为平地的“肉瘤”或“perichondral”细胞是一致的特征,MSC, chondrocytic颗粒文化模型(6,29日,30.,32,42,52),是更大的比成熟关节软骨的扁平的表面区域(53]。没有这个特性的颗粒FGF-treated SF-CPs表明扩张FGF-2生成一个表型的存在扩大人口同质性,不存在人口扩大在单独的边后卫。

Chondrogenic马SF-CPs不表达肥厚性chondrocytic标记(胶原蛋白类型X或高山)控制培养条件,和FGF-supplementation并不影响。阈值周期中这些基因SF-CP样本通常8至10个周期(2 - 3日志)高于阈值细胞群(如生长板软骨细胞和骨骨髓来源msc)经历强劲肥大(数据没有显示)。这种“nonhypertrophic”表型都让人觉得SF-CPs关节软骨修复应用程序的使用,由于表型远比与其他MSC近源相匹配。

的来源(s) SF-CPs尚未完全确定。Chondroprogenitors存在于软骨下骨髓腔室,在适当的病理条件下(54),迁移到有原纤维的软骨和关节空间。然而,没有明显的关节炎关节的变化在这项研究中,使用的马和增加数量的SF-CPs发现疾病早期关节炎滑膜液的情况下在人18),之前的发展明显的软骨纤维性颤动或渗透到软骨下骨的空间。比较基因表达分析由Morito et al ., 200821由漫画家关谷神奇,et al ., 201222),强烈建议SF-CPs来自滑膜,而不是骨髓腔室,并发现这种可能性还支持的琼斯et al ., 200818),滑液的数量cfu与微观滑膜组织碎片的患病率在流体吸入物、和Zhang et al ., 2004年,世卫组织表明,滑液包含从骨关节炎滑膜中招募干细胞趋化因子(55]。在严重病理关节滑液的祖细胞可能来源于几个内部和periarticular组织来源,滑膜(21,22,57),软骨下骨空间(54),和关节软骨本身55,56]。未来的研究应该关注识别SF-CPs的来源和发展策略来利用这些细胞支持关节软骨内稳态和修复。

4所示。结论

FGF-2显著增加SF-CPs体外扩张,大大增加人口倍增和减少人口翻倍。FGF-2并不影响期间immunophenotype SF-CPs扩张或妥协后续SF-CP软骨形成。FGF-2并防止夷为平地的发展“成纤维细胞的细胞层的外围球表明扩大细胞群的表型同质性。FGF-2补充SF-CP单层文化的显著加速人口膨胀之前,随后对关节软骨修复的临床应用。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

这项研究是由美国农业部第1433条动物卫生和疾病的计划。