CRISPR / Cas的崛起在干细胞基因组编辑

文摘

遗传操作是一种强大的工具建立遗传损害之间的因果关系和特定的病理表型。的崛起CRISPR / Cas9基因工程工具克服了传统常规细胞遗传操纵特定站点的技术瓶颈。创造完美的在体外细胞模型,有重大利益的干细胞研究社区采取这种快速发展的技术。本文解决了这个需要直接通过提供的最新的生化原理CRISPR-mediated基因组工程和详细实用的指导方针CRISPR实验细胞模型的设计和执行。最后,本文将作为一个及时和全面的指南这迅速发展的技术。

1。介绍

基因工程工具促进DNA位点专一的删除,插入,倒置,更换。这些操作复杂的真核基因组帮助研究人员了解基因的功能在一个给定的细胞环境,探索内生位点的基因调控方式,,最重要的是,人类疾病模型使用条件在体外细胞模型或在活的有机体内模式生物。

因为设计师的出现基于DNA碱基识别的核酸酶通过模块化蛋白图案,如锌手指锌指核酸酶(ZFNs) [1- - - - - -3),以及故事域转录activator-like效应核酸酶(取得)4,5),在真核细胞DNA特定站点操作通过了一项关键的效率和特异性阈值,使在实验室常规应用。最近发达,爆炸流行CRISPR / Cas9(集群定期空隙回文重复/ CRISPR-associated)基因工程系统改变了发现在这个激动人心的时代。CRISPR /中科院首次被发现在原核生物适应性免疫(6- - - - - -8),已被广泛用于真核基因组工程比ZFNs和取得9]。使用最广泛的阶级,II型CRISPR / Cas9系统酿脓链球菌,提供给用户最大的缓解和模块化设计和执行的任何基因工程实验(10- - - - - -13]。然而,限制和常见的实际缺陷CRISPR / Cas9系统尚未充分,系统地总结和强调新兴人口的潜在用户,很大程度上是因为系统的附带的极大的热情令人惊异的人气上升。

综述,有关实际问题的设计和执行一个典型CRISPR实验将讨论,尤其是在建模环境中人类疾病使用干细胞。由于当前范围的限制,本文将讨论设计师核酸酶(ZFNs和取得)早些时候和应用CRISPR生物模型,虽然类似的基本原理和一般原则在以下部分中讨论也适用于这些应用程序。

2。CRISPR / ca系统的发现

CRISPR系统首次被发现在细菌质粒作为“适应性免疫系统”,病毒DNA或RNA (6- - - - - -8]。这种“记忆系统”可以破坏DNA或RNA如果再感染发生在相同的细菌或其后代(14- - - - - -19]。三种类型的CRISPR位点存在,所有这些获得短的DNA片段称为逆电流器从外源DNA元素(20.]。逆电流器集成到过程中细菌基因组CRISPR适应。他们通常插入CRISPR位点,其中包含短,部分回文DNA重复形成位点交替重复元素(CRISPR重复)。这些位点随后转录和加工成小干扰RNA指导sequence-specific乳沟的核酸酶互补序列。通过这些逐步但适应不断演进,CRISPR重复RNA (crRNA)生物起源和外源DNA产生针对复杂CRISPR-based适应性免疫系统在近一半的细菌种类,以及在大多数古生菌(21]。

外源性核酸序列的元素对应一个CRISPR间隔定义为一个protospacer [22]。为适当的针对I型和II CRISPR系统,protospacer通常是在一个系统,高度保守的CRISPR主题,即一个protospacer相邻的主题(PAM) [23]。大多数PAMs通常2至5高度保守的核苷酸,要么protospacer的5′末端(I型系统)或在3′端(大多数II型系统)。PAM CRISPR系统的一个重要特征是区分外国对宿主基因组DNA;因此,只有PAM-bearing入侵序列将针对破坏。

3所示。不同种类的CRISPR / ca

中三种不同类型的CRISPR位点,I型和III位点涉及复杂的多个面板Cas蛋白质形式核糖核蛋白(RNP)复合物与目标外国CRISPR RNA序列(15]。然而,II型CRISPR中科院系统使用一个小得多的数量蛋白质来执行这一核心功能。II型CRISPR位点有三个细分。最常用的真核基因组CRISPR系统工程是采用从II型系统链球菌,单个Cas9蛋白(spCas9)负责形成CRISPR-RNP复杂和随后的DNA乳沟。实践理性简单起见,大多数基因工程应用程序使用一个混合的RNA(指导RNA, gRNA)相结合的基本结构特点transactivating RNA (tracrRNA)和crRNA双工(10]。这里使用的单链gRNA在随后的讨论。

spCas9之外,其他几个同源Cas9蛋白质从类似的II型CRISPR系统共享核心特性作为RNA-guided目标唯一的蛋白质成分。Cas9蛋白质的乳酸链球菌,脑膜炎奈瑟氏菌,梅毒denticola展示了类似的基因编辑效率来spCas9(表1)[24- - - - - -27]。这些Cas9蛋白有不同的大小,主要是由于他们的目标识别领域(REC) [28]。值得注意的是,直系同源Cas9蛋白质特定PAM序列用于针对不同;因此,他们可以使用位于相同的单元中,搭配相应的crRNA识别相应的目标没有互相干扰(29日- - - - - -31日]。这种特点使序列的灵活性CRISPR实验通过提供各种Cas9目标几乎任何特定的蛋白质序列(25]。这种正交性是最有力地证明了最近的工作,允许不同的基因组区域的标签使用不同的灭活Cas9-fluorescent融合蛋白同时在一个活细胞(32,33]。尽管大多数Cas9蛋白II型CRISPR系统有一个或多个最优PAMs,也有相当大的灵活性的PAM的认可。例如,spCas9承认NGG作为其最优PAM序列,而唠叨还可以被较低频率([12]和随后的)。这种可塑性可能源于连续目标进化选择压力在细菌病毒序列(34]。在实践中,这种可塑性带来了相当大的挑战,由于非目标识别替代PAM序列(12]。另一方面,这种灵活性允许不同Cas9蛋白的进一步工程优化或修改PAM的偏好。已取得初步进展向代spCas9 NGG更加僵化PAM PAM的识别和修改首选项(35]。在几年内进一步生化特性的本地正交Cas9蛋白质与PAM偏好和蛋白质工程努力Cas9蛋白质特征可能会生成一个完整的曲目Cas9蛋白质具有高特异性覆盖任何2 ~ 5-nucleotide PAMs。

最近重要的除了CRISPR工具箱是Cpf1的描述,一个二类CRISPR有别于Cas9效应。Cpf1是单个RNA-guided核酸内切酶使用T-rich PAMs并生成交错DNA双链断裂,而不是生硬的结束(36]。规模较小的蛋白大小和单一RNA指南要求可能使未来CRISPR应用程序更简单和更精确的控制。

4所示。Cas9酶学

Cas9蛋白质包含两个独立的核酸内切酶领域:一个是海航同源核酸内切酶和另一个RuvC核酸内切酶(图1)[10]。每个域劈开一条双链DNA (dsDNA)目标识别网站:海航域劈开互补DNA链(链形成双gRNA),和RuvC-like域劈开noncomplementary DNA链(10]。最近CRISPR / Cas9复杂结构分析(37,38Cas9]显示双泡状结构:识别(REC)叶和核酸酶(NUC)叶。Cas9与rna dna双工在很大程度上使用矩形叶sequence-independent方式,暗示Cas9蛋白质本身并不能带来明显的目标序列偏好。CRISPR / Cas9系统的一个警告是gRNA-loaded Cas9核酸内切酶乳沟并非完全依赖于直线导轨序列,因为一些有着类似结构的非标靶序列被证明被削减或更高的效率比设计目标站点(12,39- - - - - -42]。一般来说,前12核苷酸之间的不匹配(nt) gRNA (gRNA垫片,种子序列图1)和DNA的目标不是耐受性良好,表明高序列特异性PAM-proximal地区。然而,不匹配第一12元可以兼容高效解理(尾地区gRNA垫片,图1)[12]。结构生物学见解Cas9-gRNA RNP复杂显示12-nt序列在一个固定的“种子”配置甚至DNA衬底绑定前,而5′末端gRNA仍然非结构化。虽然一般来说真的,它是一种简化,序列的识别特异性CRISPR系统是一个活跃的话题调查(39- - - - - -44]。值得注意的是,短gRNA高达5000倍减少非目标效应是最近描述(45]。添加两个额外的鸟嘌呤(G) 5′末端的核苷酸gRNA在某些情况下,适度提高特异性CRISPR / Cas9系统[46),可能通过改变gRNA稳定、浓度、或二级结构。放松RNA-guided序列特异性的核酸内切酶系统仍然是其最大的挑战在基因工程中使用。最近的一个生物物理研究[37]Cas9绑定的热力学性质提供了一个可能的解释上述特异性的特点,并进一步分析沿着这些线路将有价值的进一步细化设计指导方针。

一定程度的结构灵活性被发现从DNA-gRNA duplex-loaded Cas9结晶学结构(38),由一个独立的晶体学和单粒子证实电子显微镜研究链球菌和答:naeslundiiCas9 [37]。这项研究表明,一个构象重排引起gRNA Cas9绑定,形成一个中央通道以适应DNA衬底(图1,gRNA绑定)37]。缺乏详细的结构信息如何Cas9识别目标序列在基因组和触发特定DNA序列识别后解理。然而,RNA-loaded Cas9蛋白质读取碱基配对的PAM配置(图1PAM,扫描)。二核苷酸GG的识别PAM同时允许当地稳定PAM立即解除目标基因上游的序列,这可能弥补当地的能源成本分离DNA链开始立即上游PAM(图1,Cas9承认PAM) [47]。最近的一项生物物理学研究Cas9-mediated DNA识别在体外进一步表明Cas9并不像一个典型的核酸酶(48]。首先,gRNA-loaded Cas9酶活性不遵循Michaelis-Menten动力学,因为Cas9蛋白质与目标站点稳定伙伴即使诱导DNA双链断裂。因此,成功的关键要求CRISPR-mediated基因组工程是有效和准确的目标定位。其次,gRNA-loaded Cas9发现目标序列使用3 d扩散无明显的DNA衬底上滑动。Cas9暂停对审讯一旦认识到DNA PAM序列。这些反应是短暂的,不会导致DNA乳沟。同意这个“暂停”的行为gRNA-loaded Cas9 DNA衬底在体外这种模式的瞬态DNA结合在细胞nonmatching目标是足够稳定使用全基因组检测CHIP-Seq(染色质免疫沉淀反应测序)43]。除了高纯度绑定Cas9的目标网站,众多绑定事件可以观察到较低的频率在短5 ~ 10核苷酸的主题匹配PAM-proximal地区gRNA + NGG PAM序列(43]。因此这些“脱靶”绑定可能涉及部分碱基配对gRNA和PAM-proximal序列之间的关系。没有内在的DNA解旋酶活动,如何Cas9促进DNA链替换其gRNA衬底的尚不清楚。建议在PAM是一个热力学有利的过程识别,和当地的解除DNA碱基配对被认为是在一个方向和顺序,从目标的3′末端序列相邻PAM和进步的5′方向DNA衬底(图1,碱基对扩展)47,48]。Cas9蛋白可能稳定本地解除DNA,允许进一步的单链DNA链的稳定连续的沃森克里克碱基配对形成gRNA(图1碱基配对的扩展)。如果碱基配对阻塞是由于DNA之间的不匹配衬底和gRNA DNA-Cas9相互作用的热力学能量可能不足以维持一个解除DNA的重要部分。在这种情况下,部分解除DNA将返回到双工状态,和DNA-Cas9交互将同时减弱(图1不匹配和DNA释放)。这些观测结果提供一个有吸引力的逐步substrate-unwinding目标识别模型和乳沟gRNA-loaded Cas9蛋白质。该模型预测,只有完全或几乎完全配对DNA rna混合动力车可能导致重要的DNA解旋,Cas9将裂开的DNA链(图1核酸酶的激活和乳沟)。这解释了高序列特异性PAM-proximal地区观察CRISPR-mediated基因编辑(49),以及最近发现的非标靶Cas9绑定通过PAM-proximal序列的开始很少导致非标靶酶活性在活的有机体内(43]。因为解除DNA双在前10 ~ 12-nt预配置种子序列可能是重要的热力学障碍与DNA和随后的分歧,建立稳定Cas9交互序列高度的忠诚在这个种子序列可能充分必要通过链置换触发Cas9构象变化和重塑网站的活跃。理论上,基于这一模型,DNA-gRNA混合发生的不匹配最接近PAM序列应该最不容忍和确实是最普遍观察到的非目标绑定(43]。进一步基于此模型和热力学模型结构信息可能会提高的效率和特异性CRISPR应用程序。

5。目标和非目标的考虑

类似于其他大多数工程应用,特异性和效率的主要因素是确保合理CRISPR-experiment设计。在随后的讨论中,特异性的概率定义为Cas9将目标设计轨迹相对于其他不良基因座(脱靶效应)。效率被定义为感兴趣的轨迹的概率将修改Cas9核酸酶的池中可用的目标染色体的细胞群。一句话,有力CRISPR设计趋向于最小化和最大化目标脱靶效应影响的设计师核酸酶来实现高特异性和效率。

18 ~ 20-nt隔离区域,设计成gRNA protospacer序列,是主要的决定因素对非目标和目标的影响CRISPR实验。一起给定邻PAM序列,与20-nt gRNA protospacer地区可以实现,理论上,独特的序列识别在一个随机序列的空间大约17结核病(tera-base对)如果一个完美的碱基配对匹配所需的目标。虽然这种分辨率的理论上限超过大多数真核基因组的大小,Cas9被发现的实际特异性大小低于理论预期。他们发现的“NGG”帕姆序列要求spCas9不是绝对必要的,因为“唠叨”帕姆经常容忍效率较低(12]。科学界也很快意识到,爆发以来CRISPR基因工程的发展,protospacer之间的不匹配和目标DNA容忍频率高得惊人,尤其是5′protospacer[序列41,42,44,50]。进一步说明Cas9酶学透露,这种偏见可能会由于单向(3′,5′)DNA双链融化加上DNA rna双形成根据Cas9 PAM识别核酸酶。虽然总3′,5′放松的梯度的碱基配对要求Cas9针对一般适用,发现有时序列不匹配gRNA 12-nt种子序列的间隔可以有效地目标39,41,42]。这表明,适当的碱基配对的gRNA种子本身并不能保证你特异性序列。此外,针对效率一些偏离网站甚至可能高于预期的轨迹与完全匹配spacer-protospacer序列(39,41,42]。这种现象可能是由于其他因素超出了RNA-based序列识别使用Cas9核酸酶。

相当多的知识相比Cas9脱靶效应的基础上,相对很少有人知道如何设计一个gRNA所需的目标事件更有效率。多种因素决定任何CRISPR实验的成功,如Cas9蛋白质的数量和gRNA,染色质目标位点的可访问性,CRISPR-induced DNA损伤和细胞反应。大多数这些问题超出了实验控制当CRISPR实验设计。一些最近的研究(51- - - - - -53]试图调试顺序偏好的有效gRNA检索成功目标gRNA序列在一个大,随机选择gRNA池。这种统计方法受限于当前的能力来生成一个gRNA池有足够的多样性和困难避免人工偏见当选择高效靶向细胞池。然而,一些统计上显著的规则已经被这些开创性的研究显示有效的gRNA spCas9的共同特征。(a)鸟嘌呤(G)强烈支持的3′位置最近端PAM序列(尤其是−1位置)。这种偏好可能是因为Cas9加载(51]。(b)的一系列胸腺嘧啶(T)是不好的在四个位置(−−1 4)接近PAM,这可能与这一事实有关RNA聚合酶III识别一系列的尿嘧啶(U)作为暂停/终止信号(54),导致低水平的gRNA表达式(51]。(c)胞嘧啶(c)是首选的DNA裂解位点(−3位置)。(d)在帕姆地区,支持C + 1位置虽然不赞成T [52]。(e) CRISPR活动与gRNA稳定,可影响垫片的核苷酸组成:G-rich间距器更稳定特别是与丰富的(55]。

上面讨论新兴gRNA设计原理是不断纳入可用生物信息学工具箱作为计算权重矩阵的非目标或目标分数gRNA [52,55- - - - - -59]。虽然这些分数是信息化在促进实验设计过程中,潜在CRISPR用户应该谨慎解读gRNA排名基于这些分数,因为它并不一定表明优越的特异性和有效性。

6。CRISPR / Cas9交付方法

作为一种高效、RNA-guided,特定的基因修改工具,CRISPR被广泛使用在许多实验设置来实现所需的突变。然而,交付所需的蛋白质和gRNA Cas9是一个长期的挑战[60]。CRISPR交货的三种方法,包括质粒、病毒,和核糖核蛋白(rnp)被证明成功引入Cas9和gRNA到靶细胞,实现引导基因编辑(11,49,61年]。与他们的各种优点和局限性,这三个交付方法为研究人员提供一个机会来优化他们的基因编辑程序根据不同实验的需要。

6.1。用质粒载体交付

交付使用质粒载体系统是传统的和最受欢迎的方法CRISPR介绍。它的主要优点是简单的在体外。为了引入功能CRISPR系统到目标细胞,细胞需要转染质粒编码Cas9蛋白质,crRNA, tracrRNA同时使用电穿孔或阳离子lipid-mediated交付实现装配CRISPR复杂的细胞(11]。

质粒系统过程是不断简化,其应用范围扩大在活的有机体内动物研究。而不是克隆三个不同的质粒编码三个不同的组成部分,研究人员表明,质粒编码gRNA,融合转录crRNA tracrRNA,足以让Cas9绑定和DNA目标站点识别(10]。最近,质粒编码Cas9和gRNA成为商用。因此,单一质粒的转染是唯一一个CRISPR实验要求。多路复用版的目标位点可以通过同步引入多个gRNA物种单一质粒或cotransfection多个质粒(13]。质粒传递也应用在小鼠肝组织CRISPR应用程序(60,62年]。通过水动力尾静脉注射,质粒是有效地交付给~ 20%的肝细胞瞬时表达。本研究证明了有限的成功基因编辑效率在活的有机体内通过直接质粒交付。

然而,成功交付在体外,质粒的交付系统仍面临重大挑战在活的有机体内应用程序,如交付效率低和频繁的表观遗传沉默游离DNA (63年]。相反,质粒交付提供了双重长期和瞬态CRISPR交付的可能性在体外。在一个小比例的转染细胞,随机但稳定的质粒DNA整合全部或部分进入宿主基因组发生。这可能是由于低水平的自发的DNA损伤,进而提供持续Cas9和gRNA来源(11,49,61年,64年]。当该特性不可取,交付质粒通常变得稀释,逐渐失去了几个细胞周期。这有限的时间窗口基因组工程是至关重要的获取遗传同质细胞群下游功能研究。

6.2。交付使用Lenti、腺病毒、腺相关病毒载体

质粒系统介绍CRISPR细胞系建立有效。然而,扩大CRISPR的应用范围,病毒载体用于CRISPR交在主质粒转染细胞或细胞耐火材料。慢病毒载体稳定整合到宿主基因组中,使之成为首选方式交货,如果需要将目标信息检索功能后选择流程(51,65年- - - - - -67年]。现在可行的执行全基因组,CRISPR-based、功能基因组屏幕提供复杂的CRISPR池试剂到通过慢病毒包装相关的细胞类型。lentiviral-based交付的一个重要限制是病毒基因组的随机整合可能会导致不必要的插入突变干扰宿主基因座。使用nonintegrating病毒载体(NIVVs),包括运载体和腺相关向量,可以有效地规避这个问题,因为他们不包含病毒DNA进入宿主基因组(11,60]。此外,病毒DNA稀释在有丝分裂期间由于缺少一个复制信号(60]。NIVVs、adenoviral和腺相关向量都是潜在的合适的候选人CRISPR交付,因为自然的游离,克隆能力大,高,长期的能力在活的有机体内表达和功能转换许多细胞系(39,49,61年,62年]。

而病毒载体包括Cas9和gRNA表达式磁带可以产生高,包装效率的负相关对单个向量与向量的大小也是挑战的Cas9蛋白质和gRNA。成功的基因编辑通过使用adenovirus-delivered CRISPR在多种哺乳动物细胞。使用不同的gRNA Cas9病毒浓度,研究人员表明,编辑效率是剂量依赖10,61年]。除了稳定的细胞系,转染adenoviral vector-mediated CRISPR交货也可以应用在活的有机体内。通过尾静脉注射腺病毒携带Cas9和gRNA表达式磁带可以引入小鼠肝脏。结果Cas9-mediated基因编辑是稳定甚至在广泛的肝组织再生(13,68年]。相比,水动力尾静脉注射质粒,尾静脉注射腺病毒5 - 8番大编辑实现频率(69年]。这种高效率使得病毒输送CRISPR一个有吸引力的选择在活的有机体内基因修改。然而,使用腺病毒载体系统的交付在活的有机体内可能引起免疫反应,消除感染细胞,最终损害CRISPR基因编辑效率。在最近的一项研究使用adenoviral向量交付,肝细胞的转导率从80.8%下降一天后注射注射后14天的1.4%。这很可能是由于宿主的免疫反应,包括炎性细胞因子的表达升高(31日,69年]。相比之下,腺相关病毒(AAV)诱发一种温和的免疫反应在活的有机体内并能提供长期表达:细胞。最近的研究使用金黄色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)解决了病毒包装spCas9限制问题,使AAV-mediated交付的理想方法在活的有机体内基因组编辑(31日]。

6.3。交付使用Cas9-gRNA核糖核蛋白(rnp)

除了质粒向量和病毒载体交付,交付使用Cas9-gRNA CRISPR rnp是另一个建立方法64年]。两个质粒和病毒交付遇到非目标编辑率高的问题,由于长期Cas9和gRNA细胞的表达。使用直接交付rnp可以有效地规避这个问题。当直接注入细胞、rnp诱导编辑目标地点后立即交付和迅速降解,减少非目标效应(70年,71年]。此外,使用rnp避免干扰的可能性已经没有DNA DNA整合到基因组由于其细胞的交付方式。

RNP交付的应用程序导致成功在多个人类细胞系基因组编辑(64年,72年]。RNP复杂很容易通过孵化在体外纯化Cas9蛋白单链指导RNA (sgRNA)或双由crRNA和tracrRNA RNA。在某些情况下,双RNA被证明是更有效的比单身gRNA [73年]。直接注入RNP复合物进入细胞会导致有效CRISPR-mediated基因组编辑具有高特异性和较低的非目标利率相比,质粒传递(64年]。rnp通常由低吞吐量的方式直接显微镜下注射。最近,使转染的可行性CRISPR rnp进入细胞有效使用电穿孔是证明(72年),以及使用阳离子lipid-mediated脂质体交货(74年]。交付rnp cell-cycle-synchronized细胞也产生了更高的编辑相比,在非同步交付细胞。更重要的是,研究人员可以最大限度地利用一个独特的双链断裂模式(双边带)修复提供rnp进入细胞逮捕了在一个特定的细胞循环阶段(72年]。RNP交付的持续改进使它突出方法不仅基因编辑在实验环境下,而且临床基因治疗的发展。

7所示。CRISPR效率测试

7.1。测试Indel(当地点突变、插入和删除)

当与gRNA组装时,Cas9核酸酶裂解dsDNA和引发双边带。可以修复双边带nonhomologous结束加入(NHEJ)或同源重组(人力资源)。NHEJ是一个容易出错的过程,生成随机插入或删除(indel)突变的DNA重新加入网站。桑格排序是最准确的方法确认indel突变(图2(一个))。然而,由于indels的随机性质,可能存在各种各样的DNA突变后CRISPR-induced NHEJ过程。分离这些分子物种利用分子克隆加上Sanger测序是耗时和cost-inefficient [75年]。最近的进展,生物信息学工具(如潮,跟踪Indels的分解)启用成功的数字解码Sanger测序从复杂的混合物Indels,所产生的一种独特的CRISPR-targeting事件到单独的变异物种(76年- - - - - -78年]。虽然这种方法仍然是有限的敏感性和大规模还有待验证,桑格测序的局部放大,目标轨迹提供了一种快速和可靠的读出确认任何CRISPR实验的效率。没有测序,细微的差别的DNA分离长度(造成一些indels)在桑格定序器可用于快速访问的成功基因编辑实验。IDAA (Indel扩增子的检测分析)最近被开发来填补这个利基(79年]。通过使用有针对性的引物在目标站点,侧面可以检测出不同大小的扩增子(79年]。此外,其他几个方法,利用NHEJ-induced indels开发有效评估裂开的效率通过indel突变的检测目标CRISPR位点的DNA长度变化;这些包括土地测量员核酸酶测定,T7核酸内切酶(T7E1)测定,高分辨率分析(HRMA)融化,PAGE电泳(80年- - - - - -85年]。

测量员,T7E1和其他nuclease-based突变检测化验依靠本地的形成不匹配heteroduplex DNA序列变异的副产品造成NHEJ后指定目标核酸酶(图2 (b))。如果CRISPR-mediated乳沟成功,将生成indels在争端解决机构通过NHEJ网站。Heteroduplex DNA可以融化后形成rehybridizing突变体和野生型等位基因。mismatch-recognizing酶,如验船师和T7E1核酸酶,可以检测heteroduplex DNA。噬菌体游离酶T7E1识别和劈开扭曲dsDNA发生构象变化86年]。验船师核酸酶是一个识别的单链核酸酶核苷酸indels引起的不匹配。它不仅劈开一个链DNA 3′末端,但也包含5′核酸外切酶活性(87年,88年]。酶识别indels和诱导双边带在网站不匹配,导致缩短各种大小的DNA片段。消化的DNA片段可以可视化使用凝胶电泳或DNA片段分析(82年,88年]。然而,酶表现出低水平的随机单链核酸酶活性,导致未指明的乳沟。可以部分解决这个问题通过添加Ampligase核酸酶在酶反应(89年),它可以降低非特异性核酸酶的活动。

HRMA indel检测是另一种工具,利用不同的变性的heteroduplex DNA比同源双链DNA(图2 (c))[90年]。如果CRISPR-induced indel存在于模板DNA, heteroduplex和同源双链DNA将融化后形成,rehybridizing突变和WT等位基因。不同的双物种表现出不同的变性模式。HRMA记录与温度有关的变性概要文件的样本,并确定heteroduplex DNA的存在基于不同模式从样本混合融化。由于其灵敏度,HRMA需要适当的优化PCR条件以确保高特异性的目标放大。

基于聚丙烯酰胺凝胶电泳-(页面)的方法最近被证明是有效的在检测heteroduplex DNA(图的存在2 (d))[85年]。该方法利用heteroduplex迁移速度的区别和同源双链DNA在本地页面。Heteroduplex DNA通常迁移速度慢得多的indel-induced开放角之间的匹配和不匹配的DNA链,因此可以使用页面可视化。然而,页面分析是否提供了足够的灵敏度在indel突变的光谱变化还有待验证。

7.2。敏感性问题和记者

虽然CRISPR被认为是一个精确的基因编辑方法,CRISPR效率差别很大,当应用到不同的地点和不同的细胞类型。在诱导多能干细胞(iPS)细胞和人类胚胎干细胞(为),例如,CRISPR-editing效率通常低于1% (91年,92年]。这种低频率增加的需求更敏感的罕见的基因突变检测方法。桑格测序是确定目标的黄金标准版效率,然而这是一个耗时、耗资源的过程。当突变速率低于给定的阈值(通常~ 1%),常规诱变检测方法(桑格测序,nuclease-based heteroduplex乳沟化验,HRMA,和页面)的有限使用由于其敏感性限制。高通量测序了罕见的精确测量indels发生频率为0.01 -1%。然而,由于该方法比传统方法更敏感(比如mismatch-recognizing酶)假阳性频率也高(75年]。

单分子实时(SMRT) DNA测序已经开发成一个独特的高通量测序平台(93年]。它的优点是灵敏度高和长读长。常规PCR扩增的结扎和SMRT适配器创建一个单分子SMRTbell模板来生成顺序读取。这种方法不仅检查编辑事件的存在,而且量化的频率编辑通过NHEJ或人力资源。平均测序长度3 kb和15 kb, SMRT测序提供了一个可靠的方法来评估目标和非目标罕见的编辑效果。同样,其他高通量测序平台可以应用于量化indels扩增子目标。

进一步评估CRISPR-editing效率使用非常罕见的编辑事件的准确量化,数字滴PCR (ddPCR)可以应用于CRISPR-edited基因组测试(94年]。根据分析格式,ddPCR分析理论突变检测的范围限制在0.01 ~ 0.001%。实现个人的评估基因组编辑,样本DNA通过乳液分割成小水滴。一套引物在感兴趣的区域和两个侧面竞争fluorescence-tagged调查针对野生型和突变体序列,分别包含在反应。个体在每个液滴进行PCR反应,随后记录从每个液滴和荧光信号。野生型和突变序列是有区别的,编辑的频率可以根据数量计算液滴具有不同的荧光信号91年]。这种方法允许罕见突变的极其敏感的检测以及准确的量化CRISPR-editing效率。小说ddPCR应用探讨了在其他的研究中,包括区分野生型和突变体大小的基础上使用非特异性扩增子,双链DNA结合染料EvaGreen(如)95年]。

除了量化CRISPR-induced indels住记者,基于人力资源可用于可视化CRISPR活动。通常,一个记者质粒向量序列可以包含相同的目标站点设计的目标轨迹。CRISPR目标荧光蛋白记者的两侧是两个独立的部分,有一段一个相同的序列包括两部分。因此,这个记者是不活跃的由于荧光蛋白基因被插入的序列。CRISPR组件和记者cotransfected质粒。有效gRNA加载Cas9分裂染色体定位轨迹和游离reporter-targeting网站。记者,争端解决机构将通过人力资源修复两部分之间的荧光蛋白,从而呈现一个功能齐全的荧光蛋白。因此,记者质粒的“在”状态,表现出细胞荧光信号的增益,可以给一个实时读出CRISPR效率在活细胞中独立的额外的分子分析。

8。选择突变克隆

纯从单个祖细胞克隆隔离是一个关键的步骤,突变的基因和功能特性通过CRISPR / Cas9系统来实现。虽然它通常是最费力、耗时的步骤CRISPR-based基因组工程使用细胞模型,生成克隆突变细胞系是绝对需要任何固体得出结论关联一个给定的基因突变和细胞的行为。每一个细胞,激活的介绍Cas9核酸酶,是一个独立的单元,进行随机基因变化依赖于nuclease-induced DNA损伤和随后的细胞DNA修复反应。在瞬态的情况下引入CRISPR代理,需要建立单独使用文化的结论CRISPR行动。在干细胞研究领域,一个单独的文化常常是令人困惑的球体产生文化,如胚胎干细胞形成胚胎的身体或neurospheres从神经干细胞96年]。虽然这些sphere-forming化验经常用来估计干细胞自我更新和分化的能力,个人领域形成标准的干细胞培养条件不一定从单个细胞(97年),因为球聚合和融合甚至经常被发现在低播种密度(98年- - - - - -One hundred.]。clonogenity CRISPR操作之后的需求通常要求更严格的培养条件,以确保适当的克隆不同的同系的分离池。

有多种方法来实现clonogenity。为了防止球体融合,单个细胞可以被封装成半固体矩阵形式嵌入式领域的文化(101年]。这种方法改善了clonogenity球体的生成和细胞增殖时提供了更大的优点是严格依赖于高细胞密度在文化98年]。然而,单细胞封装通常需要特定的微流体设备(102年]。此外,维护胶囊完整性和检索封装细胞仍然具有挑战性。除了细胞封装、细胞生长在半固体的媒体,比如含有甲基纤维素或软琼脂,迁移的可能性更小(103年]。播种在低密度时,单个细胞在半固体的媒体会随着时间成长为独立的殖民地。手动或自动选择这些殖民地可以随后建立同基因的克隆。传统的劳动密集型的方法建立文化从单个细胞包括克隆环,连续稀释和电镀,fluorescent-based单细胞排序(104年,105年]。不管方法,建立和维护大量的同基因的细胞克隆是昂贵的和劳动密集型的。对于大多数基因工程实验,所需的最佳方法应该减少同基因的细胞克隆的数量需要达到所需的基因改造。在下面几节中,将讨论为了实现这一目标的因素。

8.1。总体战略,NHEJ或人力资源

双边带在真核生物基因组中可以修复主要是由两个不同的机制:NHEJ或人力资源。NHEJ修复机制加入了染色体同源序列的指导直接结束。因为它缺乏一个参考模板,这修复途径通常是容易出错的由于本地修复的DNA序列改变结(所谓的indels) (106年]。相比之下,人力资源修复机制是由使用同源序列作为辅助修复模板。这个同源序列可以是姐妹染色单体复制在合成(S)阶段的细胞周期,同源染色体的二倍体细胞,或外国DNA引入轴承的区域和目标轨迹序列的同源性。由于人力资源修复捐赠者选择的灵活性,一个给定的轨迹与理想的特性(比如限制性内切酶识别网站,蛋白质融合标签,抗生素选择标记,或重组网站)可以通过整合这些功能设计用一块介绍DNA同源。质粒构建或可以用作供体DNA寡核苷酸合成模板(40]。质粒捐献者可以使用当长插入需要介绍107年,108年]。对于小插入或删除,单链DNA包含80个基点同源臂5′和3′末端是首选107年]。这种方法类似于传统HR-based基因打靶。然而,由于引入了双边带发生在染色体DNA而不是epichromosomal DNA,人力资源效率通常是几个数量级高于传统人力资源由打破外国捐赠者3,108年- - - - - -111年]。

虽然dna修复途径的选择很大程度上超出了实验控制,双边带发生的细胞循环阶段确定修复机制中起着重要的作用。一般来说,人力资源发生在合成(S)和premitotic (G2)阶段当有姐妹染色单体(112年]。NHEJ是主要的修复机制在增长1 (G1)和有丝分裂(M)阶段(113年]。虽然这一般指导方针适用于大多数情况下,预防措施是保证任何特定细胞类型的能力在人力资源或NHEJ-based dna修复途径。

不管首选的dna修复机制来得到一个特定的或一系列的突变,类似的单独选择过程是必要的。因为人力资源通常发生在一个较低的频率比NHEJ对于大多数细胞类型,它是一种有效的策略,包括选择标记供体构建,以便成功基因工程细胞可以很容易地追踪通过荧光或耐药性。标志是集成到靶向位点。在某些情况下,该特性不理想下游功能分析,即使大多数的选择标记可以被可随后切除。

几个无缝基因工程应用程序出现在过去几年来克服这个障碍。这只优雅的方法旨在介绍所需的基因改造额外的足迹而留下的改造基因座(包括indels CRISPR削减网站,任何选择标记,或短标记切除后剩余重组网站)(图3)[24,114年,115年]。为了便于克隆选择,选择标记包含在DNA供体类似传统的人力资源。然而,而不是使用一个重组酶诱导侧翼重组网站标志,这将至少留下一个复合站点(图3(一个)),一个优化PiggyBac转座子是用于所有外源序列之间的同源性武器。只剩下一个“TA”二核苷酸序列是两边侧面退出PiggyBac(图3 (b))。为了真正无缝的,左右同源序列开始“助教”的主题,这是在大多数基因位点丰富。如果没有内生“助教”的突变,它通常是可行的介绍翻译蛋白质序列的一个不改变外显子或使这种变化在mutation-tolerating内含子。消极的选择标记通常是包含在PiggyBac盒的设计DNA供体促进筛查PiggyBac盒式的转座酶的损失。这种方法为CRISPR-mediated带来了特有的基因治疗,因为避免任何额外的序列修改是非常可取的。

不管选择的方法,单独使用克隆分离和鉴定是劳动密集型的。设计最有效的筛选策略,实际估计至关重要的机会获得所需的突变细胞池中进行CRISPR-mediated基因组工程。的效率是一个关键因素CRISPR针对感兴趣的轨迹,这可以通过一个小规模的试点实验测试使用突变检测方法在前一节中讨论。根据dna修复途径的模式选择,可以进一步考虑关于是否可行的首次减少细胞池的大小选择丰富目标细胞克隆试验。分离细胞阳性HR-mediated live-cell乳沟记者可以丰富NHEJ-mediated indel突变(116年]。虽然这些都是通过不同的DNA修复机制,记者分析可能表明CRISPR的分组人口的细胞更加活跃。同样,如果使用人力资源修复所需的介绍了突变,包含选择标记的DNA供体可以是一个有效的方法来减少克隆选择池的大小。频繁,目的突变可能与高信心导致预测特定的靶细胞类型的细胞表型。如果特定的细胞表型能可靠地用于选择、靶细胞浓缩可以通过应用这种选择压力(117年]。没有高效CRISPR试剂,目标选择方案需要移动突变频率在0.1%以上,为了使克隆单细胞选择可行的。

在诱变频率较低的情况下,没有合适的选择策略用于突变浓缩,随机细胞分区方案命名sib-selection可以用来促进所需的突变前的浓缩克隆隔离(91年,118年]。Sib-selection基于突变频率的精确测量池的细胞即使率极低。ddPCR方法被用于这个目的来获得一个可靠的定量突变率。当一个细胞混合物池与一种罕见的突变是随机顺序划分成小池(如不同井在96孔板),变异率在一个或几个小池将显著增加,由于细胞的总体显著减少池遵循泊松分布。这些丰富的功能定位井使用定量测量突变可以促进串行池分区和突变体鉴定,直到所需的突变体的速度超过实际克隆识别阈值。尽管一个强大的和快速的方法来丰富突变,sib-selection不是一个单独的过程本身。因此随后克隆突变菌株鉴定需要隔离的目的突变细胞。

8.2。估计非目标突变孤立的细胞克隆

获得纯细胞群与所需的基因修改不应视为最后一步之前使用功能研究这些细胞模型。无论多么小心翼翼地实验设计,很有可能一些偏离修改被CRISPR引入细胞池。如果这些进行到最后选择克隆,这些额外的基因修改可能会进一步复杂化功能分析。

全基因组测序的孤立的细胞克隆仍是最严格的标准来估计非标靶病变(119年- - - - - -121年]。它仍然是昂贵的,特别是对人类细胞,因为完整的基因组需要重大的测序深度检测低频indels的发生。而其成本禁止常规使用检查所有孤立的细胞克隆在一个典型的实验室,一个合理的近似通常可以由目标序列预测脱靶的网站。可以以低吞吐量的方式使用PCR和桑格测序的个体有重要目标概率预测非目标网站。另外,多路复用下一代测序目标可以通过覆盖大量的非目标网站同时从多个单细胞克隆与重要的测序深度(46,122年]。的情况有针对性的测序,检测基因组区域的选择变得至关重要。而不同在网上平台提供一个粗略的估计潜在的非目标网站,最新进展在全基因组断点测序技术(如CHIP-Seq [43,122年],Digenome-seq [123年]和GUIDE-seq [124年),和全基因组易位测序125年])提供了一个更现实的一系列潜在的非目标网站在任何给定的基因组。虽然这些平台都可以援助目标基因组测序的基因工程细胞,预防措施仍然是必要的因为脱靶CRISPR目标可以影响不同的细胞基因组序列的使用和细微的差别126年]。一些额外的实用措施应考虑,特别是当不良脱靶病变特征不够或难以避免。

8.3。相关的表型和基因型控制

当某一表型CRISPR-mediated编辑后显示clonogenically孤立的突变细胞,造成的表型不一定是目标由于糟糕的可能性非标靶病变特点。基因型和表现型协会可以加强验证使用额外的单独使用克隆携带独立突变所产生的不同CRISPR代理商针对相同的轨迹。因为相同的非标靶病变可能生成的gRNA相同,不可能严格排除这种可能性依靠额外的由单个gRNA克隆生成的。因此,需要额外的gRNA实现感兴趣目标的同一地区相同的表型结果。有限的重叠的非目标网站,多个gRNA设计确保任何共享表型展出后编辑使用所有gRNA与感兴趣的基因型与高的信心。除了为CRISPR建立适当的控制目标、遗传营救被认为是黄金标准正式建立表现型和基因型之间的因果关系。损失函数的突变,将完整的目标基因或基因产物引入基因工程细胞应服务于目的。感兴趣的基因重新引入内生工程由CRISPR位点很容易实现(127年- - - - - -129年),是可取的,因为救援遗传物质是内生转录控制。在功能的情况下的突变基因救援是难以实现的,制药基因功能验证方法是有用的。微调的功能给定目标或相关通路独立使用特定药物可以提供良好的支持证据。

9。一个更光明的未来的干细胞模型

大规模的人类基因测序工作的积累在过去的几年中大大加速遗传发现连接在人类遗传变异发现或变异体细胞组织疾病状态。干细胞模型,另一方面,传统上非常强大的基因型和表现型之间建立机械的联系。最近的爆炸的应用CRISPR / Cas9基因编辑技术现在建立了基因型和细胞行为之间的因果关系以极大的灵活性和效率。虽然我们目前的审查可以掌握全部和这些应用程序的快速进化,一些著名的例子下面突出来展示这些应用程序的范围和深度。

最早的成功CRISPR在干细胞研究中的应用是正确CTCF培养肠道干细胞的突变囊性纤维化(CF)患者(130年]。除了修复本地序列错误,CRISPR最近被用于正确的染色体结构异常(染色体倒置在several-hundred-kilo-base-pair)与血友病相关(131年]。利用干细胞模型(特别是patient-derived万能干细胞),CRISPR用于正确的十多个疾病有关的基因病变范围很广(115年,130年- - - - - -143年),包括代谢紊乱、免疫缺陷和神经肌肉疾病。这些基因修正,patient-derived干细胞可能是未来的细胞和基因疗法的关键载体,进一步改善其安全性。

不管它的治疗潜力,CRISPR是一个宝贵的工具建立基因和干细胞的行为之间的因果关系。聪明的集团最近建模4最频繁的发生突变的上下文中识别人类大肠癌人类肠道干细胞瀑样文化。这种分析使他们能够确定司机突变引起广泛的非整倍性在这个癌症干细胞模型(117年]。CRISPR也有助于确定一个具体的单核苷酸多态性(SNP)在人类FTO轨迹作为肥胖的关键效应(144年]。以前的全基因组关联研究表明FTO地区港口最强的基因与肥胖协会,虽然没有机械协会之后才能得出结论。FTO的SNP位点进一步敲定的导致肥胖的变体。建模这一个核苷酸的转换在同基因的的背景下,使用CRISPR patient-derived preadipocytes提供之间的关键联系单核苷酸替换和独特的脂肪细胞的分化程序:产热的米色脂肪细胞与消耗白色脂肪细胞。这个干细胞模型,结合CRISPR-mediated基因组编辑的力量来改变一个特定核苷酸在人类基因组中,帮助解决一个最长的站在人类遗传学秘密。因此,我们非常热情的为一个更光明的未来制造和使用干细胞类似机械的研究模型。

缩写和首字母缩写

ZFN:	锌指核酸酶
取得:	故事域转录activator-like效应核酸酶
CRISPR / ca:	集群定期空隙回文重复/ CRISPR-associated
tracrRNA:	Transactivating CRISPR RNA
crRNA:	CRISPR重复RNA
帕姆:	Protospacer相邻的主题
RNP:	核糖核蛋白
gRNA:	指导RNA
dsDNA:	双链DNA
双边带:	双链断裂
NHEJ:	Nonhomologous结束加入
人力资源:	同源重组
页面:	聚丙烯酰胺凝胶电泳
HRMA:	高分辨率分析融化
CHIP-Seq:	染色质免疫沉淀反应测序。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Bing风水和利兹·埃尔南德斯Matias同样起到了推波助澜的作用。

确认

作者感谢丽莎·m·安提拉,克丽丝蒂西蒙斯,艾莉森Seemann论文准备的援助。他们感谢宋Heon Lee博士和梅奥诊所的医学中心表观遗传学发展实验室试剂和技术支持。这项工作是支持的梅奥诊所的医学中心。梅奥诊所的工作是由一个夏天本科生研究奖学金Bing风水,LSAMP桥梁博士群X NSF资助奖(hrd - 1400870)丽埃尔南德斯马蒂亚斯,梅奥诊所新调查员创业基金,Richard f . Emslander职业发展奖项,梅奥医学中心易郭博士发现平台奖。

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