文摘

据报道,人类间充质干细胞能够抑制T淋巴细胞激活;然而,这种差异在不同来源的msc不是良好的文档记录。在这项研究中,我们比较了msc从骨髓(BM),脂肪组织(的),(PL),胎盘和脐带(UC)来确定显示哪一个最有效的免疫抑制对phytohemagglutinin-induced T细胞增殖的影响。其中我们发现hUC-MSC最强的抑制T细胞增殖的影响,选择做进一步研究。我们观察到,T淋巴细胞自发释放丰富的干扰素-γ。和干扰素-γ由T淋巴细胞分泌可以诱导吲哚胺2的表达,3-dioxygenase hUC-MSCs (IDO)。以前曾有报道称,伊多诱导T淋巴细胞凋亡和细胞周期阻滞在S期。cocultured hUC-MSCs时,半胱天冬酶3的T淋巴细胞表达明显增加,而Bcl2和到mRNA表达显著下降。添加1号色氨酸(1-MT),一个被罩抑制剂,恢复T淋巴细胞增殖,减少细胞凋亡,诱导细胞周期的恢复。此外,半胱天冬酶3中的变化,到,Bcl2表达式被1-MT逆转。这些发现表明hUC-MSCs诱导T淋巴细胞凋亡和细胞周期阻滞,表达丰富的被罩和提供一个解释一些msc的免疫调节作用。

1。介绍

间充质干细胞(msc)是一种很有前途的细胞来源细胞再生医学治疗,由于他们的自我更新能力和分化成多种功能细胞类型(1,2]。到目前为止,骨骨髓来源间充质干细胞(BM-MSCs)最广泛研究干细胞的家庭。尽管他们巨大的潜力,这些细胞的来源(s)是有限的,他们的数量和质量下降与衰老3]。最近,许多实验室独立隔离的多功能干细胞成骨的能力从脐带组织,脂肪形成的,chondrogenic分化(4]。传统分娩后丢弃,脐带现在似乎是一个方便和丰富的干细胞来源。此外,人类脐带tissue-derived增殖潜能的间充质干细胞(hUC-MSCs)大于BM-MSCs [5]。因此,hUC-MSCs可能适合组织再生治疗的应用。

越来越多的证据表明,msc可以抑制各种免疫细胞的激活,包括树突细胞和B - t淋巴球[6- - - - - -8]。在体外,msc弱免疫原性和抑制同种异体T淋巴细胞反应9]。同时,他们已被证明改变自然杀伤细胞和T淋巴细胞的表型,说明临床同种异体msc移植可能可行的(10]。hUC-MSCs可能会生成一个更小的比msc从成人组织的免疫反应,因为他们的胎儿起源11]。然而,背后的机制(s)的免疫抑制功能hUC-MSCs尚未完全阐明(12,13]。

为了找到最好的MSC来源的组织,我们筛选了MSC从骨髓(BM),脂肪组织(的),(PL),胎盘和脐带(UC)来确定显示哪一个最有效的免疫抑制对phytohemagglutinin-induced T细胞增殖的影响。其中我们发现UC-MSC有最强的影响抑制T细胞增殖,并选择做进一步研究。

大量的可溶性因子由msc与调解他们的免疫调节活动,如干扰素-γ(14转化生长因子-β1 (TGF -β1),前列腺素E₂(铂族元素₂)[15),吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO) [16),一氧化氮(NO) (17)、白介素10 (il - 10)18]。此外,它已经表明,msc诱导细胞分裂的被捕和激活T淋巴细胞的凋亡19- - - - - -22),但机制并不明确。理解背后的确切机制hUC-MSCs下调免疫反应的能力,我们假设、表达的hUC-MSCs cocultured T淋巴细胞,诱导细胞循环逮捕和T淋巴细胞凋亡。

为了验证这个假设,我们调查的影响hUC-MSCs激活的T淋巴细胞,包括增殖、存活和细胞因子的分泌。我们试图定义的相关细胞因子抑制剂的使用。我们确定hUC-MSCs抑制T淋巴细胞增殖在表达刺激T淋巴细胞凋亡和细胞周期阻滞。这种抑制hUC-MSCs废除了将文化与1号色氨酸(1-MT),一个被罩的有力竞争抑制剂。

2。材料和方法

2.1。隔离和msc的扩张

msc是孤立的4种不同来源:骨髓(BM),脂肪组织(的),(PL),胎盘和脐带(加州大学)。大英博物馆和样本来自健康志愿捐髓者,而WJ和PL样本获得后续常规剖腹产。所有患者给予书面知情同意和批准的这项研究是吉林大学中日联合医院的伦理委员会。捐赠者的年龄范围如下:大英博物馆,18 - 43岁,在,从23岁到50年,和母亲,从23日至38岁脐带和胎盘。hUC-MSCs分离(如前所述)(23- - - - - -25与一些修改)。美国短暂、胶原酶和透明质酸酶(σ)是用来消化切碎脐带组织切除后的外膜层组织。消化细胞被孵化α与10%胎牛血清(mem培养基补充的边后卫;澳大利亚GIBCO)在37°C的氛围中100%的湿度和5%的有限公司₂。48小时后,不依从细胞被洗,和媒介改变了每周两次,直到细胞融合达到了大约80%。BM-MSC, AT-MSC, PL-MSC孤立如前所述[26]。

被分离的细胞通过添加0.05%胰蛋白酶和0.02% EDTA(美国σ)的培养皿和孵化3分钟37°C。细胞被洗的新媒体,通过离心分离颗粒状,然后resuspended计算使用血细胞计数器(上海法,中国)。resuspended细胞被播种到文化井在1000个细胞/厘米²。

2.2。流仪分析MSC

使用trypsin-EDTA msc收获从培养瓶(如上所述)在37°C,然后用PBS洗两次。接下来,细胞悬浮液与抗体孵化CD44-phycoerythrin (PE), CD73-PE, CD14-PE, CD34-PE, CD90-fluorescein异硫氰酸酯(FITC) CD45-FITC, CD105-PerCP,分别(都来自BD生物科学,美国),和保护从光在4°C为30分钟。孵化后,细胞与PBS洗两次。荧光强度测量使用流式细胞仪(美国贝克曼库尔特FC500)和数据分析软件(贝克曼库尔特FC500)级。

2.3。msc分化潜能

2.3.1。脂肪生成

msc被播种到12-well板块5×10⁴细胞/厘米²和生长在MSC生长培养基(αmem和10%的边后卫)37°C在湿润的气氛中有5%的公司₂至少2 h, 4天前(接近或完全融合)切换到adipogenesis-inducing介质(STEMPRO®脂肪形成分化装备,GIBCO,美国)。细胞在分化培养媒体21天改变媒体每3到4天。脂肪细胞与油红O染色观察到(美国σ)和可视化使用亮视场显微镜。

2.3.2。骨生成

msc被播种到12-well板块5×10⁴细胞/厘米²和生长在αmem含有10%的边后卫在37°C在湿润的气氛中有5%的公司₂。在融合,细胞治疗osteogenesis-inducing介质(STEMPRO®成骨分化装备,GIBCO,美国)为35天改变媒体每3到4天。矿物沉积,骨生成的证据,是可视化用茜素红染色。图像被使用了亮视场显微镜进行定性分析。

2.4。T淋巴细胞增殖试验

人类T淋巴细胞从JENNIO购买生物技术(广东,中国)。T淋巴细胞增殖诱导的植物凝集素(PHA;美国Sigma-Aldrich)文化。通过添加丝裂霉素C (10 msc被灭活μ美国Sigma-Aldrich g / mL) (MMC)的文化2 h在37°C,紧随其后的是洗PBS包含10%的边后卫。灭活msc与PHA-activated cocultured T淋巴细胞在表示比率24-well组织培养板(接触文化)或transwells购买美国的微孔(物理上由一个膜分开)增长媒体(αmem含有10%的边后卫和100 U /毫升青霉素、链霉素)为5天。5-Bromo-20-deoxyuridine (BrdU)然后添加到文化。经过18小时,扩散是评估使用BrdU-Assay工具包(美国罗氏应用科学)根据制造商的指示。

2.5。细胞凋亡检测

在染色后用流式细胞仪检测凋亡细胞与annexin-V-FITC / PI双染色。coculture后,T淋巴细胞是收获,与PBS冲洗两次,500年暂停μL具有约束力的缓冲区。15分钟的悬浮细胞培养在4°C 5μL膜联蛋白V-FITC解决方案和培养另一个5分钟后在4°C添加10μL(π的解决方案。发出绿色荧光的annexin-V (FL1)和红色荧光的π(FL2)检测到一个流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特Fc500)的激发波长488 nm和一个发射波长525 nm和575 nm,分别。对于每一个样本,10000事件被记录。早期细胞凋亡的数量、晚期凋亡和坏死被确定为annexin-V的百分比⁺/π⁻,annexin-V⁺/π⁺,annexin-V⁻/π⁺细胞,分别。

2.6。细胞周期分析

细胞周期研究使用流仪进行分析(如前所述)(27]。短暂,cocultured T淋巴细胞收集,清洗,悬浮在冷75%乙醇/晚上4°C。固定后,细胞颗粒状,与PBS洗,染色使用50μg / mL propidium碘(π)和50μg / mL核糖核酸酶(Beyotime,中国)溶解在0.5毫升PBS。悬架是受光照和孵化为30分钟37°C。然后,细胞被流式细胞术分析。

2.7。ELISA试验

上层清液从T lymphocyte-MSC cocultures(比例是1:1)收集和MSC文化在24小时的时间点,72 h和120 h。每个样本一式三份。可溶性干扰素-γ在媒体的样品是人类干扰素-测量使用γ酶联免疫试剂盒(南京建成,中国),根据制造商的指示。

2.8。我抑制试验

使用Transwell hUC-MSCs和T淋巴细胞培养系统如前所述。IDO抑制剂1号色氨酸(美国σ1-MT)添加到cocultures 250μm。5天然后扩散的细胞培养,细胞凋亡,细胞周期进行了分析。

2.9。实时定量rt - pcr基因表达分析的T淋巴细胞与hUC-MSCs Cocultured

细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(生活技术,美国)根据制造商的指示。RNA被溴化乙锭染色electrophoretically验证完整性和OD260 / OD280纳米吸收比率(OD > 1.9)。总RNA (500μ使用2.5 U g)是反向转录AWV反向trancriptase XL, 10 U核糖核酸酶抑制剂,1毫米核苷酸混合物,1.25 pmoL益生元dT-Adaptor底漆,MgCl 5毫米₂,1×RT缓冲区根据制造商的指示。一个没有放大控制(NAC)是包含和不包含逆转录酶。反应是在42°C的环境为30分钟,然后在95°C 5分钟,5分钟的5°C。

实时定量rt - pcr(存在)进行评估基因表达如下:Bcl2,半胱天冬酶3,到在T淋巴细胞cocultured msc。引物设计使用Primer3输入(http://flypush.imgen.bcm.tmc.edu/primer/primer3_www.cgi)和合成60°C。引物序列表中列出1。存在使用ABI 7500进行快速系统(ABI应用生物系统公司、美国)。25μ使用g (cDNA与SYBR-Green PCR反应中存在主混合(应用生物系统公司、沃灵顿、英国)和0.2μ米的gene-specific正向和反向引物(Sangon生物技术,中国)。所有PCR产品演示一个乐队由解离曲线和凝胶电泳。thermocycler参数放大这些基因在95°C 1周期为10分钟紧随其后40周期为15秒95°C,在55°C 15年代和30年代的72°C。Beta-2-microglobulin (B2M)基因是用于规范化cDNA大量存在。没有模板控制(NTC)和放大控制(NAC)包含在每个反应。反应进行了一式三份;数据分析使用方法(28]。

2.10。免疫印迹分析被罩在hUC-MSCs Cocultured T淋巴细胞

蛋白质样本解决10% sds - page和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国贝德福德微孔)。阻塞和洗涤后,膜与初级孵化兔子反被罩抗体(博士德,中国)和兔子攻击人类β肌动蛋白抗体(分别为美国Abcam)。在广泛的洗涤之后,膜过氧化与山羊孵化——(合)标记anti-rabbit免疫球蛋白(H + L)(美国Abcam)和anti-mouse免疫球蛋白(美国Abcam) 1 H在黑暗,分别。洗后,发射极耦合逻辑检测系统(发射极耦合逻辑设备;Beyotime,中国)根据制造商的指示。

量化的蛋白质涂抹决心使用富士智能黑盒二世和图像测量软件4.0版本。

2.11。HPLC-MS / MMS检测到我的活动

IDO酶活性的msc被tryptophan-to-kynurenine转换测量光度测定犬尿氨酸浓度在上层的读出(29日]。除此之外,我的活动在T淋巴细胞或cocultures量化。在coculture实验中,色氨酸和犬尿氨酸浓度测定细胞培养上清液的HPLC-MS / MMS。上层清液从T lymphocyte-MSC cocultures(比例是1:1;添加或不添加1-MT)和T淋巴细胞文化收集。然后色氨酸和犬尿氨酸检测到北京女士医学研究有限公司有限公司的活动我是显示的百分比根据以下公式:犬尿氨酸活性被罩= Kyn /尝试×100%,其中Kyn是犬尿氨酸浓度MSC cocultures和尝试是初始色氨酸浓度的文化。

2.12。统计分析

使用SPSS统计分析软件SPSS 17.0版本,芝加哥,美国)。非参数检验(Wilcoxon Mann-Whitney)是用于统计分析。参数数据表示为平均值±标准偏差(SD)。被定义为统计意义。

3所示。结果

3.1。培养的msc的表征

msc 3通道后的细胞表面抗原的档案文化被流式细胞术分析。所有msc CD44的表达阳性,CD73, CD90、CD105;他们没有表达CD14、CD34、CD45(数据未显示),这是类似于正常BM-MSCs的免疫表型。

脂肪细胞或成骨细胞诱导媒体处理时,hMSCs分化成脂质vesicle-forming脂肪细胞沾油红O或沾染了茜素成骨细胞形成矿床,分别(数据没有显示)。

3.2。比较T淋巴细胞抑制势4 msc

T细胞增殖显著降低cocultured时四个msc。UC-MSCs对T细胞增殖的抑制作用最为突出。相比BM-MSC(图1(一))。观察细胞凋亡在T细胞cocultured 4时不同的msc。凋亡比率最高的是UC-MSC coculture组比- WJ -, BM-MSC组(图1 (b))。而且,G0 / G1期逮捕率T淋巴细胞在所有四个MSC coculture UC-MSCs最高组(图1 (c))。

3.3。UC-MSCs抑制干扰素的释放γT淋巴细胞的在体外

ELISA结果显示,T淋巴细胞释放大量的干扰素-γ,但UC-MSCs没有释放IFN -γ。和UC-MSCs抑制干扰素的释放γT淋巴细胞的在体外(图2)。

3.4。我与T淋巴细胞增殖的抑制有关

调查hUC-MSCs抑制T淋巴细胞增殖的能力,建立了cocultures使用各种比率(1:1)hUC-MSCs T淋巴细胞。可以清楚地看到在图3(一个),PHA激活的T淋巴细胞增殖显著抑制UC-MSCs。被罩表达了hUC-MSCs cocultured与T细胞。免疫印迹分析表明人类msc不持续表达的语言,但大量的语言coculturing蛋白诱导的T淋巴细胞(图3 (b))。确认是否刺激干扰素- IDO的表达γ,1.5μg / mL IFN -γ添加到UC-MSCs文化系统。免疫印迹结果显示,干扰素γ刺激确实是需要IDO的表达在UC-MSCs(图3 (c))。图3 (d)显示活动的被罩在cocultures高于T淋巴细胞培养系统。

确认我是否直接介导的抑制T淋巴细胞增殖,250μm 1-methyltryptophan (1-MT),被罩的抑制剂,被添加到cocultures。在对待文化,T淋巴细胞增殖是几乎完全恢复(图3(一个))。

3.5。由1-MT hUC-MSCs-Induced T淋巴细胞凋亡可以逆转

确定hUC-MSCs是否具有诱导细胞凋亡的能力在激活T淋巴细胞,cocultures hUC-MSCs和T淋巴细胞检查使用膜联蛋白V和π双染色。如图4,有一个显著增加文化中T淋巴细胞凋亡细胞的比例与PHA激活hUC-MSCs的存在。这一结果表明,hUC-MSCs诱导T淋巴细胞凋亡在体外。添加1-MT有效地拯救了细胞凋亡,诱导hUC-MSCs,表明语言T淋巴细胞凋亡中发挥了作用。

3.6。hUC-MSCs-Induced T淋巴细胞凋亡的差别通过对这些基因bcl - 2 /半胱天冬酶通路由1-MT可以逆转

Bcl2和半胱天冬酶3的表达在T淋巴细胞检测到存在探讨MSC引起的细胞凋亡的机制。正如所料,hUC-MSCs显著地抑制Bcl2的mRNA表达,促进了半胱天冬酶3(图的表达5)。添加1-MT Bcl2有效逆转变化和半胱天冬酶3 hUC-MSCs引发的表达式。

3.7。到的差别细胞周期阻滞的被罩,通过对这些基因

hUC-MSCs cocultured与T淋巴细胞时,细胞周期分析显示,G0 / G1期增加%的% S期下降到%的%。T淋巴细胞G0 / G1期的比例下降通过添加1-MT %,而T淋巴细胞的S期比例增加%,明显不同于对照组(%;图6)。这些数据表明,T淋巴细胞在G0 / G1期当被捕cocultured hUC-MSCs。这逮捕被1-MT部分逆转,表明油分泌hUC-MSCs发挥了重大作用,产生这种效应。

基于上述发现,我们进一步分析了变化的mRNA表达细胞周期蛋白依赖性激酶4(到),细胞周期蛋白依赖性激酶家族的一员。如图7,hUC-MSCs的存在显著地抑制到表达式。添加1-MT之后,到通过T淋巴细胞的表达几乎完全恢复。

4所示。讨论

从骨髓msc最初是孤立和特征。然而,BM-MSCs并不像他们的数量和现成的增殖和分化的能力随着年龄增长而减少(3]。相比之下,人类脐带组织很容易获得,分娩后经常丢弃生物废物。msc源自脐带展览增加增殖和分化的能力,以及较低的免疫原性,相比BM-MSCs [5,30.]。

为了找到最佳临床使用MSC来源,我们筛选4从骨髓MSC,脂肪组织,胎盘和脐带,发现UC-MSC潜力最强的抑制T淋巴细胞增殖。因此,hUC-MSCs已成为细胞治疗应用程序的一个有前途的新资源。虽然据报道,hUC-MSCs抑制T淋巴细胞激活(20.),这种影响的机制仍不清楚。在目前的研究中,我们得到的数据表明hUC-MSCs强有力地抑制T淋巴细胞增殖指引他们到细胞循环逮捕(G0 / G1期)和细胞凋亡。这些结果被别人报告的观察是一致的(20.]。更重要的是,我们还显示,hUC-MSCs表示大量的酶被罩。众所周知,被罩降解色氨酸在微环境导致T淋巴细胞凋亡31日]。在我们的研究中,我们添加了1-MT,被罩的有力竞争抑制剂,coculture和证明,它阻止了抑制hUC-MSCs对T淋巴细胞活化的影响通过恢复扩散(即。,G0 / G1期S期)和衰减T淋巴细胞凋亡。

据报道,BM-MSCs防止T淋巴细胞激活通过阻止细胞进入S期(32]。在这里,我们还研究了活化T淋巴细胞的细胞周期是否被hUC-MSCs影响。hUC-MSCs的存在,在S期T淋巴细胞的数量大大减少响应通过hUC-MSCs可溶性因子生产。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是一个家庭的蛋白激酶调节真核细胞周期的不同阶段(33- - - - - -35]。自到过程中扮演着重要的角色在G0 / G1期的规定和要求G1 / S期过渡,我们测量到的mRNA表达coculture系统,发现hUC-MSCs下调到。添加1-MT cocultures恢复到表达式在T淋巴细胞和T淋巴细胞的数量明显增加在S期。这些结果进一步表明,hUC-MSCs激活T淋巴细胞的增殖抑制开车到G0 / G1期。

在目前的研究中,我们进一步表明,诱导T淋巴细胞凋亡涉及bcl - 2家族的成员,包括antiapoptosis基因产物(例如,bcl - 2)和proapoptosis基因产物(例如,巴克斯)36,37]。伯灵顿蛋白质诱导细胞凋亡促进线粒体细胞色素c的释放。对付伯灵顿的影响,bcl - 2抑制线粒体细胞色素c的释放和细胞凋亡。在目前的研究中,我们表明,hUC-MSCs诱导T淋巴细胞凋亡bcl - 2表达下调和移植半胱天冬酶3。添加的1-MT bcl - 2和半胱天冬酶3和差别cocultures扭转了对这些显著降低T淋巴细胞凋亡。

最近的研究支持这一观点,除了防御病原体,被罩参与T淋巴细胞反应的调节和抑制T淋巴细胞增殖38]。有人推测,IDO的表达在免疫系统的抗原呈递细胞可能控制autoreactive T淋巴细胞(38]。因此,我扮演着一个重要的角色在自身免疫性疾病的发展,器官移植排斥反应,和癌症。最近的报告表明,IDO-facilitated转换的色氨酸犬尿氨酸不仅耗尽色氨酸犬尿氨酸的细胞环境,也导致生产下游代谢物介导抑制T细胞增殖(10]。在这项研究中,hUC-MSCs能够抑制T淋巴细胞增殖由于大量的语言表达的干细胞。被罩抑制剂1-MT时添加到文化,被罩在T淋巴细胞的抑制作用主要是逆转。

可能因素可能被hUC-MSCs分泌,如il - 10、干扰素-γTGF -β1、铂族元素₂没有,有一个对T淋巴细胞活化的影响。这一事实的1-MT cocultures hUC-MSCs和T淋巴细胞只恢复增殖不羁的80%水平表明,其他因素也有影响。

总之,我们的研究结果提供深入的机制(s)受雇于hUC-MSCs强烈抑制T淋巴细胞激活。通过表达丰富的大量的语言诱导干扰素-γ,干细胞目标T淋巴细胞细胞周期和细胞凋亡通路。基于这些结果,hUC-MSCs是几乎无限的来源,本研究支持使用hUC-MSCs作为营养来源的可能性因素治疗移植物抗宿主病(GVHD)以及其他自身免疫性疾病。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的大学经费Tang-Ao-Qing杰出教授王(y)。