肿瘤微环境三维原代培养抗肿瘤耐药新模型的建立

摘要

肿瘤微环境与肿瘤的发生发展密切相关。作为一种三维肿瘤微环境模型，近年来从癌基因转基因小鼠胃肠道组织中制备了气液界面(ALI)有机培养物。然而，结直肠癌患者组织中ALI类器官培养系统尚未建立。在这里，我们从人类患者的正常和肿瘤结直肠组织中开发了一个ALI器官模型。两种器官成功生成，显示囊状结构包含上皮层和周围的间充质间质细胞。肿瘤样器官结构与原发肿瘤上皮极为相似。上皮细胞标记物E-cadherin、杯状细胞标记物MUC2和成纤维细胞标记物波形蛋白(但不是肌成纤维细胞标记物)的表达，-平滑肌肌动蛋白(SMA)，见于正常类器官。E-cadherin、MUC2、vimentin和-SMA在肿瘤样器官中可见。肿瘤干细胞标记物LGR5在肿瘤器官中的表达高于原发肿瘤组织。与结直肠癌细胞系SW480、SW620和HCT116相比，肿瘤器官对5-氟尿嘧啶和伊立替康的毒性更有耐受性。这些结果表明，结直肠癌患者ALI器官培养可能成为检测肿瘤微环境化疗耐药的新模型。

1.导言

结直肠癌是最常见的癌症之一，也是全世界发病率和死亡率的主要原因之一[1]．结直肠癌死亡的主要原因是肿瘤进展和转移[2]．原发肿瘤组织含有少量癌症干细胞(CSCs)，具有转移能力并引起对化疗的耐药性[3.]．因此，以CSCs为靶点的结直肠癌进展的治疗靶点已经在各种类型的细胞培养、癌基因转基因小鼠中进行了探索[4和患者来源的异种移植模型[5]然而，很难获得有临床价值的发现。

大多数结直肠癌的体外研究都是使用二维(2D)细胞培养模型进行的。然而，它几乎不能反映体内组织的细胞异质性和行为。此外，2D细胞培养很难检测不同类型的细胞(如上皮细胞和基质细胞)之间的相互作用。相反，体外初级三维(3D)培养系统准确地再现了器官结构、多谱系分化和生理学，在基础生物学和干细胞研究中具有被证明的价值[6，7]．Sato和Clevers利用Matrigel开发了一个3D上皮器官培养系统，其中人类肠道干细胞形成隐窝样结构[7]．最近，结直肠癌患者产生了Matrigel类器物，肿瘤类器物与原肿瘤的性质密切相关[8].在同一份报告中，利用肿瘤类器官进行了药物发现的高通量筛选。这些报告表明，Matrigel类器官培养技术有可能在不久的将来应用于结直肠癌的个性化治疗。

基质类器官培养物通过酶处理从原代胃肠道组织中分离出来，纯由上皮细胞组成[9]．然而，肠干细胞(ISCs)通常受到微环境生态位的影响，由上皮细胞、间充质细胞和细胞外基质组成[10，11]．ISCs生态位负责邻近隐窝基底的肌成纤维细胞，它促进旁分泌信号的激活，调节邻近的ISCs [12]为了在3D培养中建立模拟ISCs生态位的培养系统，Ootani等人使用胶原凝胶和气液界面（ALI）方法建立了一种不同类型的类器官培养系统，该系统由来自小鼠胃肠组织的上皮和间充质组分组成[13，14]．此外，转基因癌基因小鼠胃肠道组织的ALI类器官在小鼠异种移植模型中显示了腺癌样组织学和致瘤性[15]．

然而，尚未从结直肠癌患者中产生ALI类器官。在这里，我们首次从正常和恶性的人类结直肠组织中产生了ALI类器官。两种器官都由上皮细胞和间充质细胞组成，类似于小鼠ALI器官培养。ALI患者的肿瘤器官与原发肿瘤的上皮结构相似，并表现出对化疗的耐药性。

2.材料和方法

2．1．材料

如前所述，用改良的ISCs培养基培养人类结直肠组织以产生类器官[9]．其组成为:含50% Wnt、Noggin和R-Spondin条件培养基的高级Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM);GlutaMax;B-27补充;100年g/mL Primocin（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen）；1 mM N-乙酰-L-半胱氨酸；10 mM烟酰胺（美国密苏里州圣路易斯市西格玛·奥尔德里奇）；50 ng/mL小鼠EGF（PeproTech，Inc.，美国新泽西州洛基山）；500 nM A83-01（美国加利福尼亚州欧文市阿多克生物科学公司）；3 M SB202190;10M Y-27632 (Cayman, Ann Arbor, MI, USA)。抗癌药物如下:5-氟尿嘧啶(5-FU) (WAKO，东京，日本);伊立替康(LC Laboratories, Woburn, MA, USA)。抗体来源如下:E-cadherin (R&D System, Minneapolis, MN, USA);MUC2 (Gene Tex, Irvine, CA, USA);波形蛋白(Sigma-Aldrich);-平滑肌肌动蛋白（SMA）（丹麦格洛斯特鲁普达科市）；LGR5（美国加利福尼亚州圣地亚哥市Abgent市）；CD44（美国德克萨斯州蒙哥马利市Bethyl实验室）。二级抗体如下：Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG；Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG；Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG；Alexa Fluor 488驴抗山羊IgG（Invitrogen）。

2．2.细胞培养

结直肠癌细胞系SW480、SW620和HCT116在添加10%胎牛血清(FBS, Invitrogen)的DMEM中培养。

2．3.人体组织

样本来自于山口大学医学研究生院(Yamaguchi, Japan)胃肠、乳腺和内分泌外科接受手术的患者。所有患者均被诊断为结直肠癌。这些患者均未接受术前治疗。从切除的结肠段中分离正常和肿瘤组织。取离体组织进行类器官培养、苏木精伊红染色及免疫荧光。11份正常和肿瘤组织样本被尝试产生类器官。在正常组织中成功生成7个类器官。2个样本中的有机物几乎没有生长。其余的样本都被污染了。在肿瘤类器官中，6个类器官成功生成并迅速扩张。 Organoids from 2 samples grew so slowly that they were discarded. The rest of samples were contaminated. Among them, we showed the data of 4 paired samples in this study. The study protocol was approved by the Institutional Review Board (IRB) for Human Use at Yamaguchi University Hospital. Written informed consent for this study was obtained from all patients prior to surgery (IRB approved numbers are H17-82 and H26-44).

２.４.三维ALI人类正常和肿瘤结直肠类器官的生成

来自专利的正常和肿瘤组织在冷HEPES缓冲盐水中洗涤。在冰上切碎组织后，将其嵌入胶原凝胶中，并使用ALI培养系统在ISCs培养基中培养，如前所述[13]．使用2000单位/mL胶原酶IV (Worthington, Lakewood, NJ, US)每7-14天传代一次[15]并在1小时后重新植入新的ALI胶原凝胶中 : 2分。

2．5．类器官的H&E染色

有机化合物用4%多聚甲醛(PFA)在4℃下固定过夜后，石蜡包埋。脱蜡后，4m厚切片进行H&E染色，如前所述[16]．使用光学显微镜(BX-53;奥林匹斯山,日本东京)。

2.6.类器官的免疫荧光染色

4°C, 4% PFA固定过夜后，石蜡包埋。脱蜡后，用5%正常山羊血清/TBS在室温下封闭切片1 h。然后用一抗(1:100或1:200)在4°C孵育过夜。用二抗(1:500或1:1000)室温孵育1 h后，用共聚焦显微镜(LSM 800;蔡司、哥本哈根、德国)。

2.7。类器官细胞活力测定

5 × 10^3.将肿瘤类器官细胞接种到10个细胞中在96孔培养板上培养24小时 h、 然后，用不同浓度的5-FU或伊立替康治疗6天。使用Alamar Blue试剂盒（Invitrogen）通过细胞计数检测每个细胞的活力。荧光（发射波长：585 nm）在标准平板读取器（美国加利福尼亚州欧文市贝克曼库尔特公司）和半最大抑制浓度（IC）中读取₅₀)计算每个样本中的药物值。

2.8。大肠癌细胞系的细胞活力测定

1×10^3.将SW480、SW620和HCT116细胞接种至10在96孔培养板上培养24小时 h、 然后，用不同浓度的5-FU或伊立替康治疗3天。使用Alamar Blue试剂盒通过细胞计数检测每个细胞的活力。在标准平板读取器和IC中读取荧光₅₀计算每个细胞中药物的值₅₀值显示为平均值±SEM。

2.9。统计分析

数据显示为平均值±扫描电镜。统计评估使用学生的t-两组之间的检验。的值P<0.05被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.人ALI正常结直肠类器官的产生

近年来，无基质成分的人类正常结直肠上皮细胞的3D培养已经发展起来[9]然而，人类ALI正常大肠类器官尚未建立。因此，我们使用ALI培养方法培养人类正常大肠组织（图1(一)）.如预期的那样，在ALI孔中播种后，正常的结直肠组织碎片维持了7天(图)1 (b)）.传代后，小包囊逐渐变大，与传代后相比，类器官菌落数量略有增加(图)1 (b)）.我们观察到，在每个患者培养中，正常的ALI器官由单层上皮样细胞和周围的基质样细胞组成(图)1 (c)和1 (d)）.为了鉴定正常ALI类器官的细胞成分，我们进行了免疫荧光染色。上皮细胞标记物E-cadherin的表达(图1 (e))，杯状细胞标记物MUC2（图1 (f))和成纤维细胞标记物波形蛋白（图1 (g))，但不是肌成纤维细胞的标记物，sma(图1 (h))，在这些类器官中观察到。

3．2.人ALI肿瘤结直肠类器官的产生

为了使用ALI培养方法产生人类结直肠肿瘤类器官，我们接下来培养来自患者的结直肠肿瘤组织。肿瘤组织碎片在不受污染的ALI井中保存7天后，将它们移入新的ALI井(图)2(一个)）.传代后，我们观察到与传代后相比，肿瘤ALI类器官菌落数量显著增加(图)2 (b))，以及每个患者培养中肿瘤类器官的不同结构(图2 (c)）.我们还观察了每个患者肿瘤ALI类器官的结构，并与他们原来的肿瘤上皮进行了比较(图)2 (d)）.T1类器官具有明显的管腔形成，肿瘤细胞呈单层，反映了肿瘤原始组织的特征。在T2和T4组织中，肿瘤细胞呈固体生长，偶见多层瘤细胞形成管腔。同样，T2和T4类器官由多层肿瘤细胞组成。在T3组织中，肿瘤细胞呈乳头状或索状生长，无管腔形成。同样，T3类器官由乳头状肿瘤细胞组成。为了鉴定肿瘤ALI类器官的细胞成分，我们进行了免疫荧光染色。E-cadherin的表达(图3(一个)), MUC2(图3 (b))、波形蛋白(图3 (c)),sma(图3 (d))。因为有报道称，与2D培养相比，3D培养中各种干细胞标记物的表达升高[17]接下来，我们确认肿瘤类器官中存在癌干细胞（图3 (e)）.观察到肿瘤干细胞标记物LGR5在肿瘤类器官中的表达(图)3 (e)）.在任何患者中，肿瘤类器官中lgr5阳性细胞的数量明显高于原始组织(图)3 (e)- - - - - -3 (g))我们还检查了肿瘤类器官中其他干细胞标记物的表达，包括SOX2、Nanog、CD44和CD133。与LGR5类似，在肿瘤类器官中观察到CD44的表达（图3 (h)）.另一方面，其他干细胞标记几乎没有观察到(数据未显示)。

3．3.人ALI肿瘤结直肠癌类器官与2D培养结直肠癌细胞株抗肿瘤药物反应性的比较

最近的一份报告显示，3D培养比2D培养具有更高的茎干性和致瘤性[17]．人们还知道，较高的茎秆导致对抗癌药物的耐药性[18]．由于ALI肿瘤样器官含有大量lgr5阳性细胞(图)3 (g))，我们检查了ALI肿瘤类器官是否显示出对抗癌药物的耐药性。为了比较肿瘤类器官与相同培养条件下2D培养的结直肠癌细胞系对抗癌药物的反应性，我们进行了96孔Matrigel细胞活性测定（图4(一)）.5-FU治疗(图4 (b)和4 (c))或伊立替康（图4 (d)和4 (e))以剂量依赖的方式降低每个患者培养中肿瘤ALI类器官的细胞活力。的集成电路₅₀T1: 54.91±14.45g / mL;T2: 201.08±11.48g / mL;T3: 159.50±4.06克/毫升。的集成电路₅₀依立替康的值:T1: 45.29±6.77M;T2: 26.63±2.21M、 T3:42.33±4.98 M(图4 (h)）.另一方面，用5-FU治疗(图4 (f))或伊立替康（图4 (g))在结直肠癌细胞系中，SW480、SW620和HCT116，与每个患者培养的肿瘤ALI类器官相比，在较低浓度下诱导细胞死亡。的集成电路₅₀5-FU的值如下：SW480；0.58±0.03 g / mL;SW620;2.92±0.11g / mL;HCT116;0.58±0.04克/毫升。的集成电路₅₀伊立替康的值为:SW480;4.65±0.53M、 SW620；1.94±0.31 MHCT116；3.38 ± 0.24 M(图4 (h)）.

4.讨论

在本研究中，我们首次从患者体内制备了原发性人类ALI大肠正常和肿瘤类器官。本研究的主要发现如下：（1）正常类器官显示囊性结构，包含上皮细胞、杯状细胞和成纤维细胞，但不包含肌成纤维细胞（图1）1)，(2)与原始组织相比，肿瘤类器官表现出强大的扩张和上皮结构的复制(图2(3)肿瘤类器官包括上皮细胞、杯状细胞、肌成纤维细胞和癌症干细胞(图3.(4)与2D细胞培养的细胞相比，这些肿瘤器官对5-FU和伊立替康更耐药(图)4)总之，我们的结果表明，大肠肿瘤患者来源的ALI类器官复制了肿瘤微环境，可作为检测抗癌耐药性的体外3D培养模型之一。

肌成纤维细胞位于隐窝基底膜下，促进干细胞自我更新和分化[19]此外，肌成纤维细胞通过分泌包括转化生长因子（TGF）在内的蛋白质向干细胞提供营养物质-［20.]．此外，肌成纤维细胞与促进结直肠癌的生长和侵袭有关[21]．因为Ootani等人在小鼠肠道ALI类器官中发现，培养的肠上皮由肌成纤维细胞排列[13，我们预计肌成纤维细胞会包围人结直肠ALI类器官的上皮层。在这项研究中，我们发现了波形蛋白阳性细胞，而不是-SMA存在于正常的器官中(图1)，表明在上皮层周围存在成纤维细胞，但不存在肌成纤维细胞。另一方面，波形蛋白和在肿瘤样器官中观察到-SMA(图3.)这些结果表明与小鼠肠道类器官的结果存在差异。据报道，肌成纤维细胞起源于成纤维细胞和骨髓细胞[22]．TGF-能诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞[23]．此外，有报道称血小板、单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞都分泌TGF-［24]．结合这些报道和我们本研究的数据，提示基质细胞在肿瘤的类器官中比正常的多，基质细胞通过分泌TGF-将成纤维细胞分化为肌成纤维细胞在肿瘤类器官中。同样值得注意的是，小鼠肠道或人类大肠肿瘤组织中的肌成纤维细胞更为活跃，并能粘附在上皮细胞上，上皮细胞通过分泌肌成纤维细胞的生长因子导致类器官的更高生长。

一小部分耐药癌症干细胞亚群促进肿瘤复发、侵袭和转移[25]．众所周知，在癌症干细胞中有几种干细胞标记物表达。用于癌症干细胞分类和分析的最常用的标记物是LGR5、CD133、CD44和醛脱氢酶1。LGR5是正常肠道干细胞的标记物，在肿瘤细胞干细胞性中也有重要作用[26]．在本研究中，我们发现在任何患者的肿瘤类器官中lgr5阳性细胞的数量明显高于原始组织(图)3.).关于肿瘤类器官中LGR5表达的上调机制，我们假设在ALI培养中，肿瘤组织中LGR5阴性细胞死亡后，干细胞刺激培养基和间充质成分（包括肌成纤维细胞）可能有助于增加存活的LGR5阳性细胞。

此外，肿瘤类器官对5-FU和伊立替康的耐受性更强(图)4）.近期研究表明LGR5表达水平与结直肠癌患者对5- fu化疗的耐药相关[27]。也有报道称，接触伊立替康后，LGR5阳性细胞转变为LGR5阴性细胞，从而导致耐药状态[28]．因此，提示人类结直肠肿瘤的类器官对5-FU和伊立替康的耐药可能是通过上调LGR5的表达。然而，支持它们抵抗行为的详细机制尚不清楚。需要进一步的研究来澄清它们。

5.结论

我们首次生成了人类结直肠组织衍生的ALI类器官。提示结直肠肿瘤类器官可能成为三维微环境中抗肿瘤耐药模型的应用。对人体ALI培养的进一步研究有助于开发新的个性化治疗设计和肿瘤三维微环境研究。

竞争利益

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

臼井达也构思并设计了实验。臼井达也、樱井正志、安条修平、川崎丰吉、马田Koji、藤原伸行、矢部良太郎和辻俊也进行了实验。臼井达也分析了数据。Hazama Shoichi, Hiroko Takenouchi, Masao Nakajima, Ryouichi Tsunedomi, Nobuaki Suzuki和Hiroaki Nagano提供了试剂/材料/分析工具。臼井达也、大滨隆、山垣秀之和佐藤光一撰写了这篇论文。

致谢

作者感谢Kuo博士和Salahudeen博士友好地提供Wnt、Noggin和R-海绵蛋白产生细胞和技术建议，并感谢Akiko Sano女士在这项工作中提供的出色技术援助。

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