文摘

人类多能干细胞——(hPSCs)派生的肝细胞有可能取代许多肝模型在药物发现和再生医学应用程序提供细胞来源。然而,一代的全功能hPSC-derived肝细胞仍然是一个挑战。对获得更好的理解分化和成熟的过程,我们使用一个标准化的协议来区分六hPSC行成肝细胞和调查的同步性hPSC行通过应用RT-qPCR评估lineage-specific基因的表达(OCT4、NANOG T, SOX17、趋化因子受体CXCR4 CER1, HHEX, TBX3, PROX1, HNF6,法新社,HNF4a, KRT18,铝青铜,体,CYP3A4),为不同发展阶段在肝脏作为标记。数据评估使用相关分析和聚类分析,证明这些标记物的表达高度同步和相关所有的细胞系。分析还显示一个分布的标记组反映肝细胞的发育阶段。分化细胞的功能分析进一步证实了他们的肝表型。总的来说,这些结果表明,在分子水平上,跨多个hPSC线高度同步的分化模式。此外,这项研究提供了额外的理解为未来努力改善hPSC-derived肝细胞的功能,从而增加相关模型的价值。

1。介绍

临床相关的一代在体外肝细胞实验模型是具有挑战性的自模型反映了不同的属性和功能在活的有机体内同行(1]。目前,人类肝脏分离出的主要细胞被认为是最好的在体外肝细胞模型(2]。然而,这些细胞仍有一些局限性,如短缺在可用性、快速隔离后,表型变化在体外操作包括减少肝酶的功能,寿命短,大量的个人间的变化,以及缺乏胆汁集合(2- - - - - -4]。因此,追求更好的候选模型的强烈动机。在这方面,人类多能干细胞(hPSCs),以他们独特的自我更新和分化的能力,可以提供一个有吸引力的选择。这些细胞构成一个优秀的人类细胞来源用于基础研究和药物发现,也可能在未来再生医学和细胞疗法的应用。此外,人类诱导多能干细胞的使用(hiPSCs)干细胞来源于重编程体细胞,使疾病模型的发展和个人间多样性在安全药理学和毒理学的研究5,6]。然而,为了充分意识到这些细胞的巨大潜力,健壮的差异化协议必须保证重现性和重演的成熟肝细胞功能在最后人口(7]。最近的报告确实证明有效hPSCs分化为肝细胞,分享他们的许多特征在活的有机体内同行,包括肝标记和基因的表达参与药物代谢和运输(8- - - - - -11]。此外,细胞显示能够准确预测和分类各种化合物的毒性6,12]。

尽管hPSC-differentiation令人鼓舞的结果,建立在活的有机体内式的功能在体外派生的肝细胞仍未实现,主要是由于受损的关键基因的表达,这是细胞的代谢功能的关键,一个限制,抑制他们的效用在某些应用程序中治疗和药物发现5]。最近,莉莲和同事报告标准化协议从面板生成同质hepatocyte-like细胞培养hPSC线,显示代谢多样性的个体内的变化在人口中找到。的大量研究显示显著的相似性细胞系还可变性分析肝酶活性包括CYP1A CYP2C9, CYP2D6, CYP3A [13]。之前报道的大多数协议区分hPSCs hepatocyte-like细胞概括肝脏发展,分化细胞在哪里第一次明确的内胚层(DE),随后hepatoblast(肝祖,引起肝细胞和胆管细胞)最后hepatocyte-like细胞(7,13- - - - - -15]。肝细胞的生长和分化过程中胚胎肝脏器官发生是高度同步(16]。然而,从多个hPSC生物复制行是否通过一个同步在体外肝细胞分化过程没有被彻底调查。同步性占差异化协议的健壮性概括肝脏器官形成在体外,因此生物复制起始时间不同的发展阶段应该是一致的。

在这项研究中,我们调查了一组选定的lineage-specific基因的表达在分化六hPSC线,包括三个hESC和三个hiPSC线,hepatocyte-like细胞应用协议进一步发展过程中报道了莉莲和同事(13]。16个关键基因分析逆转录定量实时PCR (RT-qPCR):OCT4和NANOG多能标记;T(Brachyury)原条标记;趋化因子受体CXCR4, SOX17,CER1明确的内胚层标记;HHEX腹侧前肠内胚层标记(17];PROX1, TBX3,HNF6hepatoblast标记;法新社胎儿肝细胞标记;和HNF4A(HNF4a),CYP3A4,SERPINA1(AAT),铝青铜(白蛋白),KRT18(CK18)肝标记(14]。RT-qPCR结果用斯皮尔曼等级相关的统计分析。聚类分析也执行基于基因表达值。这里给出的结果显示高度同步和相关基因表达谱在六个细胞系。此外,成熟的hepatocytes-like细胞的功能是通过测量证实的药物代谢活动细胞色素P450 (CYP) CYP1A酶,CYP3A, CYP2C9, CYP2D6、CYP2C19。此外,这些细胞有能力储存糖原和他们表达药物转运蛋白MRP2, OATP1B1 NTCP, BSEP。有趣的是,hESC或hiPSC行没有任何模式表明任何特定的相互关联。此外,聚类分析显示lineage-specific标记组的分布,反映了肝细胞的分化阶段。

2。材料和方法

2.1。人类多能干细胞文化和分化

在这项研究中使用的所有hPSC行是XY,由豆类Clontech (http://www.clontech.com)。这些细胞被解冻、维护和通道的feeder-free Cellartis DEF-CS培养系统(豆类Clontech)根据制造商的建议。细胞系是用于后续分化实验在以下段落:Cellartis SA121 p。10日,Cellartis SA181 p。11,Cellartis ChiPSC6b p.16, Cellartis AS034 p.10, Cellartis P11012 p.18, and Cellartis P11025 p.21. (Throughout this paper, the cell lines are referred to with their short names: SA121, SA181, ChiPSC6b, AS034, P11012, and P11025, resp.).

hPSCs被分化成明确的内胚层(DE)细胞通过应用Cellartis DE分化工具包(豆类Clontech)根据制造商的建议。

在第七天,细胞收获根据制造商的建议和分化成hepatocyte-like细胞应用的原型Cellartis玫瑰分化工具包(根据客户要求提供从豆类Clontech)如图1。

2.2。RNA提取和实时定量聚合酶链反应

细胞样本收集每日在执行中改变之前(如果介质改变原定)在分化过程中,保存在RNAprotect细胞试剂(猫。数量76526,试剂盒)−20°C。使用magmax - 96总RNA提取RNA隔离设备(猫。AM1830数量,通过使用GeneQuantpro分光光度计生命技术)和量化。八十ng RNA的每个样本被用来合成cDNA应用iScript cDNA合成工具包(猫。数量170 - 8890,BIO-RAD)。

TaqMan快速先进的主混合(猫。数量4444557,生活技术)和TaqMan基因表达分析被用于RT-qPCR。表1总结了使用化验和哪一天他们被应用。每个反应包括1.6 ng cDNA,在重复运行。CREBBP被用来作为参考基因和内部校准器是用于样本归一化13]。hepatoblast、胎儿和成熟肝细胞标记RNA的新鲜分离人类原发性肝细胞从5个不同的捐赠者是用作校准器。Interplate控件添加板块正常化。

量化的不同周期(②)和相对量化计算根据以下公式:

2.3。基因表达数据的统计分析

每个基因的表达数据由一个矩阵中移动值,代表了六个细胞系和代表了天的特定基因表达测定。对于每一个基因,每一对细胞系的中移动向量进行测试对于使用斯皮尔曼等级相关的协会,这是一个非参数检验,对极端值不敏感,可用于检测非线性关系(18]。相关系数是解释根据规模在0.8 - -1.0被定义为“很强,”0.6 - -0.8 0.4 - -0.6“强劲,”“温和”,0.2 - -0.4一样“疲弱,”和0.0 - -0.2“很弱”或“没有关联”。

聚类分析的矩阵取而代之的是矢量中值(中移动),每个值中值为某一天所有六个细胞系。这些RQ向量组,代表不同的基因组合,分层次集群与HCL算法软件v4.9 MultiExperiment查看器(http://www.tm4.org/mev.html),用斯皮尔曼等级相关作为相似性度量和完整的链接链接规则。

2.4。免疫细胞化学

天0、5、7、14日,24日,25日,29日和30的分化,细胞被洗DPBS(+ / +)(猫。数量14040,生活技术孵化为10分钟)和固定的4%甲醛(猫。Histolab数02176年,西Frolunda,瑞典)然后在DPBS清洗和维护(+ / +),直到处理。TNB-blocking缓冲区是通过混合0.1米三(猫准备的。10421 - 1,科博实验室AB)调整与盐酸36.5% - -38%(猫。H1758数量,σ)pH值7.5和0.15 M氯化钠(猫。dH S5886数量,σ)₂o .阻止试剂珀金埃尔默TSA-kit(猫。FP1012数量,珀金埃尔默)慢慢加入Tris-HCl /生理盐水缓冲在搅拌下最终的浓度0.5%;那么解决方案是加热到60°C直到阻塞试剂溶解。这些细胞被洗一次DPBS(+ / +),其次是孵化的10分钟0.3% Triton-X(猫。T8532数量,σ)DPBS(+ / +)和细胞随后被孵化TNB-blocking缓冲区1 h。主要抗体稀释DPBS Triton-X 0.1%(+ / +)被添加到文化和孵化一夜之间在4°C。第二天,这些细胞被洗了三次与DPBS (+ / +);然后二级抗体和DAPI稀释DPBS Triton-X 0.1%(+ / +)被添加和细胞培养2 h rt,最后,这些细胞被洗了三次与DPBS(+ / +)之前在荧光显微镜成像,拍照。这些照片是加工使用ImageJ软件(http://imagej.nih.gov/ij/)。表2总结了不同的初级和二级抗体应用,稀释比例,分析了各自的标记的天。

2.5。细胞色素P450 (CYP)酶活性测定

CYP3A CYP1A酶的活动,CYP2C9, CYP2C19、CYP2D6 hepatocyte-like细胞分化从本研究中使用的所有hPSC线和在人类原发性肝细胞cryoplateable从四个不同的捐助者(BioreclamationIVT,法兰克福,德国)测量与小修改(如前所述13]。简而言之,hPSC-derived hepatocyte-like细胞在肝分化和初级的29天人类肝细胞(电镀后培养总共20 h)被孵化的鸡尾酒CYP基质,10μ米非那西汀CYP1A衬底,10μM bufuralol CYP2D6衬底,10μ50 M双氯芬酸CYP2C9底物,μ米美芬妥因CYP2C19衬底,和5μ米咪达唑仑CYP3A的衬底。代谢产物的形成(扑热息痛(CYP1A) 1-OH-bufuralol (CYP2D6) 4-OH-diclofenac (CYP2C9) 4-OH-mephenytoin (CYP2C19)和3-OH-midazolam (CYP3A))是由液相色谱/质谱(LC / MS)在Pharmacelsus GmbH(德国萨尔布吕肯)。重复的样本收集每个细胞株,代谢物浓度是归一化的蛋白质数量/好,孵化时间和结果作为pmol代谢物/毫克蛋白/分钟。

2.6。PAS染色

这些细胞被固定的如上所述。不是工具包应用(395 b-1kt西格玛奥德里奇)的细胞在高碘酸孵化了15分钟在沿瓶然后用dH这些细胞被洗₂O和孵化为30分钟希夫试剂瓶在rt,随后dH的细胞被洗₂O和孵化的苏木精90秒,最后dH的细胞被洗₂O。

3所示。结果

3.1。人类PSC培养和肝分化

人类已经被培养Cellartis DEF-CS培养系统显示典型的干细胞形态学(圆形细胞大核)收获之前在天0(图2(一个))。细胞形态学改变了Cellartis DE分化工具包的应用。在第五天德的细胞显示一些形态表明,和天7细胞的形状变得更spikey或三角形,这是典型的形态达到了融合(图2(一个))。这些细胞被分离和山肩,肝细胞分化是由应用的原型Cellartis消息灵通的分化。图中描述的肝细胞分化的协议是否合法1。典型的德在应用程序消息灵通的祖细胞形态学改变介质(图2 (b)后)和消息灵通的成熟的应用中逐渐获得了肝细胞的细胞形态(图2 (c))。最后,当这些细胞被培养在消息灵通的维护中,他们获得典型的肝细胞形态学,多边形单或双核细胞观察(图2 (d))。

3.2。Lineage-Specific标记的基因表达

对于每个hPSC线,RNA是收集日常整个分化过程,随后分析使用RT-qPCR lineage-specific标记列在表中2。图3显示了早期阶段相对量化曲线标记,除了成对细胞系为每个标记关联表。多能性标记OCT4和NANOG是早期分化过程中明显表达下调;OCT4是表达低于检出限(≥35)已经在第四天NANOG在第七天。平均细胞株为这两个标记之间的两两相关系数> 0.9(图3),表示非常高的同时性细胞系在这个阶段。的表达T(Brachyury) pan-mesoderm标记表达mesendoderm前兆的中胚层和内胚层[19),峰值在第二天所有的细胞系(图4)。图5显示的标记SOX17和趋化因子受体CXCR4在第三天,这些标记的平均相关系数在第二天第十天非常高(0.85和0.98,分别地)。的表达SOX17逐渐减少,直到它低于检出限在第十天。的表达趋化因子受体CXCR4是调节,直到第五天或6天,然后表达下调,随后察觉在天9。的标记CER1已经发生在mesendoderm阶段(第二天),提前一天SOX17和趋化因子受体CXCR4,它的表达增加,直到天6之后,它开始减少,类似趋化因子受体CXCR4,它低于检出限一天9。的平均相关系数CER1很强(0.90)并没有实质性的区别CER1细胞系之间的表达式。HHEX腹侧前肠内胚层的标志,也表达了在德阶段,随后察觉在11天(除了AS034行),很强的平均相关系数为0.86,如图5。一般而言,相关分析并没有显示任何偏好hESC行相互关联而不是hiPSC行,反之亦然(数字3,4,5)。

细胞系之间的相关性对标记后阶段的阶段肝分化早期标记(数据相比略低6和7)。由于瞬态波动的RNA水平每个介质变化的天后,天8、10、12、13、15、17、19、20、22、24、26、27日,29日,31日,33和34并不包括在相关分析。的基因TBX3,HNF4a,HNF6,法新社表示已经在hepatoblast阶段。这些基因表现出基因调控同步性在所有的细胞系,如图6,平均两两相关范围从温和HNF4a(0.52)通过强有力的(0.60HNF60.63,法新社很强的(0.83TBX3)。成熟的肝细胞标记的关联范围从弱(0.38CYP3A4通过温和的(0.41)PROX10.57,AAT),强劲(0.75个KRT18和铝青铜)(图7)。尽管最弱的平均相关显示CYP3A4之间,有一些强大和很强的相关性对这个基因的细胞系,例如,0.89 ChiPSC6b和P11025之间(图7)。有趣的是,如上所述的阶段,没有偏爱hESC线相互关联而不是hiPSC在后期,同样适用于hiPSC线。不同的基因的表达谱显示轻微波动在肝分化;然而,不同的基因表达的变化发生在一般在同一时间不同的细胞系,进一步突显出同步细胞系分化过程。

3.3。采用免疫分析Lineage-Specific标记在肝分化

选择标记的蛋白表达的不同发育阶段被免疫细胞化学分析。图8显示了同质的表达多能标记Oct4 hPSCs除了缺乏分化标记SSEA-1(数字8(一个)- - - - - -8 (d)),显示的未分化状态hPSC开始分化的协议。在5至7天,所有细胞表达了DE Sox17标志和多能性标记Oct4缺席(数字8 (e)- - - - - -8 (h)和8(我)- - - - - -8(左)、职责),说明生成效率高的细胞分化工具包。

从德细胞在分化肝细胞,肝标记逐渐调节。图9显示的表达CK18、法新社和HNF4a 14天。肝标记CK18弱表达(图9(一个)),而法新社和HNF4a强烈表达在大多数细胞(数字9 (b)和9 (c)、职责)。

在25天,差异化发展和更成熟的肝细胞标记在细胞中都有表达。图10 ()显示CK18的表达,这是非常密集的25天超过14天。HNF4a仍处于相似水平表达一天24天14(图10 (b))。Coexpression铝青铜和法新社25日被发现在某些hepatocyte-like细胞;然而,细胞培养是异构的,因为在某些细胞只法新社表示,这表明fetal-like表型(图10 (c))。

在29天,法新社的表情仍是目前虽然低于25天。在这个阶段,细胞仍异构与大约50%的细胞表达只有铝青铜和剩下的50% coexpressing法新社和铝青铜(图(11日))指示的不成熟细胞。Coexpression AAT,法新社也发现(图11 (b));然而,仍有一些细胞只表达了法新社。在30天,成熟的肝标记表示,如CYP3A4(图12(一个));然而,并不是所有的细胞都是immunopositive。此外,HNF4a还表现在所有hepatocyte-like细胞(图12 (b))。

图13概述了所有基因的表达模式分析在这项研究中,考虑到基因表达< 35。在肝分化不同阶段的培养介质以及天之后显示分化的启动上酒吧。多能性基因,OCT4和NANOG表示从天0和他们的表达部分重叠的阶段。的基因(Brachyury)只有在第二天表明mesendoderm阶段表达。的基因CER1和HHEX已经开始在第二天和吗趋化因子受体CXCR4和SOX17爆发出现在第三天,表明分化。祖和肝细胞标志物表达逐渐添加消息灵通的祖之后媒介。TBX3和HNF4A已经出现在第8天,一天后转向玫瑰祖中(2)。HNF6出现在第十天,胎儿肝细胞标记法新社11天。的表达PROX1和KRT18发现在15天,一天后转向消息灵通的成熟培养基基础(美联社)3 (3 bp)的补充。肝细胞成熟的标志AAT已经表达了在18天。铝青铜在场从20天,值得注意的是,几天后的消息灵通的维护媒介(4)成人酶CYP3A4表示在23天。

3.4。聚类分析

为了检测可能的coregulation和相似性分析在这项研究中除了转运蛋白基因SLC10A1(NTCP),ABCB11(BSEP),SLCO1B1(OATP1B1),ABCC2(MRP2),聚类分析的基因表达进行全局和局部肝分化为不同的间隔。基因的聚类是使用每个基因值表达式值执行在所有的细胞系,与斯皮尔曼等级相关的相似的功能。集群天0到11显示了一个清晰的分离两个集群,一个包含多能性标记,OCT4和NANOG,原条标记,另一个集群包含标记SOX17,趋化因子受体CXCR4,CER1,HHEX,腹侧前肠标记(图(14日))。基因的聚类天14 - 35的肝分化,主要分离是一个集群包含两个基因之间TBX3和法新社和第二个集群包含剩余的基因。在以后的集群,HNF4A和HNF6显然是分开subcluster包含吗PROX1,CYP3A4,铝青铜,AAT,KRT18(图14 (b))。值得注意的是,在分析天7 - 21日HNF6显然是分开所有其他基因。剩余的基因,有一个subcluster组成的HNF4A和法新社和第二个subcluster组成的TBX3,PROX1,KRT18(图14 (c))。成熟阶段(天21到35)两个主要集群,一个包含HNF4A,TBX3,法新社和其他含PROX1,AAT,HNF6,KRT18、铝青铜和CYP3A4(图14 (d))。

3.5。药物转运蛋白的基因表达和免疫细胞化学分析

确定hepatocyte-like细胞产生的不同的成熟度hPSC在这项研究中,使用RT-qPCR应用分析药物转运蛋白的表达SLC10A1(NTCP),ABCB11(BSEP),SLCO1B1(OATP1B1),ABCC2(MRP2)。图15显示个人间药物转运蛋白基因表达的变化在hepatocyte-like细胞来源于不同hPSC线(图(15日)- - - - - -15 (d))。此外,NTCP的表达(图(15日))和MRP2(图15 (b))是接近水平的人类新孤立主要肝细胞(校准器)比OATP1B1(图15 (c))和BSEP(图15 (d))。大部分的个人间的变化是观察BSEP(图15 (d)),hepatocyte-like细胞来源于AS034天34表示上级BSEP比任何其他hPSC-derived肝细胞。OATP1B1还显示高个人间变化,肝细胞来源于SA181和P11012第三天表示上级OATP1B1比观察其他细胞系。

免疫细胞化学分析证实NTCP的表达,BSEP、MRP2, OATP1B1在蛋白质水平。图16显示了NTCP OATP1B1和图的染色模式17显示BSEP的表达和MRP2。

3.6。细胞色素P450 (CYP)酶活性测定

探讨药物代谢能力,hepatocyte-like细胞和cryoplateable人类原发性肝细胞(hphep)孵化的鸡尾酒非那西汀(由CYP1A代谢),bufuralol CYP2D6(代谢),双氯芬酸(由CYP2C9代谢)、咪达唑仑(CYP3A代谢),以及美芬妥因(CYP2C19代谢)在肝分化的29天。由此产生的代谢物的浓度对乙酰氨基酚、1-OH-bufuralol 4-OH-diclofenac, 3-OH-midazolam, 4-OH-mephenytoin由液相色谱/质谱分析。代谢物浓度被规范化毫克蛋白和孵化时间。图18显示个人间的变异不同hepatocyte-like CYP酶活性的细胞产生的不同hPSC线。的活动的CYP1A hphep大约是7倍AS034-derived肝细胞(图(18日))。然而,在SA034-derived CYP3A活性的肝细胞是高于hphep(图18 (b))。hphep CYP2C9的活动是在ChiPSC6b-derived肝细胞(图4倍18 (c))。CYP2D6的活动在hPSC-derived hphep远远高于肝细胞(图18日(d))。此外,hphep CYP2C19的活动是关于ChiPSC6b-derived肝细胞(图4倍18 (e))。此外,从SA034 hepatocyte-like细胞显示高CYP1A和CYP3A活性比其他hPSC-derived肝细胞(数字(18日)和18 (b)、职责)。Hepatocyte-like细胞来源于ChiPSC6b显示更高的CYP2C9活动相比hepatocytes-like细胞来自其他细胞系(图18 (c))。这些结果说明了个人间CYP hPSC-derived肝细胞活性的变化。

3.7。PAS染色

生产和储存糖原的能力是一个函数的成熟肝细胞(11]。调查如果hPSC-derived肝细胞也有能力储存糖原PAS染色。图19显示了检测糖原存储的不是。肝细胞来自hESC(图19 (b))和hiPSC(图(19日))显示糖原存储能力。

4所示。讨论

多能干细胞的独特属性,包括他们的无限自我更新和分化能力本质上所有类型的细胞在体内,使人体细胞的一个有吸引力的来源,可以应用在各种细胞模型药物发现和未来再生医学应用(2,4,5,7,15,20.,21]。在体外肝细胞的分化,关键技术的一些属性和功能的在活的有机体内,报道了几组使用差异化协议模拟肝细胞的发展在活的有机体内(4,6- - - - - -9,15,22]。最近的一项研究报告一个标准化的肝细胞分化的协议,它不需要任何进一步的调整生产接近齐次肝细胞从一个大板不同的hPSC线(13]。在目前的研究中,我们已经分化六hPSC行成hepatocyte-like细胞进一步开发应用协议从莉莲和同事发布的过程13]。使用RT-qPCR,我们分析了几个关键的基因表达标记lineage-specific基因在肝细胞分化不同阶段的评估的同步性在体外分化的过程。此外,我们统计方法应用于数学分析和量化hPSC线之间的相关性。结果显示高度同步的基因表达谱,尤其是早期分化阶段的重要标志,因此指示的相似性在体外分化过程在活的有机体内肝脏发展。然而,弱相关的成熟肝细胞的标记CYP3A4可能是由于其高度的多态性(23]。我们还指出,hESC之间的关联模式和hiPSC线出现随机分布的,没有证据表明优惠观察特定细胞系之间的相似性。

肝干细胞的差别分化过程始于对这些标记OCT4和NANOG也聚在一起显示类似的功能,如维持多能性和两个基因确实报告来控制对方的表达(24]。NANOG集群也有T(Brachyury),NANOG据报道将启动子区域的T(25]。我们的研究结果还表明,OCT4DE细胞而察觉NANOG表达下调,但仍然存在在德低水平的阶段,也是与其他研究结果一致(26,27]。原条阶段与短峰值出现在第二天的表达T,然后察觉已经3天,与发病的表达SOX17和趋化因子受体CXCR4,表明终止mesendoderm阶段和德的起始阶段19,27]。SOX17和趋化因子受体CXCR4也聚在一起在DE阶段,预计趋化因子受体CXCR4是由SOX17(27]。CER1通常用作标记结合其他基因,因为它也表达了在中胚层28]。我们的研究结果表明,不同SOX17和趋化因子受体CXCR4爆发,CER1发生在原条,协议在活的有机体内肝脏发展(29日]。HHEX进一步促进肝分化通过终止阶段,从而启动hepatoblast分化。的发病HHEX表达式是建议阶段,发生在持续到hepatoblast阶段(30.]。我们的结果表明upregulationHHEX在终止mesendoderm及其表达式hepatoblast阶段。HHEX集群与CER1,这两个基因引起的SOX17。然而,这是不反映在我们的结果,因为CER1和HHEX之前表示SOX17。此外,HHEX需要正常的表达吗CER1,这或许可以解释这条基因的聚类SOX17和趋化因子受体CXCR4(28]。然而,的表达HHEX是在后来hepatoblast阶段终止,而在活的有机体内的表达HHEX是保持整个肝发展14]。

小RNA水平波动的观察作为一个工件在每个介质改变德后阶段,这些都是不包括在基因表达和聚类分析,因为他们会掩盖真正的影响基因表达时稳定并介绍nonrelevant噪音。的基因TBX3和HNF4A已知被表达在肝内胚层阶段(1,4,14,31日,32]。有趣的是,这些基因诱导后直接消息灵通的祖介质的应用(2)指示的效率hepatoblasts媒介在促进发展。TBX3提出了促进肝细胞分化hepatoblasts和压制cholangiocytes下调HNF6和KRT18而且促进的表达HNF4A,这是一种肝细胞的形态和功能分化的关键调节器2),通过抑制转录抑制因子HNF4A(32]。HNF6表示在hepatoblast阶段和促进对cholangiocytes hepatoblasts的分化14,32]。然而,HNF6需要合适的肝脏发展的早期阶段(33]。在年底前hepatoblast阶段,法新社检测到表达,这是一个胎儿肝细胞标记表示直到出生。随后,表达下调,但是仍然可以发现在成人肝脏处于非常低的水平(34]。我们的结果表明,法新社在一些hepatocyte-like coexpressed细胞成熟肝细胞的标记吗AAT和铝青铜hepatocyte-like成熟细胞中表达下调,然而,并不是水平低于检出限的测定(图6)。PROX1和KRT18是调节在15天(图7),后直接切换到消息灵通的成熟基础中(3美联社)和补充(3 bp)。PROX1在一起HNF6被证明是完整的肝细胞编程包括所有关键代谢功能的关键在体外(31日]。KRT18肝标记,我们观察到在hepatoblasts弱表达和调节在后期(图7),这是按照其他研究[35]。AAT发现在一天19比新鲜孤立的原发性肝细胞在低水平。铝青铜,这是一个成熟的肝细胞标记,发现在20天。这个基因也可以表达的非功能性肝细胞编程过程失败时模拟肝脏器官发生(31日]。然而,检测CYP3A4信使rna表达(图7(图)和CYP3A4 immunopositive hepatocyte-like细胞12)以及CYP活动化验结果显示比较结果cryoplateable人类原发性肝细胞(图18证实的肝脏功能生成hepatocyte-like细胞。此外,药物转运蛋白的RNA和蛋白表达MRP2, OATP1B1, BSEP、NTCP(数字16和17),以及储存糖原(图的能力19),也证明了肝细胞的功能。CYP活动的个人间变异和药物转运蛋白表达hPSC-derived肝细胞显示相似是什么通常在他们的观察在活的有机体内同行(11,13]。然而,不像在在活的有机体内肝脏发展(14),铝青铜不是在hepatoblasts发现在我们的研究中。

后来分化阶段的聚类分析揭示了集群的转变PROX1、TBX3 KRT18, HNF4A,法新社天7到21到集群HNF4A,法新社,TBX3集群,AAT, PROX1 HNF6,铝青铜,CYP3A4,KRT18在21到35天。的聚类PROX1和KRT18两天7和21之间21到35天可以解释为这两个基因的upregulation当切换到消息灵通的成熟基础中(3美联社)和补充(3 bp)。重要的是,PROX1和HNF6介绍了参与相同的基因调控网络控制肝细胞的迁移和粘连在活的有机体内(33,36]。自HNF6和KRT18都是由TBX3(32),这是合理的PROX1和KRT18参与相同的基因调控网络。HNF4a被绑定到超过40%的肝活性基因(2),其表达式已经调节在第8天,这就可以解释它的集群法新社和TBX3,也是调节早期(图13)。天21到35分布有明显的成熟肝细胞标记(铝青铜,AAT KRT18,CYP3A4)相邻簇分离标记(早些时候据法新社,TBX3)。最后,集群的HNF6与KRT18可能解释的共同监管TBX3 [32];然而,集群的铝青铜与HNF6需要进一步调查。

5。结论

区分hPSCs进入肝细胞的过程中使用本研究表明高度同步的基因表达谱的几个跨6 hPSC lineage-specific基因。比较这些数据从先前的研究结果在体外和在活的有机体内分化肝细胞显示重要的相似之处但也有差异,如coexpression的缺席PROX1和HNF6促进的感应HNF1A。此外,沉默的HHEX在早期阶段也偏离了在活的有机体内的情况。一个成功纠正这些偏差将有可能显著改善的功能在体外派生的肝细胞。此外,进一步的调查之间的交互铝青铜和HNF6也可能导致改进未来的差异化协议。综上所述,本研究增加了另一个信息的努力改善在体外基于肝分化协议,从而使hPSC-derived肝细胞模型来更广泛的实际应用。

利益冲突

作者Josefina Edsbagge和芭芭拉Kuppers-Munther是豆类生物欧洲AB的员工。作者剧中Van Giezen受雇于豆类生物欧洲AB的这项工作。

确认

这项工作是由豆类生物欧洲AB(瑞典哥德堡)和舍夫德大学的资助下瑞典,从知识基础[2012/0310]和[2013/89]。