三维编织织物支架治疗牙周炎的自体骨髓干细胞移植I/II期试验

摘要

再生医学是一个很有前景的选择，但自体干细胞在牙周治疗的临床环境中还没有被很好地研究。在这项临床研究中，我们评估了一种新的再生疗法的安全性和有效性，该疗法基于手术植入自体间充质干细胞(MSCs)，采用可生物降解的三维(3D)编织复合支架和富含血小板血浆(PRP)。10例牙周炎患者，因骨内缺损需要手术治疗，纳入I/II期试验。一旦骨髓间充质干细胞植入每个牙周骨内缺损，患者在36个月内接受医学检查，包括血液和尿液样本的实验室检测，临床附着水平、袋深和线性骨生长(LBG)的变化。在整个随访期间，这三个参数均有显著改善()， 36个月后平均LBG为4.7 mm。骨膜检测显示术后临床活动度呈下降趋势。没有发现临床安全问题可归因于研究间充质干细胞。本临床试验提示msc - prp /3D编织织物复合支架干细胞治疗可能成为一种新的安全有效的牙周炎再生治疗方案。

1.介绍

牙周炎是一种非常普遍的疾病，它会降低中老年人的生活质量[1]．这种常见的慢性炎症是由口腔和牙齿的支撑组织上形成的细菌生物膜引起的，导致组织的逐步破坏和患病牙齿的脱落。骨内缺损的形成是牙周炎常见的并发症，一般采用功能性牙周再生治疗，包括牙槽骨和新牙骨质的修复[2]．传统的非手术牙周治疗和/或开放皮瓣清创可以减少袋深和炎症。然而，缺失的牙周组织和正常结构的功能再生不足[3.]．

从历史上看,β磷酸三钙(β-TCP)和陶瓷被用于再生入路，但这些移植程序导致长连接上皮形成[4]．系统综述显示，骨替代移植(包括自体骨和脱盐冻干同种异体骨移植)和引导组织再生(GTR) [5是牙周再生的有效方法[4]．另一方面，正在进行的试验正在探索新的治疗方法来加速牙周组织的再生。目前的共识是，生物制剂，如牙釉质基质衍生物(EMD)和重组人血小板衍生生长因子- bb (rhPDGF-BB)具有β-TCP，提高牙周再生治疗的有效性[2，4]．虽然这些应用通常可以改善骨填充和临床参数，但不能实现完全再生，特别是在严重牙周缺损的病例中[3.]．此外，GTR再生的细胞牙骨质明显不同于牙齿发育过程中形成的自然牙骨质，而EMD再生的牙骨质是脱细胞的[6]．还有人担心EMD制剂的特征不佳[4]．因此，牙周再生治疗领域还需要进一步的理论和技术发展。

再生医学对于牙周组织和功能的再生是一种更有吸引力的治疗选择。主要概念包括三个要素:干细胞、支架和生长因子。牙周组织中发现的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是多能细胞，可作为未分化细胞复制，具有多系分化能力[7- - - - - -9]．它们是最近和高度重视的，因为它们在细胞为基础的治疗系统性疾病的潜力。然而，很少有研究报道利用干细胞进行牙周再生的再生医学的临床应用[10]．

我们的团队进行了几项临床研究，使用分离的含富血小板血浆(PRP)的自体间充质干细胞作为骨再生的信号分子来源和支架，成功实现了移植物区骨形成[9，11，12]．PRP含有多种生长因子，是自修饰的纤维蛋白胶。据报道，它促进早期巩固和移植物矿化。生长因子包括成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGF -β)，并通过对各种细胞类型的增殖和分化的影响来刺激伤口愈合[13]．

一项临床前动物研究表明，MSCs在牙骨质化过程中也发挥了重要作用，再生牙骨质的结构更接近根的天然牙骨质，而不是GTR产生的牙骨质。一项使用绿色荧光蛋白(GFP)细胞跟踪试验的研究表明，植入的MSCs可以存活并参与牙骨质再生[9]．因此，我们开展了一项小规模的试点研究，利用骨髓源性间充质干细胞(bone marrow MSCs, BMMSCs)治疗牙周病[11]．尽管研究结果支持BMMSCs在成功牙周再生方面的潜力，但对于晚期牙周病患者，还需要更有效的支架。

我们团队开发了一种由可生物降解聚l -乳酸树脂纤维组成的三维(3D)编织织物支架[14]．多孔篮状材料通过保护植入细胞增殖和分化的空间以及保留凝胶状移植材料的内部空间来增强骨再生。我们之前使用犬齿下颌骨模型进行的临床前研究表明，这种支架大大加速了牙根方面产生的缺损的骨和牙周组织的再生[14]．因此，在这里，我们提出了一项长期临床试验的结果，以评估一种新的牙周再生治疗的安全性、有效性和稳定性，该治疗使用MSCs、PRP和我们的编织织物支架。

2.材料和方法

2．1．研究参与者

前往日本神户生物医学研究与创新研究所(Institute of Biomedical Research and Innovation hospital)治疗慢性牙周炎的成年患者被纳入了这个I/II期临床试验。入选标准如下:(1)35-60岁,(2)一个囊袋深度(产后抑郁症)≥4毫米,(3)至少10在下颌牙齿,牙齿(4)复苏的现有牙周手术不能预期,和(5)良好的一般健康没有任何系统性疾病的迹象。排除标准为:入组前6个月内吸烟及妊娠。所有纳入本研究的患者均接受标准的非手术牙周治疗。然后，选择牙齿x线显示明显垂直骨吸收和牙周袋≥4mm的牙齿。每例患者2颗健康牙齿作为对照。获得患者的口头和书面知情同意。本研究符合STROBE指南，并获得了生物医学研究和创新基金会机构审查委员会的批准。NCT00221130，补充资料可在网上查阅http://dx.doi.org/10.1155/2016/6205910）.

2．2．骨髓间充质干细胞的制备

骨髓基质细胞如前所述制备[9，11，12]，细胞在生物医学研究与创新基金会转化研究信息学中心的细胞加工中心制备，符合良好的制造规范指南。简单地说，在牙周手术前1个月，通过从每个受试者的髂骨骨髓中抽吸获得自体间充质干细胞。基础培养基和低糖Dulbecco 's modified Eagle培养基，含生长补充物(50 mL血清，10 mL 200 mM l -谷氨酰胺，0.5 mL青霉素-链霉素混合物，含25 IU青霉素和25μg链霉素)购自Cambrex (Walkersville, MD)。用于诱导成骨的补充剂(地塞米松，钠β-甘油磷酸和l -抗坏血酸2-磷酸)购自Sigma Chemical (St Louis, MO)。通过测定碱性磷酸酶(ALP)活性证实成骨细胞样细胞的存在。

2．3.富血小板血浆的制备

在术前血液学评估中测定总血细胞计数，而在手术前1天采集血液样本。血液在无菌条件下收集在一个含有抗凝剂柠檬酸盐的袋子里。将血液离心分离出含有血小板的黄色血浆和含有白细胞的泛黄层。对血浆进行离心，使血小板凝固成小球。丢弃贫血小板血浆及血浆上清。将血小板颗粒和泛囊膜/血浆部分重悬到剩余的血浆中，用于制备血小板凝胶。

２.４.细胞移植

临床试验按照图中所示的时间表进行1．术前，每位受试者用0.2%洗必泰溶液漱口。然后，在2%噻卡因肾上腺素局部麻醉(Astra)下开始手术。为了避免来自利多卡因的相互作用，注射的长度约为一颗牙齿的宽度。将全层皮瓣在颊部和舌部均抬高，去除皮瓣内上皮。彻底去除骨缺损区域的肉芽组织，用牙根打磨表面。未进行骨重建。将BMMSCs和PRP的混合物与溶解在10%氯化钙中的人凝血酶(5000单位)结合，灌注在由聚l -乳酸树脂纤维组成的3D织物中[14，然后放在牙根周围。重新放置皮瓣，缝合伤口。2周后拆除缝合。受试者被指导使用二葡萄糖酸钠洗必泰溶液漱口，每天三次。术后4周内，不允许对手术部位进行机械清洗。此后，每2个月进行1次专业机械洁牙。

2．5．临床评价

本研究的主要终点是临床附着水平(CAL)和口袋深度(PD)。在每次随访(术后6、12、24和36个月时间点)测量CAL或PD，并计算相对于预处理测量的变化。疗效分析使用每颗牙齿五次测量值的中位数。临床活动度以牙周炎值为基础，牙周炎值在牙颊面中心测量三次，平均值用于分析。每次随访时(术后1、2、3、4、6、12、24和36个月)，x线片评估术后垂直骨缺损的变化。定义为线性骨生长(LBG)。在术前和术后相同放大倍数的x线片上，从骨尖到牙釉质交界处的距离计算出骨内缺损的术后深度。

2．6．安全性评价

每次随访包括全身和口腔检查(术后1和2周、6、12、24和36个月的时间点)以及血液和尿液样本的实验室检测(术后6、24和36个月的时间点)。记录和分析与手术过程和/或支架的任何暂时关系的不良事件。

2.7。统计分析

采用线性混合模型，采用复合对称协方差结构分析植入前后CAL、PD、骨内缺损深度及临床移动性的变化。在每个随访时间点采用Dunnett-Hsu法进行多重比较，以术前值为对照。

3.结果

3．1.bmmsc - prp /3D编织-织物复合支架凝胶的移植

共10例患者(男3例，女7例;平均年龄:48.4岁)完成标准牙周治疗并纳入研究。骨内缺损包括三个部位的单壁缺损、六个部位的双壁缺损和一个部位的三壁缺损。

以碱性磷酸酶(ALP)染色和酶活性评价骨髓间充质干细胞的特性。诱导成骨后，细胞ALP染色呈阳性(图2(一个))，并表现出较高的ALP活性(BMMSCs: 2.01 units/well，诱导成骨细胞:18.05 units/well)，从而建立了BMMSCs的成骨能力。的在体外实验证明，BMMSCs可在本临床研究中使用的篮状三维编织复合支架上增殖(图)2 (b)）.

当BMMSCs-PRP溶液与溶解在氯化钙溶液中的凝血酶结合时，混合物呈凝胶状结构(图)2 (c))的三维编织复合支架安装在牙周骨缺损。每个患者移植的平均细胞数为3.5 × 10⁷细胞。在PRP中，平均血小板计数(1,352,600/μL)比基线高490%，证实了支架的隔离能力。

3．2．牙周检查

CAL、PD和临床活动度的平均变化见表1．根据线性混合模型(每个时间点:）.Dunnett-Hsu方法的多重比较显示，每个随访时间点的CAL均有显著差异(在6、12、24和36个月的时间点)，与术前水平相比。另一方面，对照组的CAL从术前到术后12- (), 24 - ()，及36个月(跨度为。此外，试验组在整个随访期间的PD明显低于术前水平(各时间点:）.对照组的PD在每个随访期均有增加趋势。

经Dunnett-Hsu法或Wilcoxon签名秩检验多次比较，试验组术后临床活动性呈下降趋势，对照组和试验组在随访时间点均无显著疗效。对照组在所有时间点的临床活动能力无显著差异。

实验组在随访期间骨内缺损深度明显下降()(数据2 (d)- - - - - -2 (f)和3.）.多重比较显示在2- (), 3 - (), 4 - ()、6 - (), 12 - (), 24 - ()，及36个月()时间点，与术前水平相比。

3．3.安全性评价

在随访期间，受试者的整体菌斑控制记录保持在<30%，表明良好的口腔卫生习惯(数据未显示)。在整个随访期间观察到的每个不良事件的频率见表2．最常见的不良事件显示与治疗有因果关系的是面部肿胀(5例)，其次是牙龈肿胀(4例)和口唇角(3例)。所有患者都从所有不良事件中自行完全康复。无患者出现与口腔内治疗有因果关系的疼痛或不适。此外，术后随访期间未见牙齿脱落。从血液和尿液分析中获得的异常实验室检测值均与治疗无关(数据未显示)。

4.讨论

牙周炎的常规治疗可以减缓牙周炎的进展，但通常不能恢复被疾病破坏的正常牙周支持结构[15]．组织工程包括三种策略用于创建新的组织、分离的干细胞、信号分子和生物相容性支架[16]．自体细胞移植的再生医学被认为是目前发展的最有前途的治疗概念之一，因为它解决了几个问题，即自体移植物在供体部位的发病率，异体移植物的免疫原性，以及异体移植物的松动。支架和生长因子已经应用于牙周治疗的工程概念，但很少有研究在临床试验中测试它们联合作用的潜力[11]．此外，成功的牙周再生需要加入能增殖和分化为具有再生能力的特殊细胞的祖细胞[17]．许多动物研究证明MSCs可以安全有效地支持牙周再生[3.]．本研究提出了一种结合所有三种元素的治疗方法:BMMSCs(一种3D聚乳酸基合成材料)和自修饰纤维蛋白胶和生长因子的PRP溶液。

一项评估牙周炎的传统牙周手术疗效的研究报告称，手术12个月后，CAL增加0.2-1.5 mm, PD减少1.5-2.7 mm, LBG为0.3-1.1 mm [18]．相比之下，我们开发的混合移植的独特成分在手术12个月后使>增加了2倍的CAL (2.68 mm)，减少了2倍的PD (2.48 mm)和4倍的LBG (4.4 mm)。此外，我们的研究旨在在36个月的时间内监测这三个参数，以确定这些改善的线性和持久性。分析显示，在至少36个月的时间里，所有三个参数都在逐步改善。

之前的临床研究将生长因子纳入支架以刺激牙周再生，但与本研究中观察到的rhPDGF-BB/相比，它们的LBG值始终较低β-TCP(24个月时为3.3 mm) [19), rh-FGF-2 /β-TCP(6个月时3.7毫米)[20.]、rh-FGF2/羟丙基纤维素(9个月时1.9 mm)或EMD(9个月时1.3 mm) [21]．总之，这些数据证明了干细胞治疗对有效牙周再生的重要性。这一发现得到了动物研究的支持，动物研究显示BMMSCs分化为牙周细胞以再生牙周组织[9，22]．此外，PRP中所含的信号分子可能刺激细胞迁移、增殖和分化。

我们的临床试验包括面谈、全身体检、口外和口内反应试验，以及临床监测与这种再生药物治疗相关的潜在不良事件。干细胞治疗与不良事件的发生频率没有关系，这些不良事件均为牙周手术的正常反应。此外，所有患者均自行并完全从所有不良事件中恢复，无需任何特殊治疗。这些结果可与先前表明局部细胞给药后无不良反应的研究相比较[9- - - - - -12，22]．此外，从血液或尿液样本中获得的异常实验室检测结果均与治疗无关。支架材料基本上是自生的和/或可生物降解的。之前，我们对培养的bmscs进行了安全性评估，未检测到支原体感染，也未发现肿瘤发生。此外，流式细胞仪分析显示，骨髓间充质干细胞MSC标记物阳性，造血系和单核细胞标记物阴性[9]．这些数据表明，本研究中培养的骨髓间充质干细胞是安全的，具有骨髓间充质干细胞的特性。总的来说，这些数据将支持这种新的有效牙周炎治疗方法的安全性。

由于本研究的主要局限性是样本量小，需要多中心、设计良好的随机对照试验来证实该治疗的有效性和安全性。需要进一步研究，以开发更适合的支架材料，试图治疗更严重的牙周缺损。此外，不良的口腔卫生也会对牙周再生的结果产生负面影响[2]．在本研究中，在整个随访过程中，受试者的菌斑控制总体记录保持在<30%，表明良好的口腔卫生习惯。这一因素可能有助于牙周再生的成功，在未来评估这种新疗法的潜力的大规模研究中，应该密切监测。

5.结论

长期的临床试验，包括至少3年的随访，更适合基于所有关键因素，即CAL, PD, LBG来监测牙周组织的再生。然而，很少有长期临床试验的报道。目前的3年试验表明，我们的新型BMMSCs-PRP/3D编织复合支架凝胶是安全的，在所有临床终点和真正牙周组织的有效再生方面提供了显著的长期改善。因此，干细胞牙周再生治疗有望成为牙周病的一种新的再生治疗方法。建议未来进行更严格的临床试验，以确定干细胞为基础的牙周治疗的安全性和有效性。

相互竞争的利益

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

马场俊助和山田洋一对这部作品贡献同样大。

致谢

作者们希望对伊藤健二表示敬意，并对这位善良慷慨的人去年去世表示最深切的遗憾。他们希望感谢他和生物医学研究与创新基金会转化研究信息学中心的Masanori Fukushima，感谢他们的鼓励和对完成这项研究的重要贡献。

补充材料

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