MSX1在人牙髓干细胞的成骨分化

文摘

Msh同源框1 (MSX1)编码转录因子参与胚胎发育的四肢和颅面组织包括骨骼和牙齿。尽管MSX1调节成骨细胞分化的颅骨骨年轻的动物,是知之甚少的贡献MSX1人类细胞的成骨的潜力。在目前的研究中,我们调查的角色MSX1成骨分化的人类从乳牙牙髓干细胞隔离。这些细胞暴露于osteogenesis-induction介质时,runt-related转录因子2(RUNX2),骨形态形成protein-2(BMP2),碱性磷酸酶(ALPL),骨钙素(OCN)信使rna水平,以及碱性磷酸酶活性,增加4 - 12天,此后矩阵是钙化14天。然而,降价MSX1小干扰RNA废除osteoblast-related基因表达的诱导,碱性磷酸酶活性和钙化。有趣的是,DNA微阵列和PCR分析表明MSX1可拆卸的诱导固醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)转录因子和其下游靶基因的胆固醇合成途径。抑制胆固醇合成增强多种间充质细胞的成骨细胞分化。因此,MSX1基因表达下调可能胆固醇synthesis-related确保人类牙髓干细胞的成骨细胞分化。

1。介绍

Msh同源框1 (MSX1)是一个同源框转录因子参与limb-pattern形成和颅面发展,尤其是牙发生。鼠标Msx1突变引起颅面畸形,牙齿发育不全1]。Msx1基因敲除小鼠显示逮捕了牙齿发育在萌芽阶段和胚胎致命缺陷(2]。Msx1表达高水平的颅面骨骼细胞在产后早期发展(3,转基因小鼠表达Msx1阿尔法(I)的控制下胶原蛋白启动子表现出成骨细胞数量增加,细胞增殖和细胞凋亡4),这表明Msx1在颅面骨建模可能有作用。MSX1也表示在牙齿间质高水平限制和贝尔阶段(5),可能是抑制细胞分化,维护间充质细胞增殖状态,确保强劲的颅面和牙齿发育6]。此外,MSX1骨形态形成蛋白的上游和下游调节器BMP2 / BMP4信号通路(7,8]。基因突变在人类MSX1也导致唇裂/口感和牙齿发育不全(9,10]。然而,MSX1的作用在人类颅面和牙齿发育尚未完全了解。

牙髓基质细胞分离出整个果肉组织可以分化为成骨细胞,成,内皮细胞、神经细胞、脂肪细胞在体外。这些细胞被几个细胞表面抗原被称为牙髓干细胞(DPSCs) [11,12]。DPSCs可能发挥作用在牙质生成/骨在发展中国家和受伤的牙齿。此外,这些细胞是一种很有前途的细胞来源再生治疗牙齿,骨骼、血管、神经疾病(13,14]。人类DPSCs (hDPSCs)尚未完全在分子水平上的特征,但之前的报告显示MSX1上级表达hDPSCs比骨骨髓来源间充质干细胞和成纤维细胞15]。MSX1可能参与的控制主要或次要牙质形成和修复牙质或osteodentin /骨形成在受伤的牙髓组织,除了生理作用,如维护健康的牙齿牙髓干细胞/祖细胞。在目前的研究中,我们探讨了MSX1在牙髓的间充质细胞使用人类DPSCs文化。

他汀类药物是一类药物功能的特定抑制剂3-hydoroxy-3-methylglutaryl-CoA(β)还原酶、胆固醇合成的病原反应酶。众多研究表明,他汀类药物对骨合成代谢影响成骨细胞和成骨前体细胞(16,17]。辛伐他汀增加牙槽骨改建的拔牙套接字(18),提高骨折愈合(19),减少牙槽骨丢失和牙齿移动在慢性牙周炎20.]。此外,辛伐他汀增强成牙质细胞/ DPSCs和间充质干细胞的成骨细胞分化与其他组织(17,21,22]。这些研究表明胆固醇合成和成骨细胞分化之间的密切关系。

在这里,我们表明MSX1在成骨细胞分化的作用,胆固醇合成hDPSCs使用小型干扰RNA (siRNA)MSX1。DNA微阵列分析显示,击倒的MSX1在hDPSCs经历成骨分化废除各种osteoblast-related基因的表达但增强胆固醇synthesis-related基因的表达。我们的研究结果表明,MSX1增强成骨细胞分化和钙化hDPSCs通过抑制胆固醇合成基因,诱导osteoblast-related基因。

2。材料和方法

2.1。人类DPSCs

收集提取健康的乳牙6-12-year-old儿童道德当局批准的协议后广岛大学(许可证号码:D88-2)。书面知情同意了从主题或主题的父母。从乳牙牙髓组织标本被剁碎,与3毫克/毫升胶原酶消化I型(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)和4毫克/毫升dispase(罗氏诊断,曼海姆,德国)杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)1 h在37°C。单个细胞悬液是通过细胞通过一个70年μm细胞过滤器(美国纽约康宁,康宁公司)。这些细胞被孵化20%胎牛血清的DMEM补充(的边后卫;penicillin-streptomycin擤鼻涕,Nuaille,法国)和1%(技术)在95%的空气和5%的公司37°C₂(23]。形成菌落分离通过孵化Accutase (Funakoshi有限公司,东京,日本),和孤立的细胞转移到通过文化与DMEM penicillin-streptomycin的边后卫补充10%和1%。培养基是改变每2天。细胞通道3 - 9被用于后续的实验。

2.2。流式细胞仪分析

细胞收获Accutase和固定在4%多聚甲醛。在1500×g细胞离心5分钟和resuspended细胞在PBS /毫升含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)。包含10个整除⁵细胞培养与单个藻红蛋白(PE)共轭PE-conjugated IgG抗体或同形像控制κ在室温下30分钟,然后洗在PBS补充3%的边后卫。样本使用流式细胞仪分析咏叹调流式细胞分析仪(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)和数据分析使用CELLQUEST软件(正)。以下使用单克隆抗体:PE-conjugated抗体CD73(鼠标IgG1κ;美国圣地亚哥Biolegend CA), CD90(鼠标IgG1κ;Biolegend)、CD105(鼠标IgG1κ;Biolegend)和存在(鼠标IgG1κ;美国德州圣克鲁斯生物技术)。控制鼠标IgG1 PE-conjugated同形像κ(Biolegend)是用作控制。

2.3。MSX1可拆卸的

MSX1 siRNA寡核苷酸(s8999和s224066)购买来自生活的技术。序列是5′-GCAUUUAGAUCUACACUCUtt-3′(意义)和5′-AGAGUGUAGAUCUAAAUGCta-3′(反义)s8999和5′-GCAAGA AAAGCGCAGAGAAtt-3′(意义)和5′-UUCUCUGCGCUUUUCUUGCct-3′s224066(反义)。消音器选择负控制# 1核(技术)是用作控制。

人类DPSCs被播种细胞/在24-multiwell板涂有I型胶原为0.5毫升DMEM补充10%的边后卫。24小时后,核转染到细胞Lipofectamine 2000(技术)和细胞培养48 h。

2.4。成骨分化hDPSCs和茜素红染色

文化成为支流之后,hDPSCs孵化与0.5毫升的DMEM补充10%的边后卫,10毫米甘油磷酸酯(东京化工有限公司,东京,日本),50μg / mL抗坏血酸2-phosphate(σ),2毫米谷酰胺(σ),100 nM地塞米松(σ),和1%的青霉素和链霉素(osteogenesis-induction介质)所描述的15]。评价钙化,细胞孵化osteogenesis-induction媒介14天是固定在95%乙醇室温下10分钟,染色茜素红S 30分钟为1%。cell-matrix层与无菌水洗6次。

2.5。碱性磷酸酶活性

人类DPSCs洗两次盐水和均质超声与NP-40 1%生理盐水。碱性磷酸酶活性测定使用实验室化验高山(Wako,大阪,日本)。与Quant-iT DNA浓度决定™PicoGreen dsDNA分析工具(技术)来计算/碱性磷酸酶活动μg DNA。

2.6。反向Transcription-Quantitative聚合酶链反应(RT-qPCR)

总RNA是孤立和互补脱氧核糖核酸合成[描述15]。互补脱氧核糖核酸样本放大使用通用PCR大师混合与引物(表(技术)1)和TaqMan调查从罗氏诊断购买(瑞士巴塞尔)。GAPDH引物和探针用于规范化。经过放大的DNA,表达水平测定ABI棱镜7900 HT序列检测系统(技术)。

2.7。DNA微阵列

诱导成骨分化后4天,总RNA隔绝MSX1-knockdown和控制hDPSCs使用试剂盒(生命技术、日本)和一个RNeasy迷你包(试剂盒,就是查,CA)。DNA微阵列分析使用SurePrint G3人类通用电气K v2微阵列(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。原始数据标准化的全球平均归一化法使用GeneSpring(硅遗传学、雷德伍德城、钙、美国)。原始数据被存入基因表达综合数据库(GSE69992)。

2.8。统计分析

结果表示为平均数±标准差。两组之间的差异进行了分析通过双向方差分析和图基的事后测试多个比较。在所有的分析,显示显著差异值。

3所示。结果

3.1。间充质干细胞培养hDPSCs标记

人类从产后DPSCs乳牙被用来探索MSX1的功能作用。这些细胞表现出成纤维细胞的形状(图1(一))和显示表达间充质干细胞表面标记CD73 (> 90%), CD90 (> 90%)、CD105(> 10%),和存在(> 30%)(图1 (b)),预计从先前的研究24]。

3.2。MSX1可拆卸的废除hDPSCs成骨分化

人类DPSCs与两个不同的siRNAs转染MSX1或控制核,然后暴露于osteogenesis-induction媒介。小干扰rna寡核苷酸两个目标MSX1(s8999和s224066)废除MSX1mRNA表达在48 h和随后的矩阵钙化14天(图2)。我们选择MSX1为后续研究核(s8999)。

接下来,我们检查的影响MSX1廉价的碱性磷酸酶活性和osteoblast-related基因的表达在hDPSCs出现骨(图3)。在hDPSCs转染与控制核,碱性磷酸酶活性和RUNX2,BMP2,osterix(OSX)骨钙素(OCN;也被称为BGLAP),肝型碱性磷酸酶(ALPL)mRNA水平增加天4 - 12后分化。MSX14 - 12 mRNA水平也增加了天。然而,MSX1可拆卸的废除碱性磷酸酶活性(图的感应3(一个))和增加ALPL,RUNX2,BMP2,OCN,MSX1信使rna水平,尽管它进一步增加OSX信使rna水平(图3 (b))。应该注意的是,孵化与MSX1 siRNA废除MSX1表达式至少直到一天12后的成骨分化。

接下来,我们检查是否MSX1降价可能会影响其他主基因的表达包括软骨形成的主监管机构SOX9和脂肪生成的主调节器PPARγ(图4)。控制hDPSCs,无显著变化的表达式SOX9和PPARγ观察后接触osteogenesis-induction媒介。在这种情况下,MSX1击倒的表达增加PPARγ在4 - 8人,尽管它的表达水平没有影响SOX9。

3.3。MSX1可拆卸的表达下调和调节多种基因

特征的影响MSX1击倒在成骨分化,我们进行DNA微阵列分析接触osteogenesis-induction介质后4天。MSX1可拆卸的减少和增加2923和3480个基因的mRNA水平,分别是选择的截止值> 1.5倍和改变以及。表2和3显示列表的表达下调和调节基因MSX1分别击倒hDPSCs。

理解MSX1行动hDPSCs分化为成骨细胞,我们进行了基因片段的方法使用2923表达下调和3480调节基因。WikiPathways分析表明MSX1可拆卸的各种基因表达下调参与焦点粘连,软骨内骨化,integrin-mediated细胞粘附,基质金属蛋白酶、钙调节,和胰岛素信号(表4),而它在固醇调节元件结合蛋白调节基因(如)信号,胆固醇生物合成、脂肪形成和脂肪酸生物合成(表5)。这些发现表明MSX1 hDPSCs分化成为成骨细胞调节各种细胞过程。

3.4。MSX1可拆卸的移植胆固醇Synthesis-Related基因

在MSX1击倒hDPSCs”,如信号”和“胆固醇生物合成”前1日和3日调节基因集,分别为(表5)。SREBP2主转录因子调节所有基因编码酶的表达在胆固醇合成途径(25]。与成骨细胞分化[因为胆固醇合成密切相关17),我们检查的影响MSX1可拆卸的这些基因的表达。DNA微阵列分析表明,所有胆固醇synthesis-related基因,包括SREBP2,明显调节MSX1第四天(图击倒5(一个))。定量rt - pcr分析确认MSX1可拆卸的增加SREBP23-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA合酶1(HMGCS1),β-还原酶(HMGCR),通过二磷酸合酶(FDPS)细胞色素P450家庭51亚多肽1(CYP51A1),7-dehydrocholesterol还原酶(DHCR7)信使rna水平(图5 (b))。

4所示。讨论

先前的研究显示,老鼠MSX1与颅面骨发育(1,2,4]。在小鼠胚胎,MSX1抑制早熟的牙间充质细胞分化和钙化和维护这些细胞增殖状态,以确保后续颅面和牙齿发育6,26]。高水平的成骨细胞数量、细胞增殖和细胞凋亡在MSX1转基因老鼠表明MSX1调节小鼠颅面骨建模(4]。然而,MSX1在人类细胞中的作用仍然知之甚少。在目前的研究中,我们表明,MSX1 hDPSCs成骨分化中发挥着重要作用。

在人类DPSC文化,MSX1可拆卸的导致压抑的表达RUNX2,ALPL,BMP2,OCN。这些结果说明MSX1调制的主要信号/转录途径调节很难提高hDPSCs成骨的潜在的组织分化。然而,MSX1可拆卸的意外的mRNA水平增加OSX,另一个转录因子参与了成骨细胞的成熟。这表明MSX1不激活整个骨生成程序,也许是因为MSX1合作与其他转录因子完全控制骨生成。MSX1可拆卸的增强PPAR 表达osteogenesis-induced条件下,表明MSX1负调节脂肪形成的分化。MSX1可能直接hDPSCs阻止他们的成骨细胞谱系分化脂肪形成的血统。MSX1击倒的各种差别也导致了对这些基因参与焦点粘连,integrin-mediated细胞粘附、基质金属蛋白酶、钙调节胰岛素信号,和其他进程。的广泛影响MSX1可拆卸的整个基因表达谱强调MSX1的至关重要的作用hDPSCs经历分化成成骨细胞。

双向的转录Msx1基因之前已经报道过(27- - - - - -29日]。在胚胎和新生鼠,感觉和反义Msx1成绩单是在开发过程中不同的表达。705年ic5成老鼠,过度的Msx1反义RNA的表达下降Msx1成绩单,而过度的Msx1感觉RNA增加Msx1反义转录。因此,老鼠的表情Msx1由两个记录的平衡控制。然而,在我们的实验中,MSX1反义转录并没有发现在成骨分化hDPSCs无论siRNA击倒MSX1(数据没有显示)。的存在MSX1反义转录在人类迄今为止只在胚胎报道。因此,Msx1反义RNA似乎并没有参与hDPSCs MSX1表达式。在这些条件下的表达Msx1成绩单是明显感觉抑郁与MSX1 siRNA hDPSCs治疗后,表明可拆卸的实验工作适当的存在与否无关Msx1反义转录。

MSX2, MSX1假字,提高各种间充质细胞的成骨分化,包括C3H10T1/2细胞和主动脉myofibroblasts [30.- - - - - -32]。MSX1和MSX2激活主动脉外膜osteoprogenitors通过重叠但不同的机制(33]。MSX2 MSX1不同,增强了OSX表达式没有增加RUNX2表达在主动脉myofibroblasts [30.),表明不同的行动MSX1和MSX2成骨细胞分化。

MSX1激活分化的分子机制程序尚不清楚。MSX1调节目标基因的转录活动通过直接绑定到特定DNA MSX1-binding主题(C / GTAATTG)或通过与其他转录监管机构之间的互动。有趣的是,MSX1结合各种转录监管机构,包括Sp1, Sp3, Dlx3, Dlx5, PAX3, PAX9, BarH-like同源框1 / BARX1,和PIAS134- - - - - -37]。根据复杂的合作伙伴,MSX1激活或MSX1-interacting压制转录的转录因子网络(26,38]。此外,MSX1修改染色质结构目标基因附近的组蛋白甲基化(35,39]。MSX1各种转录监管机构的相互作用可能占的许多基因的表达水平的变化(6400年~)MSX1可拆卸的。

他汀类药物,治疗高脂血症,提高各种间充质细胞的成骨分化,包括成骨细胞前体细胞,间充质干细胞,DPSCs,通过抑制焦磷酸通过法的合成,减少细胞胆固醇,和激活Ras-PI3K-Akt / MAPK信号通路,从而增加BMP2和RUNX2的表达17),虽然底层机制仍存在争议。他汀类药物也抑制破骨细胞功能和增强下颌骨形成在活的有机体内(40]。有趣的是,一项研究表明,辛伐他汀引起hDPSCs成牙质细胞分化在体外和在活的有机体内(22]。但是,没有研究显示的参与转录因子(s)在控制胆固醇的合成,在成骨细胞分化。我们首次发现MSX1抑制成骨细胞分化的整个胆固醇合成途径hDPSCs压抑SREBP2和其他相关的基因。这种抑制胆固醇合成可能促进成骨细胞分化。它也是有趣的注意,各种突变胆固醇合成途径,包括7-dehydrocholesterol还原酶(DHCR7)导致颅面畸形包括腭裂,胆固醇合成在颅面发育的作用41]。

总之,我们首次透露,MSX1是必不可少的osteoblast-like分化和钙化hDPSCs来自乳牙。此外,MSX1发现调节多种基因,包括胆固醇synthesis-related基因,在hDPSCs成骨分化。我们没有检查的影响MSX1 siRNA在明确的牙齿,尽管MSX1也可能作为积极的监管机构明确骨生成的牙齿MSX1 mRNA水平很高权威和乳牙(15]。我们的研究结果将提供洞察MSX1在发展中的作用和修复牙齿,可能是有用的在DPSC-based再生疗法。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是由挑战性的探索性研究补助金(不支持。24659876)、科研(C;不。25462889),补助金年轻科学家(B;不。15 k20592)从教育部,文化,体育,科学和技术的日本首相加藤,藤本,克己和Noriko Goto,分别。作者要感谢博士Eiso Hiyama在自然科学基础研究和发展中心和广岛大学的设备使用。

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