文摘

间充质干细胞(msc)是一种成人多功能细胞组织再生。小鼠msc增殖不佳在体外normoxia之下。本研究的目的是分析nonphysiological高氧和低剂量之间的交互γ-射线在增长,衰老和DNA损伤。Tri-potent骨骨髓来源msc和p53野生型p53 /−−老鼠培养下O 21%或2%₂。长期观测显示的野生型mMSCs增殖能力下降,形成殖民地在normoxia扩展文化。这是伴随着增加衰老normoxia下但不与端粒缩短有关。在低剂量γ-射线,常氧野生型细胞衰老的程度进一步增加。辐射诱导的数量γH2AX DNA修复病灶在mMSCs保持较高normoxia但不是在p53−−细胞。clonogeneity P53-deficient msc另外显示高,衰老水平较低,更少γH2AX修复病灶每个细胞p53野生型同行相比无论氧气水平。这些结果表明,氧含量在一起γ-射线和p53状态是相互联系的因素调节BM msc在长期文化的增长能力。这些努力有助于更好地理解和优化前处理msc治疗使用。

1。介绍

间充质干细胞(msc)多功能终身扩散能力的成年有机体。可能为成骨细胞生成前体脂肪细胞,成纤维细胞,内层在体外(1,2)促使它们也可能是一个水库结缔组织损伤后的再生和骨折或在正常细胞损失(3]。因为他们multilineage分化能力和长期增殖潜力,他们已经收到利息作为车辆的治疗慢性退化性疾病和急性组织损伤(4]。收获的相对轻松地促进自体msc移植到病变靶器官,通常细胞后一直在扩大体外(5]。他们的一些疗效也发现被授予移植msc分泌的抗炎和免疫调节的因素,而不是由活细胞的生成子代(6]。这也许可以解释他们的报道效率补充剂在伤口愈合7),骨髓移植(减少移植物抗宿主病,移植物抗宿主病)8),和心脏手术9]。

在529年写这篇文章的时候,使用msc全球注册临床试验(https://www.clinicaltrials.gov/),大多数用于治疗中枢神经系统的疾病(12%),心脏疾病(10%),各种类型的自身免疫性疾病(9%)、关节和骨骼疾病(8%),代谢紊乱(7%),和移植物抗宿主病(6%)。虽然自体MSC移植的治疗手术被认为是安全的和更健壮的同种异体的移植协议的成功治疗患者个体变量(10]。在多大程度上移植msc增殖以及他们是否能够区分为全功能的细胞再生能力的受损组织通常是不确定11]。机制的遗传、表观遗传或环境因素管理效率的MSC治疗很难直接评估病人,但可以系统地研究了生物模型豚鼠、小鼠(12,13),或minipig [14]。

我们感兴趣的影响基因毒性压力作用于msc之前和期间体外扩张,特别是通过non-physiologically高氧含量和电离辐射(IR)。真核细胞的敏感性IR-induced细胞杀死取决于氧的存在(15]。在体外癌症细胞系的研究显示,缺氧赋予抗辐射性,有关细胞核的DNA损伤水平较低(16]。msc在正常的生理环境中驻留在缺氧环境17,18),因此可能相对激进的氧物种的保护(ROS),所产生的电离辐射。对于造血干细胞来源于骨髓,暴露在大气中的氧气已经证明触发EPHOSS (extraphysiologic氧冲击或压力)与p53通路的激活和mitochondria-mediated凋亡[19]。虽然我们的研究表明,细胞凋亡,细胞与造血的,不常见的机制在msc老化或细胞遗传学压力后,p53-mediated DNA损伤反应(DDR)也可能损害他们的干细胞能力过早衰老或分化。由于小鼠msc增长在体外取决于一个缺氧的环境(20.),他们是一个合适的模型来研究氧诱导细胞压力的机制还单独和结合低剂量的辐射。

我们已经检查了增长能力,单独使用潜力,衰老感应,DNA损伤积累,mMSCs的端粒摩擦速度下两个不同的氧气浓度。自从第一次发现建议衰老感应和参与DNA损伤积累,我们用低剂量测试这种假设γ-射线mMSCs比较p53的野生型p53−/−细胞。

2。材料和方法

2.1。培养初级小鼠msc

女性FVB / N p53wt / wt和C57BL / 6 p53−−老鼠,3 - 12个月大的时候,最初是由查尔斯河实验室(Sulzbach、德国)和维护在亥姆霍兹慕尼黑中心的育种群体在特定的无菌条件下。收集骨髓msc,老鼠被公司牺牲₂曝光,后肢是无菌的,和股骨附着组织清理。每一个股骨被收集的,骨髓冲洗与冰冷的PBS。后将大团的骨髓,让剩余的细胞团沉积物,上层是离心机在300×g(5分钟),以及由此产生的细胞颗粒与PBS又洗了。最后,镀骨髓细胞的细胞密度每6-well 5000000板在DMEM / F12媒体包含10%的间充质干细胞合格的边后卫(生活技术,卡尔斯巴德,CA)。文化被保存在一个湿润有限公司5%₂孵化器在37°C下21% (normoxia)或2%(缺氧)O₂。4 h后6 h,为接下来的三天,一天两次上层清液含不依从细胞是吸气和新鲜的完全培养基补充道。秉承细胞增长了7天,分离为使StemPro Accutase细胞分离试剂(技术),和细胞数量得到使用库尔特计数器分析仪(贝克曼库尔特,沥青,CA)。生长介质改变每3.5天,细胞通过一周一次。

2.2。在体外感应的谱系分化

来验证multilineage分化潜能(补充图在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/6429853)3000年的孤立mMSCs镀在密度(成骨的),10000(脂肪形成的),或80000 (chondrogenic)细胞每口井96年文化板块。chondrogenic分化,细胞被允许附加2 h在诱导分化之前,使用chondrogenic分化培养基。在成骨细胞和脂肪形成的分化与适当的刺激分化培养基后2到3天。剩余的井作为控制使用正常的MSC生长介质。所有在缺氧条件下分化进行了分析。血统感应后,文化被染色和可视化在日本基恩士BZ9000显微镜(日本基恩士,Neu-Isenburg,德国)。

2.2.1。碱性磷酸酶染色的成骨分化

小鼠在StemPro msc刺激长达2周骨细胞和软骨细胞分化基础培养基补充StemPro骨(生命技术)的补充。与4%多聚甲醛固定细胞后,碱性磷酸酶活动揭示了SigmaFast BCIP /电视台发色体染色(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州)据PromoCell应用注意“成骨细胞分化和矿化”(PromoCell GmbH,海德堡,德国)。

2.2.2。油红O染色脂肪形成的分化

小鼠msc刺激了2周与StemPro StemPro脂肪细胞的分化基础培养基补充脂肪形成补充(生命技术)。与4%多聚甲醛固定细胞后,脂质空泡是彩色的45分钟在室温下油红O缓冲溶液(60%异丙醇3毫克/毫升油红O(西格玛奥德里奇),40%的H₂O),用水冲洗。

2.2.3。阿尔新蓝染色Chondrogenic分化

小鼠msc刺激3周在StemPro骨细胞和软骨细胞分化基础培养基补充StemPro软骨形成补充(生命技术)。与4%多聚甲醛固定细胞后,蛋白聚糖aggrecan软骨细胞外基质是由阿尔新蓝染色8 gx染料(西格玛奥德里奇)据PromoCell应用注意“MSC chondrogenic分化和分析”(PromoCell)。

2.3。单独生存

单独测量的生存,在500年和5000年之间mMSCs / 75厘米²被播种在细胞培养瓶normoxia或缺氧。在10到14天之后,集落形成能力是化验后乙醇固定和染色(默克公司,达姆施塔特,德国)染色。电镀效率比例是由以下公式计算:(数量的殖民地形成/数量的种子细胞)×100。

2.4。辐照

辐照cs - 137的执行mMSCs辐照器(HWM d - 2000、西门子、德国)的剂量率0.5 Gy /分钟。辐照剂量低于0.5 Gy,屏蔽铅盒使用衰减因子的10%。疫苗接种在室温和控制细胞sham-irradiated。在整个辐照过程(约20分钟)细胞培养器皿用封口膜密封,以减少气体交换。

2.5。衰老的分析

衰老相关的评估β牛乳糖活动辐照后7天,subconfluent mMSCs 96 -文化盘子洗了PBS, 4%多聚甲醛固定,再用PBS洗净,和彩色12 h在37°C的半乳糖苷钠缓冲溶液(40毫米₂HPO₄150毫米氯化钠,MgCl 2毫米₂5毫米K₃铁(CN)₆5毫米K₄铁(CN)₆h·3₂啊,半乳糖苷和1毫克/毫升、pH值6)。五彩缤纷的显微镜图片拍摄与日本基恩士BZ9000显微镜。

2.6。p53的稳定性和分析γH2AX DNA损伤修复病灶

小鼠msc被播种在玻片和生长在缺氧或normoxia至少24小时。辐照后,这些细胞被固定在指定的时间点(p53甲醇或4%多聚甲醛γH2AX)。固定细胞被洗在PBS, 0.05%处理皂素Triton-X p53(40分钟)或0.2%(5分钟γ在PBS H2AX) PBS,水洗,阻塞10毫克/毫升BSA和1.5毫克/毫升甘氨酸在PBS 1 h在室温下。细胞培养与主磷酸化抗体γH2AX(纽约北部的生物技术,普莱西德湖)稀释抗体稀释溶液中(DCS,汉堡,德国)或对p53 (R19,圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)在PBS至少90分钟。为可视化山羊anti-mouse Cy3-conjugated二级抗体(通用电气医疗集团GmbH,弗莱堡,德国)稀释在二级抗体抗体抗体稀释溶液或HRP-conjugated驴(圣克鲁斯生物技术)洗后使用幻灯片在PBS(和阻止氧化酵素15分钟0.2% H₂O₂p53)。p53免疫组织化学染色,SIGMAFAST轻拍(3、3′-diaminobenzidine利乐盐酸,西格玛奥德里奇)添加了一夜。最后PBS洗涤步骤幻灯片后安装在DAPI-containing安装介质,分析了日本基恩士BZ9000显微镜。日本基恩士软件计算核焦点至少50细胞。得到适当的负控制染色与二级抗体只复制幻灯片。

2.7。端粒长度的决心

定量PCR的基因组DNA提取mMSCs完成测量端粒的长度(21]。为此,存在使用成立(TTAGGG) n引物检测端粒序列和基因组微卫星标记引物(D14Mit192)基因组DNA正常化在两个不同的反应。StepOne定量实时放大了⁺设备(技术),使用“权力Sybr-Green”大师混合(包括Rox-standard),每个引物2 pmol, 10 ng基因组DNA在20μL反应体积。相对端粒的长度被δ计算CT方法,汇集新生小鼠皮肤的DNA作为校准器(设置为任意单位,100 AU)。

2.8。三层分析量化可行性、细胞毒性和细胞凋亡诱导

小鼠msc被播种在96孔板,辐照,在缺氧或孵化normoxia 7天。生存能力、细胞毒性和细胞凋亡进行评估在一个使用ApoTox-Glo三缸试验(Promega,麦迪逊,WI)。在第一步中,cell-permeable衬底glycylphenylalanyl-aminofluoro-coumarin (GF-AFC)活动产生荧光信号live-cell蛋白酶劈裂(400 nm激发,505海里排放)与活细胞的数量成正比。在平行nonpermeable衬底bis-alanylalanyl-phenylalanyl-rhodamine 110 (bis-AAF-R110;485 nm激发,520海里排放)是用来测量死细胞蛋白酶活动,这是释放细胞失去了膜的完整性。在第二个步骤中,添加CaspaseGlo 3/7试剂导致细胞溶菌作用,其次是半胱天冬酶基质的乳沟和一代的发光信号产生的荧光素酶。荧光和发光信号分析了微型板块阅读器(200年无限,Tecan、Mannedorf、瑞士)。积极控制坏死细胞暴露了6 h - 100μM ionomycin,积极控制细胞凋亡细胞暴露于100年μM staurosporine 6 h(西格玛奥德里奇),缺氧下孵化。

2.9。统计分析

所有实验至少重复执行技术和生物复制。平均值±标准错误的意思是除非另有声明描述(SEM)值。结果统计评估显示测试的统计软件SigmaPlot (Systat软件公司,圣何塞,CA)和SPSS版本22 (、IBM、纽约Armonk)。统计学意义是接受的的水平。

3所示。结果

3.1。氧浓度影响长期在体外小鼠msc的增殖潜力

符合先前发表的研究(22),我们观察到的扩散增加mMSCs 2% O₂(缺氧)环境相比21% O₂(常氧)环境。文化随着时间的进展,缺氧培养的细胞总数明显高于在常氧培养条件相比。代表图像显示长期培养缺氧和常氧mMSCs隔离(图后32天1(一))。

3.2。常氧文化条件减少mMSCs集落形成能力

normoxia mMSC生长的多孔性文化是由于能力较低的殖民地。因此,单独使用化验mMSCs透露高出十倍多的殖民地(2.04%)在缺氧,相比增长在正常氧条件下(0.21%)(数据1 (b)和1 (c))(,单侧成对的学生的以及)。这些结果证明mMSCs受损的clonogenicity常氧文化。

3.3。对辐射诱导衰老Normoxia mMSCs的敏感性增加

我们还没有看到一个有关增加使用多元分析与坏死或凋亡细胞荧光GF-AFC / bis-AAF-R100和发光caspase-3 / 7基质(补充图),无论是辐照后还是normoxia。所以我们假设衰老的关键机制减少增生性和损失mMSCs集落形成能力的文化与环境氧浓度(21%啊₂)。探讨氧气在衰老的可能作用感应,subconfluent mMSC文化在缺氧和常氧条件下是senescence-associated染色β牛乳糖(SA)β加)活动。在sham-irradiated细胞转移到常氧条件下,我们观察到一个强大的增加%衰老细胞,相比%的细胞保持在低氧条件下(图2(一个))。

电离辐射(IR)细胞内会产生氧化应激(23]。因此,我们在低氧暴露mMSCs维护和常氧条件增加剂量γ-射线(0.1 Gy, 0.2 Gy, 0.5 Gy, 4 Gy)。细胞辐照剂量高达4 Gy展出改变msc的典型的梭形细胞形态,这可能表明细胞压力。还有更减少了细胞生长的msc 4 Gy辐照后,以较低的细胞数量在氧气浓度(图7天后2(一个))。高氧和红外显著增加衰老mMSCs (方差分析)。辐照会独立导致mMSCs接受衰老(方差分析)。还发现环境氧浓度是一个关键因素负责增加衰老mMSCs (= 3.2×10⁻¹⁸方差分析)。在一起这表明normoxia mMSCs对辐射诱导衰老的敏感性增加。

3.4。小鼠msc生长在Normoxia基底更高水平的DNA损伤后,显示更大的增加γ-射线

在sham-irradiated mMSCs缺氧下,大多数细胞的缺失γH2AX疫源地,平均值为0.5(范围从0到2)焦点/核(数字3(一个)和3 (b))。的大小和数量γH2AX焦点时显著增加细胞种植在常氧条件下,达到平均值的4.0(范围从2到6)病灶细胞。

4 Gy辐照mMSCs培养缺氧下增加了每个细胞的病灶数平均值为2.3(范围从0到4)焦点/核(数字3(一个)和3 (b)),表示正在进行修复。4 Gy辐照mMSCs培养下normoxia显示大量出现γH2AX疫源地平均值为7.5每核(范围从4到20多焦点在某些细胞)。这些实验表明,normoxia mMSCs对DNA损伤的敏感性增加γ-射线。

3.5。没有影响Normoxia mMSC端粒缩短

DNA损伤信号也可以由功能失调引起的,侵蚀端粒(24]。因此mMSCs增长的相对端粒长度在缺氧和下normoxia测量文化(图3周4)。初的文化时期,mMSCs的端粒长度略长(123 AU - 155 AU)比参考细胞(新生皮肤成纤维细胞,设置为100 AU),但这期间拒绝在体外扩张。在24天,端粒长度减少非盟(normoxia)或非盟(缺氧),相当于一个半衰期时间约7.8天。指数拟合端粒缩短的时间进程并没有产生显著差异的缺氧和常氧曲线之间的动力学参数。

3.6。长期在体外增殖的潜力mMSCs不受氧气条件影响p53的缺失

我们发现高水平的衰老和DNA链断裂的证据出现在mMSCs在normoxia(21%啊₂)。目标基因的转录因子p53调节各种影响几个细胞通路,所有参与建立衰老和DNA损伤反应(25,26]。更加突出稳定后p53的辐照特性的观察mMSCs孵化下normoxia比缺氧(补充图)。利用p53的msc /−−老鼠,我们发现在体外扩散是影响正常的氧气浓度(图5(一个))。单独使用的电镀效率作为衡量潜在的这些细胞是高()比p53wt / wt细胞()和氧浓度的影响(补充图和图5 (b))。

3.7。衰老和γH2AX修复病灶形成减少p53 /−−无论氧气水平

在p53-deficient mMSCs,衰老的自然频率显著降低衰老p53wt / wt mMSCs相比,在低氧的增长条件下(),以及在细胞保存在normoxia ()(图6(一))。2.6%的差异之间的衰老程度(±3.3%)缺氧和常氧p53 /−−mMSCs额外后保持不变的γ-射线(0.2 Gy, 0.5 Gy和4 Gy),尽管频率本身增加了在类似的方式在常氧p53wt / wt细胞(图2 (b))。

辐射诱导的DNA双链断裂(数量γH2AX修复病灶)在常氧和缺氧条件下(0.4病灶细胞类似于p53wt / wt细胞在缺氧)的结果是符合我们之前的观察(图6 (b))。基础的水平γH2AX假射后修复病灶的范围(0 Gy)在缺氧p53野生型mMSCs,平均值的和疫源地每核在缺氧和常氧条件下,分别。后γ4 Gy -射线的数量γH2AX修复病灶90分钟后显著增加到1.1 (normoxia)或1.4(缺氧)每核焦点,代表高效持续的DNA修复相比,p53野生型mMSCs无论氧气条件下应用。这些结果表明,p53在调节衰老是一个关键因素在mMSCs感应和DNA修复效率。

4所示。讨论

间充质干细胞在正常生理状态驻留在干细胞利基与低氧压力(17,18]。因为他们有较低的代谢率比承诺的前驱细胞和分化细胞来源于他们(27,28),他们不太依赖高氧气供应。考虑到他们的主要功能是不同血统的长期的前体细胞再生,因此维护一个稳定的基因组,激进的氧物种的减少(ROS)在组织环境中氧气压力和较低的低代谢活动可能是有益的。这种保护缺氧环境被破坏在msc孤立和扩展体外但也暴露于任何类型的电离辐射(IR)在活的有机体内或在体外。红外有能力从细胞内的水生成ROS和氢氧自由基,从而绕过了否则保护缺氧干细胞利基(29日]。

我们已经表明,增长环境下氧含量(即。,21%) compromises MSC proliferation when compared to growth under hypoxia (i.e., 2%). This is in line with observations by others, who suggested using reduced oxygen cell culture systems [22,30.]。在治疗模型,表明瞬态维护人类在缺氧前自体msc治疗增加了功效治疗特发性肺纤维化,和这是伴随着增强生存的嫁接mMSCs [31日]。

我们这里下的MSC增殖障碍normoxia与增加细胞衰老相关。衰老不仅会阻止进一步的干细胞扩张也会妨碍现有细胞的分化能力(32]。衰老可引发的各种细胞的信号:端粒缩短,使细胞分裂接近海佛烈克极限(33积累),DNA损伤(34),或激活癌基因35]。测量的平均端粒长度增殖msc在几个星期文化表现出明显的随时间减少,但没有区别normoxia下细胞生长或低氧。因此我们可以排除,端粒缩短参与msc的氧气敏感性。

然而,显著提高检测的DNA损伤的程度γH2AX修复病灶细胞停止生长在normoxia两周后。我们测试的假设DNA损伤是导致msc对衰老细胞在缺氧和normoxia不同剂量的cs - 137γ-射线。500 mGy,我们观察到的频率显著增加衰老细胞生长在normoxia相比,在缺氧条件下细胞生长。这个范围内的辐射剂量可以交付给长寿干细胞25个重复计算机断层摄影曝光(20 mGy)和应证体外扩张的msc收集的部分人体可能暴露在辐射剂量重复过去。msc保持在2%低氧展览只在31%的细胞衰老的迹象,而在常氧细胞为53%。msc下减少氧气不仅表现出较低的衰老细胞的比例也回应不太严重γ-射线。的剂量500 mGy,衰老细胞的相对数量没有增加控制水平以上,我们不得不暴露的细胞与4000年mGy衰老略有增加至39%。这表明,电离辐射对msc增殖的不利影响是依赖于non-physiologically高氧气氛(EPHOSS [19期间)体外增长,在外植体以及应该避免体外扩大的msc特别是病人可能累积辐射诱导DNA损伤自体治疗前在msc。

在体外扩大hMSCs ROS-inducing对待化学发现数量的增加表现出53 bp1-stained DNA修复病灶,这在一定程度上可以通过添加抗氧化剂(获救36]。这表明潜在的诱导基因组DNA的损伤更大在高氧含量,但不排除其他细胞目标(如膜或线粒体)作为潜在的介质的影响。

non-physiologically高氧引起的DNA损伤的建议和/或电离辐射可以加强协同作用导致过早衰老细胞的观察msc与p53基因纯合缺失(即DNA损伤反应的主要信号传感器)的增长速度大大快于野生型msc、normoxia下和在缺氧。有趣的是,p53 /−−老鼠不显示任何缺陷的增长或间充质组织的再生,而增加的肿瘤来源于细胞胚芽层(37]。这表明p53是可有可无的msc的正常生理功能。另一方面,这是表明hMSCs扩大延长一段时间在体外缺氧表现出他们的基因表达谱的变化,特别是三个转录因子(原癌基因、p53和HIF1)经常放大,突变,或在癌症38),这导致了更高的转换频率后暴露你的细胞₄。从这个观察是一个建议,基因组不稳定性可以强制扩散和缺氧的结果。然而,我们的数据显示,msc在缺氧而表现出自发的DNA链断裂,因此排除缺氧本身是基因毒性的可能性。但它可能是过早衰老引发non-physiologically高氧确实防止恶性进展,尽管是在细胞增殖减少为代价的。

5。结论

我们已经表明,受损的msc常氧气氛下的增长体外与DNA损伤积累有关但不是额外的端粒磨损。这不仅增长原因受损细胞数量减少,但同时,由于衰老,增加干细胞能力的丧失。观察辐射诱导的DNA损伤和高氧气氛似乎协同作用建议谨慎不是外植体msc从身体的地区,可能是被辐照早些时候在生活中,对于诊断x射线成像和治疗的目的。它甚至可能是一个选项来存储msc从组织容易,因此不会让他们过多的辐射和让他们作为自体库器官再生。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

伊内斯Hofig和Yashodhara Ingawale贡献同样这项工作。

确认

作者要感谢的贡献Daniela Hladik辐射生物学研究所的亥姆霍兹慕尼黑中心,德国。这项工作是支持的欧洲原子能共同体323267项目(RISK-IR)。

补充材料