对翻译规范脐带间充质基质细胞临床使用:GMP-Compliant介质和一个简化的隔离方法的选择

文摘

脐带派生间充质基质细胞(UC-MSCs)是临床关注翻译但缺乏标准化的方法来隔离和扩张。之前我们发布UC-MSCs隔离和扩张方法提出挑战当考虑良好生产规范(GMP)临床翻译。在这里,一个新的、更标准化UC-MSCs隔离和扩张的描述方法。这种新方法可以消除血管解剖,使用一个密闭离解后酶消化,降低污染风险和操作时间。产生的新方法> 10倍细胞每厘米加州大学比我们以前的方法。传记变量比较时,更多UC-MSCs每克被孤立的阴道出生后剖腹产分娩相比,一个意想不到的结果。UC-MSCs扩大在中富含2%,5%或10%汇集人类血小板溶解产物(HPL)消除异种的血清组件。HPL浓度相比时,媒体补充10% HPL增长率最高,最小的细胞,最可行的细胞。UC-MSCs生长在10% HPL表面标记表达典型的msc、集落形成效率高,能接受trilineage分化。UC-MSCs的新协议标准化生产,使临床翻译。

1。介绍

最小的标准定义间充质基质细胞(MSC)提供的国际社会的细胞疗法(ISCT) MSC工作组在2006年和2013年更新指南描述MSC免疫属性(1- - - - - -4]。msc的生理属性显示一个潜在的治疗疾病,如移植物抗宿主病(GVHD)和克罗恩病(5- - - - - -7]。此外,有超过500个临床试验测试msc列入临床试验的安全性和有效性。政府(8]。

在2014年,大约53%的全世界MSC临床试验使用骨骨髓来源MSC (BM-MSCs) [9]。BM-MSCs可能作为自体的细胞产品,这是一个明显的优势在同种异体MSC产品。然而,BM的集合是一个痛苦的入侵过程,从脐带基质相比,msc (UC-MSCs)从组织收集无痛出生后被丢弃。此外,成人BM-MSCs较低扩张潜力,降低免疫抑制功能当cocultured激活t细胞,或许比UC-MSCs[更受限制的分化潜能10- - - - - -15]。

UC-MSCs有优势BM-MSCs当视为一个同种异体MSC来源。这些优势包括无限供应的起始物料用于生产组织银行作为同种异体匹配产品,就像脐带血库,脐带的集合是无痛,和一致的绳捐助者,年轻的年龄。在体外UC-MSCs增殖潜力高,广泛的分化潜能,改善免疫调制特性(11,16- - - - - -18]。由于这些原因,UC-MSCs熊的治疗潜力测试,以及全球25个临床试验使用UC-MSCs截至2014年(9]。

有“挑战”产生临床应用(msc会议要求2,19]。这引起了人们的猜测,MSC生产能力不能跟上MSC临床研究的数量(19,20.]。这些挑战包括缺乏标准化的方法分离、扩张,和验证msc。例如,几种方法来隔离UC-MSCs从脐带基质被描述21),包括组织外植体的方法(22,23),机械分离脐带间质酶消化[紧随其后11,23,24),隔离msc等整个脐带血管(21,22),酶消化脐血管周围的组织立即(25),或切碎和酶消化的基质(沃顿商学院的果冻)没有血管(24]。这些方法需要的几个脐带血管的解剖。这个解剖步骤增加处理时间和污染的风险。出于这个原因,这里的目标是开发一个隔离方法从而降低污染风险和隔离时间和增加msc的收益率。回顾MSC扩张协议,我们确定培养基配方含有很多成分,这创造了一个障碍为临床制造(24]。因此,我们的第二个目标是识别一个简化的媒介,将提供强劲的扩张msc、xenogen-free,适合临床制造业。

2。材料和方法

2.1。脐带

这项研究被认为非人类受试者的研究机构审查委员会以来,堪萨斯州立大学丢弃,匿名的人体组织与所有识别联系破碎(IRB # 5189)。组织处理了在生物安全柜(BSC)在BSL2实验室使用普遍预防措施/职业安全与健康管理局(OHSA)推荐血液病原体容器中描述29 CFR承担。1910.1030。

在试点研究的数据不是这里介绍,8脐带被用来确定优化变量。在工作这里,24日报道脐带(11个女性和13名男性)使用;脐带从阴道分娩或剖腹产出生。脐带是存储在无菌组织样本容器在4°C到使用生理盐水。试点工作不是这里介绍,脐带被储存长达5天前处理提取msc;但是,没有参数测试来决定是否执行存储改变产品的质量。在这里,出生后4天内组织程序进行。随机化治疗效果,我们没有预先筛分,执行随机分配线样品每个实验变量(生物复制)。

2.2。隔离优化策略

在这里我们先前描述的协议(24)是优化降低污染风险,提高产量,改善GMP兼容性。对于每个脐带(生物单元),八个随机选择的样本用于测试1厘米长度对实验的影响变量确定的试点工作。两到四个优化变量进行评估/绳使用技术复制和每个实验的平均结果变量/生物单元的比较。首先,我们测试机械破坏的组织使用Miltenyi GentleMACS分离器使用预排程序的设置(# 130-093-235)a, B, C, D, E(对应于最弱到最强分离)。接下来,组织解离酶消化测试之前或之后进行。然后,切碎的影响组织样本与组织分离使用GentleMACS分离器。接下来,使用100过滤的效果μm细胞过滤器(Fisherbrand # 22-363-549)和60μm Steriflip管(微孔# SCNY00060)进行了测试。最后,酶的浓度变化来确定对产量的影响。技术复制或一式三份平均每线每个变量样本。每个程序优化变量是评估使用至少三个不同的线复制。决策策略是设计使用制程良率(更多的活细胞)或提高过程效率(减少数量的处理步骤,减少时间,或减少污染风险)。

2.3。最后的(优化)隔离方法

修改方法的示意图如图1。脐带是冲洗去除表面血液使用37°C DPBS 1% Antibiotic-Antimycotic(杜尔贝科的磷酸缓冲盐,生活技术# 14190 - 250;Antibiotic-Antimycotic,生活技术# 15240 - 062)。绳子被接受0.5% Betadine (Dynarex, Providone碘溶液,# 1416)在室温下DPBS 5分钟。在生物安全柜(BSC),绳子是切成1厘米的长度和反复冲洗3卷DPBS,直到没有进一步的表面可以看到血。每1厘米长度组织切成4个相等大小的块,放入Miltenyi生物技术分离器管(Miltenyi # 130-096-334)。组织重量计算减去皮重的管和9毫升的酶解决方案是补充道。C-tubes被置于一个Miltenyi分离器、加工利用项目C和孵化为3 - 3.5小时37°C与常数12 rpm旋转。3 - 3.5小时孵化后,组织使用项目B和过滤分离60μm Steriflip过滤器(微孔# SCNY00060)移除组织碎片。这些细胞被颗粒状在200×g离心5分钟在室温和上层的被丢弃。细胞悬浮在0.5毫升的增长媒体和0.5毫升红细胞溶解溶液(σ的红细胞裂解方案,# r7757 - 100毫升)添加删除血红细胞污染。细胞混合轻轻一分钟增加8毫升DPBS紧随其后。在200×g细胞离心5分钟在室温和上层的被丢弃。这些细胞被悬浮在1毫升的媒体和活细胞的数量决定使用Nexcelom汽车2000 Cellometer(免疫细胞,低红细胞)后ViaStain AOPI(吖啶橙和碘化propidium)染色可行性(Nexcelom猫。# CS2-D106-5ML)。细胞被镀在10000 - 15000年生活细胞/厘米²在组织培养处理塑料(CytoOne 6-well盘子,# cc7682 - 7506)。

2.4。优化MSC扩张

我们先前所描述的方法MSC扩张中用于比较的标准。因为这中包含10多个组件(24),我们的目标是减少中组件的数量,同时保持MSC附件在隔离/启动和维护MSC扩张,CFU-F效率,trilineage分化潜力,MSC表面标记表达式,和细胞形态相似或优于标准。这里,低葡萄糖杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM生活技术的猫。# 14190)补充1% GlutaMAX(生命技术的猫。# 35050),有1% Antibiotic-Antimycotic,按体积计算,2、5或10%汇集人类血小板溶解产物(HPL,汇集来自超过25过时的血小板捐献者,由堪萨斯大学医学中心诊断实验室,洛厄尔Tilzer博士,主任)和4单位/毫升肝素进行了测试。这些细胞被镀在10 - 15000细胞/厘米²在CytoOne平底组织培养处理6-well盘子和扩大5段落。细胞培养和成长为一个单层37°C, 5%的公司₂4950年,90%的湿度(Nuaire自动流程图或Heracell 150 i)。一旦细胞达到大约80 - 90%融合他们解除和电镀的新媒介。提升细胞,媒介被和37°C DPBS细胞被洗。DPBS被删除,取而代之的是37°C 0.05% trypsin-EDTA (Lifetech # 25200 - 056)。3-5-minute孵化后在37°C,这些板块都释放细胞和酶消化终止了3卷的媒体。在200×g细胞颗粒状在室温下5分钟。浮在表面的丢弃和1毫升的媒体是暂停使用细胞。细胞数使用Nexcelom汽车2000 Cellometer ViaStain AOPI染色试剂使用制造商的协议和一个内置的设置。在通道、细胞的数量比例的活细胞,细胞大小和文化记录的小时数。镀细胞最初的密度大约10000个细胞/厘米²;用这个作为初始细胞数量和细胞的数量在收获最终的细胞数量和文化,人口倍增时间使用标准的计算公式。有时,额外的细胞冷冻供以后使用。冻结,细胞冻存使用1:1的比例HPL媒体和cryopreservative (Globalstem # gsm - 4200),在冰上,直到传输控制速率冷冻设备(冷淡)先生和被放入−80°C冰箱过夜。第二天,瓶被转移到液氮的汽相长期存储。

2.5。CFU-F化验

msc镀在10、50或100个细胞/厘米²在复制6-well CytoOne组织培养板2,5,和10% HPL丰富DMEM(如上所述)。四个细胞系在文化,扩大了4天前固定和亚甲蓝染色。后续测试4 - 7天的文化的密度5,10,每厘米或50个细胞²。后所需的文化时期,中移除,细胞被洗DPBS然后固定使用4°C 100%甲醇5分钟。细胞与DPBS再次洗,沾0.5%的亚甲蓝15分钟,用蒸馏水冲洗几次,空气干燥。手工染色殖民地被数40 x放大。殖民地被定义为孤立的组(克隆组)的至少10细胞。平均菌落数是由殖民地的数量技术复制在每个电镀密度对于一个给定的扩张时期。集落形成效率计算镀细胞的数量除以殖民地的数量。

2.6。分化

分化MSC被取代的扩张中诱导MSC分化培养基(StemPro,生活技术#年代A10070-01 A10071-01, A10072-01脂肪形成的,chondrogenic,和成骨分化)和遵循制造商的协议。经过21天的分化,分化中删除;msc与DPBS洗,用4%多聚甲醛固定10分钟,和沾油红脂肪细胞进行分析,红色染料O chondrogenic细胞,或茜素红S成骨细胞。显微图被使用一个evo FL汽车显微镜(技术)。

2.7。流式细胞术

BD人类msc流式细胞仪鉴定装备用于正面和负面的表面标记染色(# 562245)。使用制造商推荐的协议,MSC样本染色和四个荧光染料在一起包括积极的和消极的染色鸡尾酒。积极标志鸡尾酒彩色CD90、CD105, CD73(定义为> 97%阳性染色)。消极的鸡尾酒(所有抗体都是使用一个单一的荧光染料染色,PE) CD34染色,CD45, CD11b, CD19和HLA-DR(定义为< 2%阳性染色)。CD44贴上PE抗体作为积极控制消极鸡尾酒设置补偿和闸门的负面的鸡尾酒。对于每一个流式细胞仪运行,为每一个荧光染料荧光- 1控制和同形像控制每个抗体被用于补偿和非特异性荧光分析。样本用1% BSA溶液染色之前和之后。FACScalibur (BD生物科学)是用于流式细胞术和分析是使用FCS软件进行的。负染法门同形像控制设定在1%的阳性染色。

2.8。统计数据

确认后,方差分析正常和方差齐性的假设是,方差分析被用来评估优化变量之间的显著差异。如果违反了这些假设,数据又改变了数学和测试是否满足方差分析的假设。假设检验是正反(例如,平均1≠平均2)。在方差分析,发现显著的主效应(s)或交互方面,事后意味着测试计划进行了比较使用Bonferroni调整或Holm-Sidak方法。意义是。数据表示为平均(平均)+ / - 1标准错误。在一个案例中,为了通过正常测试(Shapiro-Wilk)一个“局外人”删除。离群值被移除后,数据集通过正常试验和方差分析确定HPL浓度有显著影响。SigmaPlot v.12.5 (Systat软件)是用于统计数据和图表。SigmaPlot得救了EPS文件中创建的图表和搬进了一个基于矢量的图形包(Adobe InDesign或Adobe Illustrator CS6)编辑和呈现。

3所示。结果

3.1。脐带

脐带从剖腹产交付()和“正常”的阴道分娩()被用于这项研究。每个绳的传记数据如表所示1。

3.2。隔离法比较

注意,MSC扩张比较被认为是通道1 - 5,和通道0被认为是分离MSC的一部分。结果从我们先前所描述的方法(历史数据来自27个脐带(24])和优化方法进行了比较。如图2优化方法取得了平均10倍的msc /厘米长度比原来的方法,取得了msc在加州大学样本的100%。请注意,在我们确定变量优化试点工作,我们确实无法分离msc在两种情况。但即使在这种情况下,msc不同样品中分离出同样的加州大学(例如,在任何情况下我们怀疑加州大学并没有可行的msc)。虽然我们没有测试细菌、病毒或真菌污染,没有打破在不育是明显的(例如,没有观察到弗兰克污染和没有丢弃文化由于污染)。活细胞每厘米长度或每克比较表1;有一个趋势的变异系数为每克活细胞更少。优化的方法使用一个封闭的组织破坏和处理系统总共需要4小时的工作时间+ 3小时酶提取步骤分离脐带msc。观察MSC附件在24小时内的隔离和扩散在所有三个HPL媒体富集条件。如图2 (c)在隔离阶段(P0) UC-MSCs增长更快镀在5%或10% HPL浓缩比镀UC-MSCs DMEM HPL丰富DMEM 2%。可能UC-MSCs生长在5或10% HPL丰富DMEM附加更快比生长在P0 HPL丰富DMEM 2%。HPL富集培养基2%的增长率差异是统计上的不同(慢)P0之后的段落(见图2 (c)和3(一个)),明显不同于5(慢)和10% HPL丰富媒体在隔离和扩张。

3.3。MSC扩张比较

注意,MSC扩张比较被认为是通道1 - 5,和通道0被认为是分离MSC的一部分。UC-MSCs扩展段落1 - 5。UC-MSCs评估在3种不同生长条件:DMEM HPL补充2%,HPL HPL 5%或10%。双向方差分析(主要影响HPL级别和扩张)发现了一个显著的主效应(HPL浓度)附件和扩张。在事后测试,我们发现更多更得到当细胞扩大约30% 10% HPL丰富DMEM培养基相比,5% HPL富集培养基(细胞每厘米²与HPL富集培养基(图5%3 (b))。同样的,事后测试显示显著缩短人口翻倍时候msc HPL(扩大10%小时),相比小时HPL和5%小时2% HPL富集培养基(如图3 (c))。如图3 (d)msc在10% HPL丰富DMEM HPL平均为17%比那些生长在小2% (μ米和μm)和10%小于细胞生长在5% HPL富集培养基(平均5通道,μ米)。这一趋势在HPL MSC大小中等条件第二通道(图之后变得明显3 (e))。HPL介质浓缩在通过影响细胞的生存能力,指出(见图3 (c))。微妙但显著差异被发现在可行性三个介质之间的通道条件:msc在扩大DMEM补充10% HPL有更高的生存能力比生长在DMEM HPL补充2% (%与%)和5% HPL补充媒介生存能力明显大于2% HPL介质(%;参见图3 (c))。

理论细胞产量计算假设整个脐带被孤立和扩大在每个通道5介质条件。如图3 (f),据估计,总收率超过10¹²msc(一万亿细胞)在通道5 UC-MSCs扩大HPL补充介质和超过10 10%¹¹msc UC-MSCs扩大的HPL(图中补充了5%3 (f))。

3.4。评价UC-MSC特点

性的捐赠数量没有影响msc孤立(图2 (b)),或者msc后获得的估计数量扩张(数据未显示)。相比之下,显著增加细胞的数量为UC-MSCs隔绝孤立被发现正常阴道分娩相比收集后剖腹产交付(见图2 (b))。

3.5。集落形成Unit-Fibroblast (CFU-F)数据提出了归一化单位:集落形成效率(CFE;《=镀细胞的数量除以殖民地的数量)

如图4 (e),HPL补充的浓度没有影响CFE 10细胞/厘米²(100细胞/ 6-well板)经过4天的文化。相反,当镀50个细胞的密度每厘米²和4天的文化扩张,10% HPL补充导致增加集落形成效率比2和5% HPL: 2 - 4 msc镀时需要形成一个殖民地与10% HPL(图中补充4 (e))。见图4 (e)正如之前报道(26,27),电镀密度影响集落形成效率和更高的效率在降低镀层密度。因此我们确定更高的效率将会发现电镀密度低于10细胞/厘米²在HPL镀后。集落形成效率最高的msc镀时被发现在5细胞/厘米²6天(50细胞/ six-well板);在中补充10% HPL:平均的两个msc殖民地形成(见补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/6810980)。

3.6。分化

msc孤立和扩大使用优化方法进行三间叶细胞谱系分化,骨,软骨,脂肪为3周后暴露在分化培养基条件。图4显示msc分化脂肪和chondrogenic和成骨的血统后关闭隔离方法和HPL补充DMEM扩张通道5 10%。暴露于脂肪形成的分化培养基在msc导致脂滴的形成,沾油红(图4(一))。暴露在成骨分化条件导致钙沉积形成在msc与茜素红染色(图4 (b))。Cartilage-like组织在集群形成后的细胞暴露在分化培养基的粘多糖由红色染料染色O chondrogenic细胞(图4 (c))。

3.7。流式细胞术

流式细胞仪是用于分析表面标记表达式在5 MSC行隔离使用封闭处理协议和扩张后使用10% HPL补充DMEM 5段落。积极表达高(> 95%)表面标记CD73, CD90、CD105,观察CD44(图5为代表的结果,所有的流式细胞仪数据补充表1)。低表面制造商表达式(< 0.5%正面)观察CD34、CD45、CD11b, CD19,和HLA-DRT(补充表1):评价冻融的影响msc表面标记表达式,msc的四行进行评估之前和之后冻结/解冻循环。之间没有显著差异被发现在表面标记表达式冻结/解冻,从不冻结msc在表面标记表达式(补充表2)。

4所示。讨论

干细胞和再生医学临床试验的加速,尤其是MSC试验,产生了新的努力标准化生产和表征GMP-compliant安抚的MSC。脐带MSC有许多优势,表明它们可能是细胞治疗的一个重要来源同种异体MSC,, MSC临床试验的趋势在世界范围内,这种MSC来源是必要的。

为了开发一个SOP UC-MSCs GMP生产,我们在先前描述的方法确定限制UC-MSC隔离和扩张,代表对GMP生产障碍。先前的隔离方法,首先,我们需要一个漫长的解剖步骤的脐带和手动删除前血管装腔作势的沃顿商学院的果冻是耗费时间,增加了污染的可能性。在这里,我们试图减少处理时间,降低污染风险。我们推断一个标准化的方法解放msc从沃顿商学院的果冻可能产生更多的同质产品。第二,前所述UC-MSC介质,原本被凯瑟琳Verfaillie MAPCs扩张的实验室,与10多个组件是复杂的,它含有2%的边后卫,异种的产品(28]。我们试图确定一个简化的媒介,可以自由的异种的材料,包含更少的组件。我们测试了人类血小板溶解产物(HPL)富集培养基。以前的工作表明,HPL GMP-compliant格式可以产生和msc(据报道产生良好的扩张29日- - - - - -31日]。在这里,我们发现5或10% HPL浓缩大大改善了MSC扩张P0(初始隔离)。此外,我们发现在章节1 - 5强劲扩张。因此,使用HPL-enriched介质消除两种UC-MSCs GMP-compliant制造障碍。然而,使用一个汇集人类血液产品不是没有一定的风险,他们已经有所减轻(下面讨论)。由于样本抽样可变性,池的血小板溶解产物必须产生一个统一的产品(32]。例如,人类病原体,逃避检查的提供者可能污染HPL样本。一个可能的方法来解决这种风险将在HPL病原体灭活(33]。我们没有灭活汇集HPL病原体,但反复冻融过程之后,通过一个0.2微米过滤器过滤应该删除所有潜在的细菌和寄生虫。虽然γ辐照是可能被认为是降低病毒的风险,血液从血库中获取产品用于临床使用,因此遇到的所有现有血液筛检安全措施。

在这里,1厘米的线是用来优化协议。一厘米长度部分脐带提供充足的细胞来隔离和扩张,和许多可用的技术复制从一线检查允许多个实验变量在每个绳(生物变量)。我们假设一个随机选择的,一个厘米长度的绳子将充分代表了脐带(例如,细胞分布和脐带细胞外基质是同质)。这个假设并不验证了我们,我们也不知道任何调查,支持或否认了这种假设。脐带显示巨大的生物密度(每单位长度重量)的变化,直径和物理机械性能可能由于血管周围细胞外基质的数量(见表1)。克/厘米测量不同在每个技术复制从一个单一的线和不同脐带,。这表明多个生物的重要性和技术复制执行优化测试时,使用脐带。细胞的数量差异之间脐带一样的密度和数量的细胞外基质。因此,生物变异限制制造标准的细胞治疗产品的能力。例如,msc的生理变化之间的脐带和我们如何优化msc的临床效果?我们认为,细胞分离后首次通过生理学相似,但这种假设将需要更多的试验来证实。

几个协议隔离msc的脐带已经出版的不同部分(26,34,35]。这些协议需要解剖的脐带的不同部分和各种方法来丰富msc从主隔离人口。这有助于细胞的数量变化主要隔离和他们进行文化扩张的能力。我们没有观察到弗兰克msc孤立的人口差异提取后从沃顿商学院的果冻和隔离后中断整个1厘米线的片段。我们发现整个1厘米长度的提取使用这里描述的方法给出了>输入细胞的数量增加10倍的主文化。我们组织属性的操作(详细解剖消极地影响附件和扩张)和红细胞的更有效的去除污染(血液负面影响生存能力,附件,和扩张的msc)提取和扩张效率提高。

以前我们使用“绳长度”测量比较声带之间的收益率。这里,我们跟踪的长度和重量来决定被证明是一个更好的预测细胞产生初始隔离。脐带长度和重量之间的差异反映在表1。见表1相比,体重是一个更可靠的测量线的长度。需要额外的工作来确定差异预测总细胞产量从脐带和估计的值。我们还没有从整个脐带处理细胞,因此无法确认这些估计的准确性。我们当前的方法很容易扩大,所以这些信息。

细胞数量的增加从优化协议可能归因于更快的处理和减少解剖分离msc。不去除血管,优化的方法是一个重要的离开我们先前所描述的方法。因此,该投进怀疑同样的细胞群被孤立,以及是否使用优化方法获得的msc是相似或不同于使用前面的方法获得的。就像前面提到的1几种不同的方法从脐带获得msc描述,目前还不清楚是否每个隔离相同的细胞。我们的数据并不直接解决这个问题,但我们在这里展示,后评价5脐带MSC隔离;细胞分离的优化方法符合ISCT msc(标准4]。

据我们所知,本文是第一个证明MSC隔离效率之间的差异从脐带来自阴道分娩和剖腹产分娩。阴道分娩后脐带有更多的细胞每隔离约41%(图2 (b))。观察之前,我们更倾向于使用剖腹产脐带MSC隔离,因为我们认为收集手术会减少污染风险相比,绳收集后通过产道。在这个研究中我们没有发现污染的差异从阴道分娩或剖腹产脐带。类似于我们的观察从阴道和剖腹产的绳索,msc脐带血收集的体积减少了阴道分娩是剖腹产出生(36,37]。我们没有看到细胞的数量之间的性别差异分离MSC膨胀率或号码。酶消化使用高浓度的消化酶在隔离(图倾向于有更高的收益率2 (b))。视觉上,更高浓度的酶样品相比似乎更少的碎片在初始镀相比,酶浓度较低。

初始镀后细胞隔离协议期间,有一个延迟细胞附件。对msc的底物是一个定义特征和msc扩张似乎是必要的。我们隔离后指出,msc,在章节1 - 5,msc附加和镀后24小时内开始扩大。相比之下,达到融合的时间隔离和初始段显著影响延迟附件。这里,我们包括P0数据与MSC的隔离和考虑段落1到5的扩张阶段MSC描述。我们注意到一种趋势,当有一个更高的生存能力在初始隔离,细胞连接更好、更快的扩大。在我们之前的工作,细胞生存能力不是记录在初始孤立。,使用Nexcelom ViaStain AOPI可行性分析提供了一种量化方法一致的结果,给超过台盼蓝和手工计算使用血球计(以前是我们如何计算细胞)。自动细胞计数有助于优化和生产标准操作规程。

当考虑绳样品,生产公共银行冻结在P0主隔离P1可能是必需的。其他人已经报道这种影响细胞表面标记表达式或生存能力(38]。出于这个原因,我们评估没有冷冻细胞和细胞表面标志物表达受到冻结/解冻循环。流式细胞术分析并没有显示出不同的表面标记表达新鲜细胞之间(例如,那些从不冻结)和细胞冷冻和解冻细胞四人脐带msc。未来需要测试来证实这些结果站在一个更大的样本量。临床试验需要的冷冻细胞使用,使用新鲜的细胞在临床试验中是不可行的当你考虑必须做严格的质量控制和发布测试来确定这些细胞满足临床使用的标准。

这里,人类血小板溶解产物丰富媒体三个不同浓度(2%,5%,和10%)用于分析影响初始隔离(P0)和增长msc的段落1 - 5。我们通过通道5评估msc描述扩张潜力。我们观察到,P0 P1扩张表现出最高的变异量增长率(见图2 (c)和3(一个))。结果从六个脐带没有显示人口倍增时间段落1 - 5之间的差异,通过细胞的数量,和可行性(数据未显示)。然而,这三个媒体条件并影响这些变量。浓缩HPL富集培养基为2%比5%和10%显著不同HPL丰富媒体人口翻倍,细胞大小、细胞数量和生存能力。浓缩2% HPL慢人口翻了一番,更少的细胞通道,大细胞,较低比例的可行的细胞通道。我们观察到的趋势与更好的结果对这些测量HPL浓缩在中增加。因为这个原因我们选择10%的新标准用于种植UC-MSCs媒体条件。UC-MSCs细胞大小是一个变量之间我们没有期望有显著不同的媒体条件下,但我们观察到显著差异在细胞大小HPL浓度较高。我们注意到一种趋势,细胞大小最初增加在第一段,然后减少在后续章节所有媒体条件(数据3 (d)- - - - - -3 (e))。我们不能解释这个观察。进一步的工作是需要评估细胞大小是否受到通道的影响,因为我们以前观察到衰老细胞更大,因为我们希望通过增加细胞衰老。如果相反的是正确的,例如,这一事实更快速分裂的细胞小,然后细胞大小数据可以支持我们的结论,10% HPL UC-MSCs最佳生长条件。先前的工作表明,较小的msc与快速分裂表型可能被镀的密度3细胞/厘米²(39]。在这里,我们没有评估电镀密度对扩散的影响。未来的工作应该评估电镀密度和10% HPL媒体之间的交互来优化生产效率。

MSC描述是由评估细胞表面标记流式细胞术,CFU-F,和分化能力。所有五个细胞系我们用流式细胞仪分析了高水平的表面标记与msc。阳性细胞比例高(> 95%)与以前公布的方法(24]。这些结果表明同质细胞群被隔离尽管血管为隔离步骤还没有废去。分化能力评估在相同的五个细胞系和所有显示trilineage分化能力。的能力去分析了油红O染色分化细胞胞浆内脂滴堆积。分析显示的多个内脂滴形成大量细胞(图4(一))。细胞死亡发生在时间区分,导致脂肪形成的细胞图之间的空间。成骨分化与茜素红染色分析钙沉积的形成年代。染色观察钙沉积在细胞和细胞内见图4 (b)。Chondrogenic分化细胞被沾染了红色染料O评估如果软骨粘多糖。这通常分化产生了循环殖民地,剩下坚持他们强劲的板块和染色对红色染料o .一个个独立王国的组织学部分通常用来评估chondrogenic谱系分化。我们的研究结果表明这不是必要的时候小殖民地的细胞仍然附着(图4 (c))。虽然结果不量化,多行之间的染色和重复的质量提供了很好的证据,msc孤立和扩大新方法的健壮trilineage分化潜能。

成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)效率分析自我更新UC-MSCs的潜力。相比之前的研究对于UC-MSCs扩大21%的氧气,需要更少的细胞形成一个殖民地使用这里描述的方法,提出一个更高的集落形成效率(27]。我们认为10细胞/厘米²更可靠的测量HPL浓度由于难以计数的影响细胞在50 /厘米²。的快速增长率10% HPL富集培养基我们之前CFU-F协议不可靠的,因为板块增长太快。我们测试了生长条件测量集落形成效率通过分析镀天与菌落计数。我们发现细胞的数量,形成殖民地减少每天的增长;例外是50个细胞/厘米²这增加了。CFU-F效率最高为5细胞/厘米²细胞生长了6天。我们决定使用10和50个细胞/厘米²为CFU-F收益率一致的数据。自我更新数据(集落形成效率)是很重要的,当估计MSC线的扩张潜力。CFU-F更高效率与MSC行显示一个更强劲的增长潜力。确定这些快速增长的方法分析CFU-Fs细胞允许使用UC-MSCs增长潜力为未来的研究分析。

在这里,我们提供了一个新的优化方法来隔离和UC-MSCs扩张。相比以前的方法,增加总MSC收益率在10倍以上的初始隔离,和更少的时间需要从脐带分离MSC。此外,这种方法降低了整体扩张通过减少人口增加一倍的数量需要满足我们生产每批2 - 10欧元的目标细胞。首次隔离以最小的方法使用封闭的系统解剖的线,因此,降低污染风险,同时减少处理时间。该方法使用一个简化的组件(5),xenogen-free媒介,可以升级为扩大GMP-compliant组件。使用这种优化处理协议产生的msc描述和简化介质包括在内在体外扩张,集落形成效率,trilineage分化成骨,chondrogenic,和脂肪形成的血统,表面标记表达式通过流式细胞术表明msc是由该方法制造的。需要进一步研究来证实,msc孤立和扩大使用这种方法将执行在活的有机体内作为细胞治疗。我们正在开发一个在活的有机体内模型测试效力的msc可以作为合适的分析比较各种操作,如“启动”的效力或者许可的msc。总的来说,这项工作将速度UC-MSCs临床翻译提供的基础化学和制造控制(CMC)新药应用程序的一部分进行调查(印第安纳州)。

5。结论

隔离和扩张的方法我们开发UC-MSCs解决一些挑战翻译临床使用。我们报告一个MSC产量增加阴道分娩相比,剖腹产出生。新的分离方法提供了必要的细胞产生银行和使用一个封闭的系统,可以很容易地扩大和扩大媒体补充HPL有最好的增长率为10%。这些结果提供了改进可能支持UC-MSCs GMP制造。完成这个新方法的验证,功能测试免疫调制或再生潜力测试是必要的。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢苏珊·m·贝内特博士,医学博士的女性健康组和通过克里斯蒂医院OB病房护士和工作人员寻求帮助与脐带的集合。实验室人员在香港他博士迈克尔·祖尼加杰克吉梅内斯,珍娜·克鲁格是Shoshanna Levshin,“丹尼尔”图恩湖Quach,和港区Van Bui感谢他们的帮助。

补充材料

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