1。介绍
大肠癌是最常见的癌症之一,是发病率和死亡率的主要原因之一世界各地(
1 ]。结直肠癌的主要死亡原因是肿瘤进展和转移(
2 ]。原发肿瘤组织包含几个癌症干细胞(二者),它有能力转移,导致抗化疗(
3 ]。因此,发展结直肠癌的治疗目标关注二者一直在探索各种类型的细胞培养、致癌基因转基因小鼠(
4 ],patient-derived异种移植模型(
5 ]。然而,它已经很难获得临床有价值的发现。
大部分的体外研究结直肠癌的研究已经使用一个二维(2 d)执行细胞培养模型。然而,它几乎反映了细胞的异质性和体内组织的行为。此外,2 d细胞培养是几乎不能检查之间的相互作用不同类型的细胞如上皮细胞和基质细胞。相反,一个体外主要三维(3 d)文化系统准确地概括器官结构,multilineage分化,生理学,证明价值的基本生物学和干细胞研究[
6 ,
7 ]。佐藤和聪明的开发了一个3 d使用人工基底膜上皮瀑样的文化系统,在人类肠道干细胞形成crypt-like结构(
7 ]。最近,基底膜基质瀑样的结直肠癌患者和肿瘤产生瀑样紧密地重现原始肿瘤的性质(
8 ]。在同一篇报道中,高通量筛选药物发现使用肿瘤瀑样了。这些报告显示技术的可能性,基底膜基质瀑样文化应用于个性化治疗结直肠癌在不久的将来。
基底膜基质瀑样文化纯粹由上皮细胞通过隔离主要胃肠组织由于酶治疗(
9 ]。然而,肠道干细胞(isc)通常是影响微环境,由上皮和间充质细胞和细胞外基质(
10 ,
11 ]。isc利基负责myofibroblasts邻近地下基地,促进活化的旁分泌信号调节相邻isc (
12 ]。建立文化系统,模拟isc利基在3 d文化,Ootani等人建立了不同类型的瀑样文化系统,由上皮和间质成分小鼠胃肠道组织使用胶原蛋白凝胶和一个空气液体界面(ALI)方法(
13 ,
14 ]。此外,阿里瀑样从致癌基因转基因小鼠胃肠道组织显示adenocarcinoma-like组织学和致瘤性异种移植物模型(
15 ]。
然而,阿里瀑样结直肠癌患者尚未产生。我们第一次生产阿里瀑样从正常和恶性人类大肠癌组织。瀑样都是由上皮和间充质细胞类似于鼠标阿里瀑样的文化。阿里从病人肿瘤瀑样紧密地重现原始肿瘤上皮结构和显示抗化疗。
2。材料和方法
2.1。材料
生成瀑样,培养与人结直肠组织修改isc媒体如前所述[
9 ]。组件如下:先进的杜尔贝科的修改鹰Wnt介质(DMEM) 50%,‘诺金’,和R-Spondin条件培养基;GlutaMax;B-27补充;100年
μ
g / mL Primocin(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA);1毫米N-acetyl-L-cysteine;10毫米烟酰胺(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国);50 ng / mL鼠标EGF (PeproTech Inc .,落基山,新泽西,美国);500海里A83-01 (Adooq生物科学、欧文、钙、美国);3
μ
M SB202190;10
μ
y - 27632(开曼群岛,安阿伯市,美国)。抗癌药物如下:5 -氟尿嘧啶(研究者用)(WAKO、东京、日本);伊立替康(LC实验室沃本,妈,美国)。抗体来源如下:钙粘蛋白(研发系统,明尼阿波利斯,美国);MUC2(基因特克斯,欧文、钙、美国);波形蛋白(Sigma-Aldrich);
α
光滑的肌肉肌动蛋白(SMA) (DAKO、斯特鲁普、丹麦);美国圣地亚哥(LGR5就Abgent CA);CD44(美国Bethyl实验室、蒙哥马利、TX)。二次抗体如下:488年Alexa萤石山羊anti-mouse免疫球蛋白;Alexa萤石488山羊anti-rabbit免疫球蛋白;Alexa萤石568山羊anti-rabbit免疫球蛋白;Alexa萤石488驴抗体免疫球蛋白(表达载体)。
2.2。细胞培养
结直肠癌细胞系SW480, SW620, HCT116、在DMEM培养补充10%胎牛血清(的边后卫,英杰公司)。
2.3。人体组织
样本来自病人手术的胃肠病、乳腺癌和内分泌外科手术,山口大学研究生院医学(山口,日本)。所有患者被诊断出患有结直肠癌。术前治疗从未给这些病人。从切除结肠段,正常和肿瘤组织被孤立。瀑样的使用孤立的组织文化和染色的苏木精和伊红())和免疫荧光。11个样品的正常和肿瘤组织试图产生瀑样。在正常组织中,7瀑样生成成功。瀑样从2样品几乎没有增长。剩下的样本受到了污染。在肿瘤瀑样,6瀑样成功生成并迅速扩大。 Organoids from 2 samples grew so slowly that they were discarded. The rest of samples were contaminated. Among them, we showed the data of 4 paired samples in this study. The study protocol was approved by the Institutional Review Board (IRB) for Human Use at Yamaguchi University Hospital. Written informed consent for this study was obtained from all patients prior to surgery (IRB approved numbers are H17-82 and H26-44).
2.4。代的三维阿里人类正常和肿瘤结肠直肠瀑样
正常和肿瘤组织的专利是在寒冷的消息灵通的缓冲盐水洗。后组织碎冰,他们是嵌入在胶原凝胶和培养isc媒体使用阿里文化系统如前所述[
13 ]。每7 - 14天瀑样都是通过使用2000单位/毫升胶原酶IV(沃辛顿,莱克伍德,新泽西,美国)描述为之前(
15 )和山肩到新的阿里胶原凝胶在1:2分。
2.5。他走时染色的瀑样
瀑样与4%多聚甲醛固定后在4°C (PFA)一夜之间,他们是嵌入在石蜡。deparaffinization之后,4
μ
米厚的部分是沾)如前所述[
16 ]。获得的图像使用光学显微镜(BX-53;奥林匹斯山,日本东京)。
2.6。免疫荧光染色的瀑样
瀑样后固定4% PFA在4°C一夜之间,他们是嵌入在石蜡。deparaffinization后,部分被封锁在室温下与5%正常山羊血清/ TBS 1 h。然后他们被孵化与主要抗体(1:100或1:200)在一夜之间在4°C。孵化后与二次抗体(1:500或1:1000)在室温下1 h,他们用共焦显微镜观察(LSM 800;蔡司、哥本哈根、德国)。
2.7。瀑样细胞的可行性分析
5×103 细胞的肿瘤瀑样被播种到10
μ
L 96孔培养板上的基底膜基质和孵化24 h。然后,研究者用对待或不同浓度的伊立替康6天。每个细胞生存能力是由一个细胞计数检查使用Alamar蓝色装备(表达载体)。的荧光发射波长;585海里)是读者阅读在标准板(贝克曼库尔特公司,欧文、钙、美国)和半最大抑制浓度(IC50 )值计算每个样本的药物。
2.8。结直肠癌细胞系的细胞生存能力分析
1×103 SW480细胞,SW620 HCT116被播种到10
μ
L 96孔培养板上的基底膜基质和孵化24 h。然后,研究者用对待或不同浓度的伊立替康3天。每个细胞生存能力是由一个细胞计数检查使用Alamar蓝色装备。荧光是读者阅读在标准板和集成电路50 值计算每个单元中的药物。集成电路50 值显示为±SEM手段。
2.9。统计分析
数据显示为±SEM手段。利用学生的统计进行了评估
t 以及在两组之间。的值
P < 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。一代的人类阿里正常结直肠瀑样
最近,3 d的文化人类正常结直肠上皮细胞没有基质组件开发(
9 ]。然而,人类阿里正常结直肠瀑样尚未建立。因此我们培养人类正常结直肠组织使用一个阿里培养法(图
1(一) )。正如所料,正常结直肠组织碎片被播种后维持7天到阿里•威尔斯(图
1 (b) )。使之后,小囊肿逐渐变得越来越瀑样菌落的数量略有增加相比,它只是使后(图
1 (b) )。我们观察到正常的epithelial-like阿里瀑样由单层细胞和周围stromal-like细胞在每个病人的文化(数字
1 (c) 和
1 (d) )。确定正常的细胞成分阿里瀑样,我们进行免疫荧光染色。上皮细胞标记物的表达,钙粘蛋白(图
1 (e) ),杯状细胞标记,MUC2(图
1 (f) )和成纤维细胞标记,波形蛋白(图
1 (g) ),但不是myofibroblast标记,
α
sma(图
1 (h) 在这些瀑样),观察。
图1
一代的人类空气液体界面(ALI)正常结直肠瀑样。原理实验设计的三维(3 d)文化系统。人类正常结肠组织碎片被播种在胶原凝胶的阿里微环境和培养肠道干细胞(isc)媒体(a)。照片拍摄在天播种组织和后1和7天1和7通道(b)之后。比例尺:5毫米。放大的照片postpassage在通过原始图片1所示。箭头显示成年人瀑样。瀑样菌落的数量统计(
n = 4)。代表图像相衬显微镜(c)和苏木精和伊红染色(圆))(d)的人类阿里正常结直肠瀑样从四个病人(N1、N2, N3,陶瓷)所示。文化30天。酒吧规模:200
μ
m (c)和100年
μ
m (d)。上皮细胞标记物的表达,钙粘蛋白(e),杯状细胞标记,MUC2 (f),纤维母细胞标记,波形蛋白(g),和myofibroblast标记,
α
平滑肌肉肌动蛋白(SMA) (h)。代表显微照片显示(
n = 4)。文化30天。酒吧规模:50
μ
(情况)。
(一)
![]()
(b)
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(c)
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(d)
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(e)
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(f)
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(g)
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(h)
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3.2。一代的人类阿里结直肠肿瘤瀑样
生成人类肿瘤结肠直肠瀑样使用阿里文化方法,我们从患者人工培养的结直肠肿瘤组织下。肿瘤组织碎片后维持7天在阿里井没有污染,他们通过向新阿里•威尔斯(图
2(一个) )。使后,我们观察到肿瘤阿里瀑样菌落的数量显著增加而只是使后(图
2 (b) ),在每个患者肿瘤瀑样文化的不同的结构(图
2 (c) )。我们还观察到肿瘤阿里瀑样的结构与原来相比,每个病人肿瘤上皮细胞(图
2 (d) )。T1瀑样与单层肿瘤细胞有明显的细胞腔的形成,反映了原始肿瘤组织的特点。在T2和T4组织,肿瘤细胞显示了强劲的增长和偶尔的腔的形成可能与多层次性的肿瘤细胞。同样,T2和T4瀑样肿瘤细胞由多层。在T3组织,肿瘤细胞显示乳头状或cord-like增长模式没有腔的形成。同样,T3瀑样由乳头状肿瘤细胞。识别肿瘤的细胞成分阿里瀑样,我们进行免疫荧光染色。钙粘蛋白的表达(图
3(一个) ),MUC2(图
3 (b) )、波形蛋白(图
3 (c) ),
α
sma(图
3 (d) 在这些瀑样)被观察到。因为据报道,各种干细胞标记物的表达升高在3 d文化与2 d (
17 ),我们下一个证实癌症干细胞的存在在阿里瀑样肿瘤(图
3 (e) )。癌症干细胞标记的表达,LGR5就在肿瘤瀑样,观察(图
3 (e) )。LGR5-positive瀑样肿瘤细胞的数量明显高于原始组织在任何患者(数字
3 (e) - - - - - -
3 (g) )。我们也检查了其他干细胞标记物的表达包括SOX2 Nanog, CD44, CD133在肿瘤瀑样。类似于LGR5就,CD44的表达在肿瘤瀑样(图
3 (h) )。另一方面,其他干细胞标记很难观察(数据未显示)。
图2
一代的人类阿里结直肠肿瘤瀑样。人类肿瘤结肠组织碎片被播种在胶原凝胶的阿里微环境和培养isc媒体。照片是在天播种组织和后1和7天1和7通道(b)之后。比例尺:5毫米。放大的照片postpassage在通过原始图片1所示。箭头显示成年人瀑样。瀑样菌落的数量统计((c),
n = 4)。
P
∗
<
0.05
与通道1天1。代表相衬的图像人类阿里结直肠肿瘤瀑样从四个病人(T1、T2、T3和T4) (c)所示。酒吧规模:200
μ
m。)染色原发性肿瘤和肿瘤瀑样从四个病人(T1、T2、T3和T4) (d)所示。代表显微照片显示(
n = 4)。文化程度。酒吧规模:100
μ
m。
(一)
![]()
(b)
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(c)
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(d)
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图3
MUC2表达钙粘蛋白(a) (b)、波形蛋白(c)
α
阿里sma (d)在人类肿瘤结肠直肠瀑样。比较癌症干细胞的标记,LGR5就表达肿瘤瀑样(e)和原发性肿瘤组织(f)。照片LGR5-positive细胞的数量统计((g)
n = 4,每三个病人(T1、T2和T3))。
P
∗
<
0.05
而瀑样。阿里的表达CD44 (h)在人类肿瘤结肠直肠瀑样。石蜡切片(4
μ
m) immunofluorescently使用钙粘蛋白抗体染色,MUC2,波形蛋白,
α
sma、LGR5就和CD44。代表显微照片所示(
n = 4)。文化程度。酒吧规模:50
μ
m。
(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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(e)
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(f)
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(g)
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(h)
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3.3。比较人类之间的响应性抗癌药物阿里结直肠肿瘤瀑样和2 d培养大肠癌细胞系
最近的一份报告显示,3 d文化展品具备干细胞和致瘤性高于2 d (
17 ]。也知道具备干细胞导致电阻高抗癌药物(
18 ]。由于阿里肿瘤瀑样包含众多LGR5-positive细胞(图
3 (g) ),我们检查是否阿里肿瘤瀑样显示抗癌药物的耐药性。比较肿瘤阿里瀑样的抗癌药物的反应,与二维培养的大肠癌细胞系在相同的文化条件下,我们执行96 -基底膜基质细胞生存能力分析(图
4(一) )。研究者用治疗(数字
4 (b) 和
4 (c) )或伊立替康(数字
4 (d) 和
4 (e) )降低肿瘤细胞的可行性阿里瀑样以剂量依赖性的方式在每个病人的文化。的集成电路50 研究者用值如下:T1: 54.91±14.45
μ
g / mL;T2: 201.08±11.48
μ
g / mL;T3: 159.50±4.06
μ
克/毫升。的集成电路50 伊立替康的值如下:T1: 45.29±6.77
μ
M;T2: 26.63±2.21
μ
M;T3: 42.33±4.98
μ
M(图
4 (h) )。另一方面,研究者用治疗(图
4 (f) )或伊立替康(图
4 (g) )在结直肠癌细胞系SW480 SW620 HCT116、诱导细胞死亡在低浓度与肿瘤相比阿里瀑样在每个病人的文化。的集成电路50 研究者用值如下:SW480;0.58±0.03
μ
g / mL;SW620;2.92±0.11
μ
g / mL;HCT116;0.58±0.04
μ
克/毫升。的集成电路50 伊立替康的值如下:SW480;4.65±0.53
μ
M;SW620;1.94±0.31
μ
M;HCT116;3.38±0.24
μ
M(图
4 (h) )。
图4
比较人类之间的响应性抗癌药物阿里结直肠肿瘤瀑样和2 d培养大肠癌细胞系。原理实验设计的一种抗癌药物治疗人类阿里结直肠肿瘤瀑样从三个病人和结直肠癌细胞系(a)。肿瘤后阿里瀑样被播种到基底膜基质,他们接受5 -氟尿嘧啶(研究者用)((b)、(c)
n = 5每三个病人(T1、T2和T3);10 - 300
μ
克/毫升)或伊立替康((d), (e)
n = 5每三个病人(T1、T2和T3);10 - 300
μ
米)为6天。代表相衬的图像显示肿瘤瀑样研究者用对待或伊立替康(b, d)。酒吧规模:200
μ
m。细胞生存能力是决定使用Alamar蓝色代表细胞的可行性分析和100%每个控件(c、e)。治疗效果与抗癌药物在结肠直肠癌细胞系,SW480 SW620, HCT116。细胞被播种到基底膜基质后,他们接受研究者用((f)
n = 5,每个单元格线,0.1 -100人
μ
克/毫升)或伊立替康((g)
n = 5,每个单元格线,0.1 -100人
μ
米)3天。细胞生存能力是决定使用一个Alamar蓝色代表细胞的可行性分析和100%每个控件(f, g),一半最大抑制浓度(IC50 研究者用或伊立替康)值从每个病人和结直肠癌肿瘤瀑样细胞(h)。结果表示为±SEM。
(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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(e)
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(f)
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(g)
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(h)
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4所示。讨论
在目前的研究中,我们首次生成主要人类阿里结直肠正常和肿瘤瀑样从病人。本研究的主要结果如下:(1)正常瀑样显示囊性结构和上皮细胞,杯状细胞和成纤维细胞,但不是myofibroblasts(图
1 ),(2)肿瘤瀑样显示强劲的扩张和复制上皮结构与原来的组织(图
2 ),(3)肿瘤瀑样上皮细胞,杯状细胞,myofibroblasts,癌症干细胞(图
3 ),(4)这些肿瘤瀑样更耐研究者用和伊立替康与2 d细胞培养细胞(图
4 )。总的来说,我们的研究结果表明,结直肠肿瘤patients-derived阿里瀑样复制肿瘤微环境和非常有用的体外三维培养模型研究抗癌药物耐药性。
Myofibroblasts位于基底膜下地穴,促进干细胞自我更新和分化
19 ]。此外,myofibroblasts提供营养物质通过分泌的蛋白质,包括干细胞转化生长因子(TGF)
β
(
20. ]。此外,myofibroblasts已经涉及促进大肠癌增长和入侵
21 ]。自从Ootani等人表明在小鼠肠道阿里瀑样培养肠上皮由myofibroblasts排列(
13 ),我们预计,myofibroblasts会围绕着人类大肠癌阿里瀑样的上皮细胞层。在这项研究中,我们表明,vimentin-positive细胞但不是的
α
sma存在于正常瀑样(图
1 ),表明成纤维细胞的存在但不是myofibroblasts周围上皮细胞层。另一方面,波形蛋白的表达
α
sma是瀑样肿瘤(图中观察到
3 )。这些结果表明差异对小鼠的肠道阿里瀑样。据报道,myofibroblasts来自成纤维细胞和骨髓细胞(
22 ]。它也表明,TGF -
β
可以诱导成纤维细胞的分化成myofibroblasts [
23 ]。此外,据报道,血小板,单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞分泌TGF -
β
(
24 ]。考虑这些报告和我们的数据在目前的研究中,这是暗示基质细胞比正常的,很多肿瘤瀑样的区分成纤维细胞通过分泌到myofibroblasts TGF -
β
在肿瘤瀑样。也是相当myofibroblasts在小鼠肠或人工结直肠肿瘤组织更激活,可以坚持上皮细胞,导致更高的增长从myofibroblasts瀑样通过分泌的生长因子。
一个小族群的耐药肿瘤干细胞促进肿瘤复发,入侵和转移(
25 ]。众所周知,一些干细胞在癌症干细胞标记物表达。最常见的用于癌症干细胞标记排序和分析,LGR5就CD133, CD44,醛脱氢酶1。LGR5就正常肠道干细胞的标志,在癌细胞具备干细胞(也有一个重要的角色
26 ]。在这项研究中,我们发现LGR5-positive瀑样肿瘤细胞的数量明显高于原始组织在任何病人(图
3 )。关于upregulation LGR5就表达的机制在肿瘤瀑样,我们假设stemness-stimulated媒体和间质成分包括myofibroblasts可能有助于增加幸存LGR5-positive细胞LGR5-negative肿瘤组织的细胞死后在阿里的文化。
也表明,肿瘤瀑样更耐研究者用和伊立替康(图
4 )。最近的研究表明,表达水平与抵抗5-FU-based LGR5就结直肠癌患者化疗(
27 ]。也报道,暴露于伊立替康LGR5-positive细胞转变成LGR5-negative细胞,含铅的耐药状态(
28 ]。因此,建议人结直肠肿瘤瀑样更耐研究者用和伊立替康也许通过upregulation LGR5就表达式。然而,详细的支持他们的抵抗行为机制还缺乏了解。进一步的研究是必要的澄清。