人类多能干细胞的神经转换和模式:发展视角

文摘

重组以来的成年人类终末分化体细胞诱导多能干细胞(hiPSCs)于2007年成为现实,只有八年过去了。然而在这段相对较短的时间内,无数的实验已经彻底改变了以前的干细胞教理。的巨大承诺hiPSC再生医学技术引发了不断上升的预期从公众和科学界。为了有效地利用hiPSCs发现疾病的基本机制,必须首先理解其谱系发育神经生物学基础限制选择为了可以预见操纵细胞命运的衍生品。发育生物学的重大进展提供了一个宝贵的资源的合理化定向分化hiPSCs细胞衍生品的神经系统。在本文中,我们首先回顾核心发展概念基础神经感应为了提供上下文这样的见解如何引导简化的体外模型的神经从hiPSCs转换。然后我们讨论早期神经模式的相关因素,再借鉴来自发育神经生物学研究的知识至关重要。我们最后讨论开放这些概念相关的问题和如何解决可能加强多能干细胞在再生医学的承诺。

1。神经系统的发育起源:概述

神经发育的过程是时空监管和需要的顺序,逐步限制在细胞的命运。尽管一些细胞结构和种间差异的分子机械鼠标和男人之间确实存在,啮齿动物模型照明关键血统限制的潜在机制多种细胞类型。这些见解提供了宝贵的指导人类多能干细胞的可预见的操作(hPSCs)无数细胞命运。从次级卵母细胞的受精,细胞不对称分裂开始,按顺序给上升到2 - 4 -,然后8阶段胚叶细胞,随后发育成囊胚(图1)。Oct3/4服务维持多能性的内细胞团(ICM)胚泡。虽然在特异性因素存在种间差异,最终和植入后,原肠胚形成,3明显胚芽层出现:内胚层(内部器官的内衬),中胚层(产生骨骼、肌肉和血管),和外胚层(结果神经系统和皮肤)。数据1和2(一个)描述规范的发展过程3胚芽层。在原肠胚形成过程中,这个3 - layer结构经历了进步和刻板的形态转换。中胚层和内胚层摄取的向内和外胚层形成一个放入鞘中中央腔上皮表。外胚层的地区周围的神经板成为表皮(图2(一个))。胚胎发生的一个重要方面是发展轴的分配。“前后”可以用来指proximal-distal轴,这是基于接近未来胎盘(早期胚泡的近端杆由ectoplacental锥如图1)。后来,proximal-distal轴将成为未来rostrocaudal轴在脊椎动物。然而,“前后轴”一词有时也可指背腹侧的轴在成人状态,区别主要是基于位置的腹部(腹)而不是/脊柱(背)。因此,为便于参考本文将使用条款rostrocaudal(电阻-电容)和背腹侧的(dv)轴。

图1

老鼠胚胎的发育阶段。第一行(左到右),从次级卵母细胞分裂球发展(都有,4细胞、8和16-cell阶段)产生的早期胚泡形成滋养外胚层(细胞表达Cdx2)和细胞内细胞团(表达Oct3/4)。后,内细胞团产生的外胚层(细胞表达Oct3/4和Nanog)和内胚层(表达Oct3/4和GATA4)。第二行(从右到左),小鼠胚泡末Cdx2阳性细胞产生肿瘤外胚层和ectoplacental锥。同时,内胚层分为胚胎内胚层和胚胎外的内胚层。外胚层和胚胎外的外胚层形成一个空腔由胚胎内胚层。从胚胎内胚层远内脏内胚层形成(DVE)。第三行(左到右),DVE迁移步骤,将被称为前内脏内胚层(AVE)。最终的图像(第三行,右)显示原条的发展(中胚层细胞)在对面的(后)杆从大道注意:有两个不同类型的内胚层称为胚胎外的胚胎;这些力量不同,产生不同的细胞衍生品。 All timelines are given for mouse and human embryonic development.

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图2

神经诱导、神经胚形成和神经模式概述。(一)神经感应:neuroectoderm(神经板)分化的影响下发生了大道的中胚层细胞开始迁移方向和信封内胚层和外胚层之间的胚胎。在胚胎的远端钢管节点的发展,进一步充当“树干组织者。”(b)神经胚形成:从神经板,细胞开始扩散并陷入为了形式神经管和神经嵴来源于神经背内侧边界折叠。(c)神经模式:从神经管细胞开始分化成体细胞前脑、中脑、后脑,根据rostrocaudal轴和脊髓。所有的时间都给老鼠和人类的胚胎发育。

三个主要事件描述早期神经发育。首先,的过程神经诱导指定区域的胚胎外胚层形成神经板(图2(一个)(1])。第二,这一过程称为神经胚形成通过串行形态转换发生神经管(图2 (b);(2])。这个过程因此给予进一步组织架构发展神经轴。第三,神经管分为功能和空间不同区域的项目叫做感应互动神经模式(图2 (c)(3])。在人类中,神经胚形成发生在怀孕后21天,取决于一个精确的三维形状的变化序列的单个细胞,包括信息附着力的变化。特定基因表达谱由轴索的位置和当地的外在形态形成控制指令。原肠胚形成导致脊索的形成,一个独特的缸中胚层细胞沿着中线延长。外胚层位于脊索毗邻,形成neuroectoderm接收感应信号。神经上皮神经板然后经历复杂的形态形成运动涉及细胞分裂、形态变化,和迁移允许神经管的形成。神经管闭合后,神经背内侧边界折叠成为神经嵴衍生品。细胞运动在这个阶段是至关重要的生产不同的轴索的区域。例如,在腹侧中线神经管的细胞成为一个专门的区域称为地板板(图4(d))。生成多种不同的神经元亚型在哺乳动物的神经发育。这种多样性是绝对建立功能性神经电路的先决条件。

总之,神经发育的连续步骤包括神经感应从胚胎外胚层,沿着rostrocaudal模式(电阻-电容),和背腹侧的(dv)轴(允许区域确定功能异质性),随后终端分化成不同postmitotic神经元亚型(2]。这样的见解,从发育神经生物学提供了一个概念性的框架的定向分化hPSCs并允许实验性的神经元亚型多样化的分子“逻辑”(4]。结合地区的理解,和/或亚型,特定的神经元变性支撑大部分神经退行性疾病,这些事实提供一个令人信服的理由可以预见控制的细胞命运hPSCs为了产生临床相关地区特定的神经元和神经胶质的数量进一步研究[5]。

2。神经诱导

第一机械的见解神经感应来自开创性实验Spemann和Mangold 20世纪早期。在这些研究中,胚胎移植到腹侧和背侧中胚层产生二次host-derived神经管。贪污本身被发现为次要包括脊索中胚层结构,而host-derived神经组织。能力不断的背原口唇周围组织当移植ectopically证明它的名称为“组织者组织。“等效组织者地区其他脊椎动物随后被发现的优雅沃丁顿工作在1930年代,包括“原结”在鸟类和哺乳动物(图2(一个))。组织者组织沉淀异位神经感应的能力种间表明进化的潜在机制保护。感应信号的概念策划神经诱导的过程已成为被广泛接受的。越来越多的证据表明时空的相互依存的几个信号通路在神经感应,有些挑战组织者组织的概念。,神经感应背后的分子机制仍然难以捉摸,直到1990年代,当非洲爪蟾蜍研究首次报道,瞬态gastrula-stage动物帽成单个细胞的分裂导致神经命运采集和misexpression的显性负激活素受体,自从被发现抑制多个转化生长因子(TGFβ-)相关因素,ectopically生成神经组织中胚层的规范。这些研究表明,神经感应可能发生“de-repression”战略(即。删除一个抑制信号)。图3在这一过程中描述了相关的通路。

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图3

神经诱导的分子途径。(一)外胚层(粉红色)中描述表达节点。通过节点外胚层刺激(粉色箭头)BMP4的表达(用蓝色表示)胚胎外的外胚层细胞(蓝色)。肿瘤外胚层BMP4的作用,刺激(蓝色箭头)的WNT(粉红色)中描述通路外胚层,反过来进一步激活(粉色箭头)节点的表达式。因此,节点之间是一个正反馈循环,BMP, WNT。色彩方案:箭头对应相关组织/成形素。(b) DVE(红色)中描述表达Cerberus1和左撇子(红色)中还描述了抑制节点的表达式,因此下调其邻近节点。它也表达了Dickkopf(红色)中所示,一种抑制蛋白质接近DVE WNT3信号。表达下调节点和WNT也接近DVE抑制BMP4表达式。因此,有一个节点的梯度,WNT和BMP尾高表达吻侧和低表达。 FGF8 (pink and blue), expressed both in the epiblast (pink) and extraembryonic ectoderm (blue), also inhibits BMP4 contributing to the gradient. Colour scheme: arrows corresponds to the secreted inhibitory molecules/tissue source (DVE). They show the consequence of the negative feedback that creates the morphogen gradients in the R-C axis. (c) The DVE migrates into the AVE and the gradients are thus remodelled with low Nodal, WNT, and BMP expression ventrally and high dorsally. (d) Due to these gradients the neuroectoderm is formed at the ventral pole of the epiblast. Colour scheme: arrows corresponds to the secreted inhibitory molecules/tissue source (AVE). They show the consequence of the negative feedback that creates the morphogen gradients in the D-V axis. All timelines are given for mouse and human embryonic development.

图4

神经模式。(a) Rostrocaudal节点的梯度,BMP4, RA(视黄酸)和FGF8重要Rostrocaudal模式。(b)不同因素之间的相互作用编码前脑(PAX6和OTX2),中脑(PAX6、OTX2和EN1 /我们),和后脑(GBX2 EN1 /我们,和FGF8)。定义的forebrain-midbrain障碍是互斥的表达PAX6(前脑)和EN1 /我们(中脑),而midbrain-hindbrain边界由OTX2(中脑)和GBX2(后脑)。OTX2和GBX2受FGF8表达式。(c)背腹侧的模式与背梯度BMP4和WNT和嘘的腹侧梯度(声波刺猬)。(d)横截面所指定的神经管描绘各种神经元的梯度嘘底板和BMP4和WNT屋面板:V0-3:中间神经元和MN:运动神经元。

2.1。TGF -的作用β神经感应信号总科成员

TGF -的分子机制β信号相对好理解:受体配体结合原因二聚作用,启动信号转导通路和胞质蛋白,激活一个家庭Smads,磷酸化。八Smad蛋白质编码在人类基因组中,虽然只有五个(Smad 1, Smad 2, Smad 3, Smad 5和Smad 8)作为底物转化生长因子受体家族;这是通常被称为“receptor-regulated Smads,“还是”RSmads。”TGF广泛- - - - - -β信号总科包括苯丙酸诺龙/节点和骨形成蛋白(BMP)信号通路(6]。BMP信号的基板是Smads 1、5和8,而苯丙酸诺龙/节点受体激活Smads 2和3。Co-Smad (Smad 4)所有RSmads函数作为普通合伙人,而Smad 6和Smad 7是抑制。Smad / Smad 4复合物把原子核和激活基因表达。

2.1.1。BMP对抗

在1990年代早期的大脑——卵泡抑素——过多,Chordin被确定为基因编码表达的蛋白与神经化活动组织者的组织。这些蛋白质抑制剂BMP信号,与特定BMP4敌视的偏向,抑制神经的命运的人。BMP4表达广泛出现的原肠胚形成(图3(一个)),但随后下调后的神经板的出现组织者地区(图2 (b))。BMP信号的封锁导致了神经板扩展在整个胚胎,零突变小鼠在BMP拮抗剂(如‘诺金’和Chordin)显示显著降低大脑的大小(1]。更广泛的角色BMP通路在胚胎发展是全面回顾了其他地方7]。

这些事实,综上所述,允许一个简单的分子途径被认为是神经感应:肿瘤外胚层产生最佳管理促进表皮分化,而神经诱导地区(组织者组织)对抗我国允许神经感应数据3(一个)- - - - - -3 (d))。这可以通过阻止BMP mRNA在pregastrula阶段由纤维母细胞生长因子(FGF)。另外,BMP蛋白可以在原肠胚阶段期间提到的因素来自组织者地区的分泌。在此背景下,神经诱导的“默认模式”制定,并且假定gastrula-stage外胚层的细胞有一个自治偏爱分化成神经组织,这一过程是由我国抑制。这个模型相比,后续的研究已经证明,组织者组织/ BMP对抗可以可有可无的神经感应,表明额外的机制/信号途径值得考虑在评估中,考虑到他们的潜在意义通知神经转换策略hPSCs [1,8,9]。

2.1.2。苯丙酸诺龙/节点对抗

大部分研究集中在BMP神经诱导的抑制的作用在脊椎动物发展。然而,TGF -的其他成员的重要性β总科,包括节点,也建立了(10]。神经诱导的节点作为抑制剂(11),而节点淘汰赛胚胎显示增加neuroectoderm规范(12]。节点的作用抑制神经诱导的老鼠和人类胚胎干细胞(ESCs)是良好的,都独自一人(13- - - - - -15)与BMP对立组合(16]。节点表示在整个外胚层(图3(一个)),这个途径抑制剂已确定在DVE /大街(17],它起到了至关重要的监管作用在神经感应和重新定位成形素梯度之间的电阻-电容和dv轴(数字3 (b)和3 (c))。在此背景下,我们和其他人利用节点单独对抗达到神经规范从hPSCs在悬浮培养14- - - - - -16,18),虽然最广泛采用的方法从hPSCs称为dual-Smad抑制神经转换,并利用节点和BMP4拮抗剂(相结合16]。

2.2。其他因素涉及神经感应

2.2.1。纤维母细胞生长因子(fgf)

fgf的多样化分泌扩散性的糖蛋白,通过与微分关联绑定四类胞外受体(FGFR 1 - 4)。FGF信号在神经诱导的精确作用仍有争议,但集体研究表明早期功能,促进神经转换能力,后来在转录BMP拮抗功能。FGF家族的另一个重要成员,FGF8,表示在老鼠胚胎的胚胎外的中胚层和外胚层原肠胚形成之前和期间(数字3 (b)和3 (c))。FGF8激活钙调磷酸酶,脱去磷酸Smad 1/5, BMP4通路的主要组件19]。因此,FGF8可以抑制BMP4信号导致神经感应。这一发现进一步支持神经诱导的复杂性和挑战前面的“默认”模型。人类PSC生物学也有助于理解FGF的相关性神经感应,与一些研究证明FGF撤军或对立(节点和BMP4对抗)促进神经转换(20.- - - - - -22),和其他人表明FGF神经诱导能力(23- - - - - -26]。这些看似矛盾的结果可以通过识别至少部分协调,不同的文化条件从事这些研究(例如,单层和悬浮培养;不同项目的coadministered外在信号),这可能改变FGF的影响在神经感应上下文相关的方式。

2.2.2。WNT信号

实际上wnt分泌糖蛋白负责建立胚胎的背腹侧的轴,收购的直接后果是神经的身份。信使rna编码管理实际上wnt(或者他们的效应器)注射到动物半球一个细胞的胚胎产生异位神经组织。WNT信号本身就是激活BMP4和涉及一个节点正反馈循环27)(图3(一个))。AVE分泌Dickkopf, WNT通路拮抗剂贡献最初电阻-电容,和后来的dv,节点梯度(数字3 (b)和3 (c))。然而,WNT3激活并不损害神经诱导的小鼠胚胎(28),制29日],hiPSCs [30.]。一层复杂性是由不同方式添加WNT可以在整个开发、规范化β连环蛋白通路(促进扩散),或不在经典里的物途径(促进神经元分化)FGF2-dependent方式(31日]。

这些研究结果共同表明neuroectoderm规范可能是更复杂的比“默认”(BMP4抑制)或“组织者”(BMP4相结合,WNT3和节点抑制)模型可能建议。每个相关信号通路的影响暂时监管和由发展背景下,证明他们的系统调查(包括单独和组合)的神经转换hPSCs [26]。

3所示。神经模式:概述

一旦指定,neuroectoderm是随后地区化的胚胎体沿电阻-电容轴(数字2 (c)和4(a))。组织者地区可以分为那些参与生成吻侧和尾结构神经轴(32]。更具体地说,在原肠胚形成的组织者组织下谎言prechordal神经板(前neurectoderm),而尾巴组织者组织变得脊索和体节和谎言下epichordal神经板(后neurectoderm)。有趣的是,有证据表明,在制神经感应,WNT和FGF信号促进neuromesodermal前兆,人口产生脊髓神经元细胞和近轴中胚层29日]。信号,每个位置(例如,‘诺金’)和抑制实际上wnt(例如,Dickkopf)刺激prechordal板的生产,见解,又引导个体发生关键hPSC差异化协议(33]。

精确的时间和轴索的机制模式仍然没有解决。流行的模型是,神经感应最初指定喙的前兆,随后respecify caudalising信号位置的身份在进步和刻板的方式建立细分后神经轴。一些信号通路参与神经感应似乎也在早期电阻-电容和dv扮演关键角色模式在后期10];他们建立一个矩阵的位置信号(数字4(一)和4(c)),进而影响前驱细胞命运规范通过分级浓度的形态形成的信号。从广义上讲,前neuroectoderm生成前脑,和后neuroectoderm产生中脑后脑,和脊髓32]。dv信号通路有更多相关的角色产生神经程控多样性在每个上述电阻-电容细分(图4(c))。值得注意的是其他机制,如当地发展中神经元之间的信号,也导致神经元亚型的合奏。图4总结了一些相关的概念,在后面有详细的介绍如下。

3.1。早期在电阻-电容轴模式

从动物研究的证据表明,空间和功能不同的细胞群组织发展的头部和躯干结构(32]。头组织者组织位于大街和主干组织者和前原条(图中节点2(一个))。大量的证据牵连到BMP对抗在前脑发育(图4(a))。的确,神经转换策略利用BMP hPSCs通常报告中对抗前脑前体规范(16,23,34,35]。

通过一系列方法的研究表明大街是正常的前脑发育所必需的节点信号是至关重要的在这个过程中(1]。总的来说,这些研究表明,部分减少节点的信号主要影响规范prechordal mesendoderm,这是必要与caudalising信号,从而扰乱前脑的发展。因此,节点信号是必要的适当的电阻-电容模式neuroectoderm(图4(a))。Smad 2和Smad 3节点信号的细胞内感受器是必要的。先前的报道表明Smad 2/3在神经发育;在老鼠身上,例如Smad 2^{+ /−}和Smad 3^−−/突变体胚胎展览小型像结构(36]。在斑马鱼,注入的信使rna编码显性负Smad 2/3突变体还导致一个更小的头(37]。然而,Smad 2/3的确切角色在神经感应和neuroectodermal模式仍不完全清楚。在此背景下,符合这些发现,我们和其他人证明小分子抑制Smad 2/3对hPSC-derived神经前体细胞(尾区域标识15,26]。

FGF信号梯度沿电阻-电容运行轴诱导神经管paralogous Hox基因的表达。Hox基因位于集群的一端(3′末端)表达更多的吻侧响应FGF的低水平;相反的另一端的基因表达(5′末端)尾FGF的应对高水平(图4(a))。因此不同Hox基因表达在臂(Hox4-Hox8),胸(Hox8-Hox9)和腰(Hox10-Hox13)水平的神经管38]。Hox-based转录网络的机制设计这些流程正在系统地解决(39]。这些分级FGF信号调节主Hox基因表达模式之前进一步叠加信号改进subset-specific Hox表达式。吻侧,维甲酸(RA)调节Hox表达式在颈/臂水平,在一定程度上通过激怒FGF梯度(图4(a))。更多的尾,Gdf11 (Tgf -的成员β总科)中扮演一个重要的角色在Hox8-Hox10基因表达在胸和腰神经管地区40]。

3.2。在dv轴模式

轴索的解剖学的dv安排密切相关的功能组织。这个解剖极性显然是明显的脊髓运动神经元位于腹侧角并定位在背根神经节感觉神经元。在延髓神经轴结构,如基底神经节(包括黑质)是罕见的,而大脑皮层背定位。电阻-电容和dv模式集成在一个高度谨慎的态度。广泛地说,腹侧区域规范需要激活的节点和声波刺猬与拮抗BMP信号通路。超出其电阻-电容的作用模式,需要RA过渡带规范内的dv轴。同样,FGF腹侧域规范中也扮演着重要的角色。dv轴形成的主要贡献者是我国和实际上wnt背和声波刺猬罕见41]。通过交互生成不同的神经元亚型反对dv形态形成的梯度,形成一个矩阵的“坐标”组合编码离散前体域在刻板的dv array [2,3]。在神经管,这种发展战略构成运动神经发生和腹侧interneurogenesis(图4(d))。腹侧神经模式形态因子的结果来自底板和脊索。在1990年代早期,不同实验室克隆脊椎动物的同系物果蝇分泌信号蛋白编码基因的刺猬。声波刺猬(嘘)发生的罕见分泌成形素赋予dv神经管极性(图4(c))。现在良好的通过各种增益和功能丧失的研究在不同的物种,嘘扮演着重要和不可或缺的角色,指定整个neuroectoderm腹侧细胞类型(41]。嘘首先表现在脊索和后来的底板,可能继发于汽车感应(图4(d))。它的功能是浓度及其效应机制主要是激活转录因子的镇压。脊髓运动神经元生成,例如,取决于两个暂时嘘信号的不同的阶段:一个早期ventralizes神经板前兆和后期,它促进了这些前体为运动神经元的分化,此时有一个浓度的规范腹前体为运动神经元或中间神经元(图4(d))。

位置标识对前体细胞如何?几项研究已经涉及一组因素,主要的homeodomain (HD)和基本helix-loop-helix (bHLH)转录因子,作为重要的监管机构。这些都是表现在严格组织阵列神经管的沿着dv轴。单个的蛋白质是指定为类I或II反应嘘信号。蛋白质类我被嘘压抑,因此定义腹言论限制,而二类嘘引起的蛋白质表达和定义背表达界限。特别是在脊髓发展的背景下,这种cross-repressive交互允许建立五个不同腹前体域,从而允许不同神经元亚型的规范。增益和功能丧失实验进一步支持这个假定的机制在不同的物种中,异位表达的HD蛋白可以改变单个神经元亚型的区域分配在神经管(38,42]。类似cross-repressive蛋白I和II类之间的交互也发展“逻辑”背后的腹侧脊髓神经发生。最腹侧的神经模式方面(即。,floor plate) require Nodal signalling, and FGF has also been broadly implicated in ventral patterning within the neuraxis [41]。

嘘的信号似乎并不导致背神经管的模式。然而,我国也有类似的和互补的角色在背神经管和端脑(图的模式4(c))。这些作为主要的背形态形成线索通过建立高到低浓度从背侧到腹侧的位置。以类似的方式在腹侧神经管嘘,这种BMP梯度使不同的前体域定义,因此允许生成不同背神经元亚型(43]。

4所示。定向分化hPSCs

这些提到的发展研究提供了一个概念性的框架来解释这两种神经诱导策略和定制项目定向分化的形态形成线索hPSCs临床相关和地区特定的神经元(总结在图5和表1)。

图5

定向分化的方法:可以直接接受神经转换hPSCs应用抑制BMP4和/或节点的发展原则。从neuroectoderm分化不同的轴索的地区可以通过关键技术发展形态形成的指示:前脑(默认),中脑(WNT FGF8激活),后脑(FGF8, WNT和其他人来说,RA),和脊髓(FGF8, WNT和其他人来说,RA)。这些梯度显示在右边的图rostrocaudal轴。另一个重要的形态形成线索用于定向分化是嘘的dv轴内ventralising效应。所有的时间都给老鼠和人类的胚胎发育。

4.1。前脑

“默认”神经转换从hPSCs前脑神经元亚型已经证明在多种系统包括化学定义悬浮培养,不需要外在的信号,以及在一个贴壁培养法(16,44,45]。与发现,这些研究开始于2007年选择性Rho-associated激酶(岩石)抑制剂允许分离hPSCs的生存,从而使系统操作后细胞命运离解(44]。一年以后,同样的实验室采用无血清胚状体身体,就像(SFEB)文化但这次概括细胞内在和暂时监管皮质层流体外测定(45]。这些和后续研究已经证实皮质层特定表达不同的标记包括Reelin在图层1 (Cajal-Retzius神经元),TBR1 CTIP2深陷层,和SATB2 BRN2, CUX1表面皮质层(46]。这样默认背端脑的差异化战略往往产生glutamatergic为主,但也一些gaba ergic,神经元(47]。

终端分化之前,如果指定了背端脑的前体暴露在嘘和/或WNT拮抗剂,他们ventralised生成subpallial衍生品(即。、外侧和内侧神经节沙;分别教育法和兆欧)。在终端分化,这些ventralised端脑的文化产生gaba ergic投射神经元和中间神经元。临床相关的细胞类型起源于教育法(例如,媒介带刺的投影gaba ergic神经元,相关亨廷顿氏病和肌张力障碍)和兆欧(例如,基底前脑胆碱能神经元与阿尔茨海默病相关)。进一步成熟可以添加到上述定向分化策略通过仔细调节嘘和WNT通路(编排背腹侧的位置标识在这种情况下)。例如,低浓度的嘘仅允许教育法的规范和兆欧衍生品,而如果添加WNT拮抗剂嘘,腹兆欧(即越多。NKX2.1表达)神经元优先指定的教育法(即。,DLX GSX2 MEIS2和ISLET1表达)神经元。一些优雅和个体发生关键策略定义了真实DARPP32表达中带刺的投射神经元的生成(33,47]。

4.2。中脑

区分hPSCs到中脑多巴胺神经元一直保持极大的热情可能会由于其潜在的理解和治疗帕金森病。虽然多巴胺神经元存在整个神经系统,有针对性功能异质性,实验证明通过执行anisotopic植入实验(48]。中脑多巴胺能神经元发育三个不同的原子核分区:(i)的黑质致密部(A9组),主要是在帕金森病的影响,(2)的腹侧被盖区(A10组),和(3)retrorubral字段(A8组)。指出hPSC-derived神经前体细胞有一个默认吻侧(前脑)和背(皮质)身份,morphogen-guided位置respecification,腹侧中脑或模式,是真正的中脑多巴胺能神经元分化所必需的。Feeder-free和feeder-dependent分化方法都被用来从hPSCs生成中脑多巴胺能神经元。Feeder-dependent差异化策略利用鼠标基质细胞系(如尼龙6),即使相对容易建立,把化学的定义和动物的主要缺点。从体内发育的研究中,指引着我们的洞察力FGF8信号导致cross-repressive Otx2和Gbx2之间的交互定义midbrain-hindbrain边界(MHB;图4(b))和传授rostrocaudal位置身份的前体MHB [49]。Otx2和Gbx2控制模式在这一地区通过调节两种形态形成的表达提示,WNT1中脑和后脑FGF8。此外,结合Otx2表达式,cross-repressive机制之间Pax6和En1 /我们定义的边界地区命运分配前脑或中脑(图4(b))。

在此背景下,初始方法中脑分化是基于FGF8中脑的电阻-电容模式对该地区和嘘ventralization多巴胺神经元,尽管收益率很低(约。30%)使用这种策略。此外,后续的研究已经提出了这样的可能性,尼龙6和嘘/ FGF8-based方法本身并不足以产生真实的中脑多巴胺神经元(50,51]。然后领域经历了一段时间的重新评估在协议完成腹侧中脑的发展有更多的忠诚和精度。在这段时间里,先前的协议是系统地细化和取代研究使用WNT受体激动剂(48,50),尤其是来自瑞士思德利公司实验室建立了一个有效的中脑底板通过多巴胺神经元被指定有效的差异化策略。至关重要的是,这项研究表明功能移植和复苏老鼠,老鼠,和非人灵长类动物与帕金森症(50]。的研究表明,通过使用规范WNT受体激动剂在不同浓度和时间定义,不同区域的生成指定的祖细胞从船头到后脑是可能的。有趣的是,生成的中脑多巴胺能神经元,但不是端脑的同行,可以扭转结构和功能赤字在帕金森病动物模型。这种亚型特异性突显出无与伦比的潜力导演分化的hPSCs再生医学(48]。进一步的研究在这个舞台上使用瞬态的封锁FGF信号提炼中脑位置身份和产生真实的多巴胺能神经元效率高(52]。虽然它可以辩称,这些后来的研究产生更真实的中脑多巴胺神经元,因为他们利用合理化发展的线索,GSK3应该注意β这里使用抑制剂如CHIR99021 WNT通路激活有脱靶效应(即。,他们调节除了WNT通路)[53]。另外值得注意的是更具体的WNT通路激活物(例如,WNT3a)不反复生成中脑多巴胺神经元GSK3相同的效率β抑制剂CHIR99021 [50,54]。在未来的研究中,绝对GSK3要求β抑制和额外的识别关键监管途径将是非常重要的建立。

4.3。后脑和小脑

广泛地说,进化历程似乎更加保守尾(原始)地区的中枢神经系统如后脑。后脑可以分为吻侧和尾部分,由rhombomere 4 (r4)。神经元来自吻侧区域项目和使神经分布于无数的大脑区域,而尾部分,主要位于脑脊髓,产生下行脊柱预测。羟色胺神经元,大脑支配中央源自r2-3延髓中缝,导致高阶脑功能,涉及一系列精神疾病。通过EGF和FGF2在维护媒体所谓的“长期自我更新的rosette-type”hPSC-derived神经前体细胞可以扩展展览一个腹前hindbrain-like表达谱经过长时间的文化(55]。这些前体优先生成gaba ergic神经元,其中一些是血清素激活的神经元。这一发现可能是因为位置respecification默认的前脑身份二级FGF2旷日持久的文化,这是众所周知caudalising属性。最近,一个协议hPSCs定向分化的功能验证后脑血清素激活的神经元通过WNT和嘘通路的激活报道(56]。

很少有报道称,小脑与演示电生理成熟和功能分化浦肯野,颗粒细胞规范(57,58]。最近的一项研究生成MATH1-positive cerebellar-like颗粒细胞则使用顺序的复杂项目管理形态因子,包括FGF8,风湿性关节炎,FGF4, FGF2, WNT1a, WNT3a, BMP4, GDF7, BMP7, BMP6,嘘,BDNF, Jagged1, NT3 [59]。最近一个个体发生小脑的神经发生关键战略实现有效的定向分化hPSCs只使用三个形态因子(57]。这里,hPSC-derived拟胚体定位首先指定midbrain-hindbrain边界,随后针对小脑板神经上皮(CPNE)。CPNE反过来催生功能成熟的浦肯野,颗粒细胞,DCN-neurons,和各种中间神经元在特定顺序管理FGF2 coculture设置,FGF19, SDF1。FGF2的研究使用胰岛素,嘘信号(环巴胺)的拮抗物,又迫使coculture与大鼠小脑片加强这种方法的有效性为定向分化小脑神经元(58]。这两个最近的研究在某种程度上依赖coculture同位素organotypic片/啮齿动物小脑衍生品。在这一领域未来的研究应该关注克服依赖coculture啮齿动物或人类小脑切文化通过识别必要的外在信号用于指定小脑衍生品在每个阶段的血统限制。

4.4。脊髓

代的脊髓功能的衍生品,包括运动神经元,通过不同的方法实现了从hPSCs使用从发育生物学见解15,60- - - - - -62年]。这些策略使用同时或顺序caudalising管理(例如,RA)和ventralising(例如,嘘)形态因子之前终端分化。这些研究证实的表达特定的运动神经元命运决定因素包括HB9、特定酶/转运蛋白包括胆碱乙酰转移酶(聊天)和水泡乙酰胆碱神经递质转运体(vAChT),并与肌管coculture证明生理相关的神经肌肉接头的形成(18,60,63年]。电生理学的研究证实,hPSC-derived运动神经元获得适当的功能性质(60]。运动神经元前体细胞有重要的是被证明能够生存和集成在啮齿动物胚胎脊髓(64年,65年)和项目轴突形成生理突触。

文化与RA治疗通常会导致颈椎或臂位置标识18,65年]。尾(腰椎)运动神经元命运也可以实现在RA信号缺失的情况下,可能在回应FGF2;我们确实报道类维生素a的独立战略从hPSCs运动神经发生,产生一个腰椎亚型身份和倾向于内侧电机柱状规范(18]。这种retinoid-mediated多样化的运动神经元亚型进一步支持并行研究小鼠胚胎干细胞(65年]。最近的一项研究采用视黄酸和WNT激动从hPSCs生成颅运动神经元(66年]。另一个后续研究报告的推导运动神经元在RA治疗但嘘自由条件下,发现重要的洞察人类运动神经发育生物学(67年]。

4.5。神经嵴

神经嵴细胞高度洄游和产生无数的分化细胞类型包括(i)感觉和自主神经细胞和雪旺细胞,(ii)在肾上腺髓质嗜铬细胞,黑色素细胞(iii), (iv)颅骨骼和结缔组织组件。神经嵴细胞的命运在很大程度上取决于他们迁移到/解决的地方。从hPSC的角度来看,突出的表型结果已经证明了基于电镀密度,这提供了一个策略来生成神经嵴衍生品。电镀密度高有利于PAX6表达中枢神经系统神经crest-like前体而指定的电镀密度低分化(16]。使用这种方法的变化,stage-specific隔离/ hPSC-derived神经嵴细胞的分化已经通过使用结合体外扩张,通过外部信号和定向分化细胞排序。例如,无血清条件与随后的外在线索可以允许定制项目规范的雪旺细胞,自主或感觉神经元,而血清基础方法倾向于间充质衍生品包括脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、平滑肌。功能验证证明了hPSC-derived神经嵴细胞移植到一只小鸡胚胎,他们表现出保存神经嵴身份的环境中生存,迁移和分化68年]。

5。结束语

哺乳动物中枢神经系统的无与伦比的复杂性可以通过一系列的进步和顺序在胚胎发生的事件。中枢神经轴内的互联性程度有些令人惊讶的是它令人印象深刻的是精确的组织成离散的区域。进化发育过程潜在的组织离散守恒神经区域适用于更多的吻侧(即变得越来越少。,从进化的“新”)组件,如前脑。hPSC平台正成为一个重要的简化的人类发展的体外系统查询方面,直到现在仍实验难以接近。

电流等方法对定向分化hPSCs常常不能捕获动态和重叠的神经发育过程的性质。例如,神经感应不同流程和模式通常概念化。然而,偏向于不同地区的命运将由神经转换范式。类似目前的分化策略尚不完全承认或利用能力影响细胞命运的决定(亚型)postmitotically已报道,(69年- - - - - -71年]。因此,磁场定向分化的方法对个别细胞亚型可能受益于更紧密地结合起来,每个各自的神经发育阶段,导致每个阶段的定制条件血统限制(即。、神经转换模式,终端分化)。

发展原则是一个至关重要的资源定义个体发生关键技术定向分化为hPSCs协议(图5)。除了知识的财富从啮齿动物发育生物学已经存在,有越来越多的公开研究人类大脑的特定区域和transcriptome-wide数据集使用各种各样的组织从胎儿到成人阶段(72年- - - - - -74年]。除了强调hPSC-derived神经元的成熟状态(75年),这样的发展/ stage-specific数据集可以作为黄金标准验证区域的细胞定向分化协议。事实上这些数据集应该最终导致实验设计时相对未开发地区的神经系统使用hPSCs正在调查。人类脑源性数据的利用率绕过潜在问题的进化老鼠和人之间的分歧,尤其是在更多的吻侧(进化更新)的神经轴区域。耦合见解获得这些宝贵的资源以及高通量平台协议发现将会是一个未来大道改善当前定向分化策略的鲁棒性(66年]。

最后,hPSC领域有望受益于定义多个神经定向分化协议采用紧密方法转换和类似的协议期限。这可能允许更有意义的区域的神经元之间的比较,没有潜在的混杂微分细胞成熟问题。实际上这种方法最近被利用来显示不同的表型使用来自阿尔茨海默氏症患者的细胞则和运动神经元病(76年]。综上所述,这种标准化的定向分化hPSCs可能有助于推动识别鲁棒策略指定丰富种群的临床相关的区域人类神经元深造的亚种群。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

亚历山德拉Zirra和莎拉Wiethoff文学进行研究,为论文的写作,和建造数据。瑞奇那时定向分析和写论文。

确认

莎拉支持Wiethoff BRT-Studentship(大脑研究信任)。瑞奇那时是威康信托基金会中级临床研究员(101149 / Z / 13 / Z)和安妮·罗琳研究员再生神经学。

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