文摘

在许多细胞类型,几个细胞过程,如阀杆/前体细胞的分化,维护分化表型,能动性,附着力,成长,和生存,严格依赖于细胞外基质的硬度,在活的有机体内,描述他们的记者器官和组织。在肝脏中,基质硬度是必不可少的获取正确的器官生理而导致肝细胞障碍作任何改动。基质是一种元素的刚度不再可以忽略不计的培养几个细胞类型,到目前为止,许多数据,已培养的细胞在塑料,可以修改。关于肝细胞,标准培养条件导致原发性肝细胞的去分化,星状细胞的分化转化成myofibroblasts,正弦内皮的外窗的损失。此外,标准培养肝干细胞/前体细胞阻碍上皮/肝细胞分化计划的有效执行,导致细胞群表达的扩张只是部分肝脏功能和产品。克服这些限制是强制性的肝组织工程的方法。在这里我们建议细胞系在体外肝干细胞和肝细胞模型和一个创新的文化方法,考虑了基体刚度入手,分别快速和有效的分化过程和维护完全分化表型。

1。介绍

成年干细胞分化的选择,以及维护的分化表型,取决于很多因素,包括可扩散的分子和细胞/细胞和细胞/矩阵交互。近年来越来越重要性已被归因于弹性和细胞外基质(ECM)的刚度,这是物理元素描述每个成人器官和组织。这些参数表示为抗变形或弹性模量(在Pascal单位(Pa)和报告=牛顿/米²)[1]。

ECM刚度在肝脏,尤其有关这个器官的生理、病理特点严格相关的特定模块的弹性。一般来说,众所周知,一个健康的肝脏ECM弹性低(0.3 6 kPa),它允许极化和肝细胞的正常运转和维护星状细胞的静止和正弦内皮的最佳开窗术。fibrocirrhotic肝脏,相反,弹性矩阵的特征是显著增加(20 kPa或更高时肝纤维化、肝硬化进展),除了负面影响微循环,可以改变成熟肝细胞的分化/静止状态和/或干细胞间的2]。据报道,增加肝脏硬度可能会先于基质沉积(3),代表机关的第一反应几个受伤。因此,肝脏硬度的增加也可能扮演重要的角色在纤维化的早期阶段,除了描述更先进的疾病。

基质弹性的重要性不能被忽视甚至在细胞培养。最近,转导的影响在许多方面的培养细胞的行为已经公布了。几个细胞功能已经被证实是严格根据机械力产生的细胞外环境,包括分化的执行程序,维护的分化表型,能动性,附着力,增长,生存4,5]。ECM弹性的变更的影响细胞行为的广泛,也影响DNA的效率吸收(6)(这是特别重要的,当细胞操纵的治疗方法或基础研究)和基底转录活动7]。

所有这些因素导致重新评估收购源于许多研究细胞生长在塑料(GPa),因为这种文化条件不允许适当的mechanosensitive生物过程的执行。最常见的问题之一,传统上进行细胞培养(特别是对于所有细胞类型和肝细胞)的损失完全分化表型(8],可以克服由文化更多的生理条件。此外,对阀杆/前体细胞,面临的挑战是找到他们的最佳条件在体外维护和扩张,以及他们的快速和正确的分化9]。这些元素是特别重要的在协议试图使用培养的肝细胞的细胞治疗和肝组织工程。

近年来,几种方法已经发展到文化哺乳动物细胞在生理和效率,取得了重要成果使用天然或合成基质和不同值。

凝胶基于天然ECM组件,例如I型胶原蛋白,基底膜基质,和纤维蛋白,其刚度可以通过修改密度调制的ECM蛋白质或化学交联,可以影响肿瘤的生长(10- - - - - -12)以及调节正常细胞的分化和增殖13]。

最近,为了克服天然ECM的主要限制(即。,the limited range of the obtainable stiffness), fully synthetic and covalently cross-linked hydrogels with tunable stiffness have been developed. In a study reported by Pelham Jr. and Wang, polyacrylamide gels of variable stiffness were used for fibroblast cultures [14]。最近,其他合成底物不同值使用(15,16]研究机械刺激的影响在几个细胞的生长和分化。

在这里,我们提出了优化培养条件的肝干细胞和分化肝细胞,利用细胞模型源于我们先前建立的小鼠肝脏在肝脏和广泛的特点在体外和在活的有机体内。居民肝脏干细胞(RLSCs)是肝细胞的无限增殖干细胞能够自发地获得特征的几个星期内标准文化(17]。完全分化表型得到RLSCs orthotopically时接种在肝脏,在那里他们正确地集成肝脏架构,导致肝细胞和间充质肝细胞(18]。有关的永生化肝细胞,他们从肝脏分离的转基因(嗯/ E14灯头)(19和野生型小鼠(WT / 3) (20.),不是肿瘤发生的,分化良好,能够表达多种肝脏功能和产品(21- - - - - -25]。

在试图提高我们的细胞在文化的性能我们建立一个协议,考虑到基板的刚度,允许早期和均匀的肝干细胞的分化,因此,分析,在限制时间内,所涉及的分子事件。特别是,水凝胶的使用产生的丙烯酰胺和bisacrylamide刚度的0.4 kPa RLSCs分化成肝细胞后24小时内,而更高的刚度矩阵(80 kPa)导致了大量的维护成表型只显示一个初始hepatocyte-specific转录活动。快速收购hepatocyte-like形态和特定的基因表达谱在0.4 kPa水凝胶与一致的表观遗传修饰在肝细胞分化的启动子基因HNF4大师α和激活的分子途径的缺乏,后者的被了解应对机械刺激和参与细胞生长和具备干细胞。此外,使用柔软的水凝胶还允许肝细胞细胞系假设一个完整的上皮细胞形态和表达的基因与肝上皮功能更有效,比塑料的传统文化。

2。材料和方法

2.1。聚丙烯酰胺水凝胶

聚丙烯酰胺水凝胶和两个不同的刚度值(0.4 kPa和80 kPa)准备在25毫米玻璃盖玻片(Menzel-Glaser热费希尔科学Inc .,妈,美国)使用由李等描述的方法。26)用小的变化。总之,玻璃盖玻片是治疗1小时0.2 HCl,用水洗了四次。相同的眼镜盖玻片治疗10分钟0.1 M氢氧化钠和洗水的四倍。0.5%_vv3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS 97%;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)添加玻璃盖玻片30分钟,其次是四水洗涤。接下来,盖玻片处理0.5%_vv戊二醛在PBS(戊二醛溶液25%;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)1小时,然后1小时的洗水,风干。

为了获得水凝胶为0.4 kPa和80 kPa,我们准备了以下混合物(最终浓度):3% (0.4 kPa)和16% (80 kPa)的丙烯酰胺(Bio-Rad实验室、Inc .、大力神、钙、美国),0.06% (0.4 kPa)和0.96% (80 kPa)的N, N′亚甲基bisacrylamide (Sigma-Aldrich), 0.1% APS(过硫酸铵)(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州),和0.1%的tem(N, N, N′, N′-tetramethylethylenediamine) (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)在水里。

61年μL这个混合物用移液器吸取玻璃之前处理疏水性硅聚合物(Rain-X)和盖玻片的25毫米(视为上图)被颠倒到凝胶滴。30分钟后被小心翼翼地盖玻片是和聚合凝胶在粘附在50 mM消息灵通的pH值8洗两次,使用0.05%交联Sulpho-SANPAH Photoreactive交联剂(美国马热费希尔科学Inc .)在20毫米消息灵通的紫外线下pH值8_365海里光,然后用20毫米洗两次消息灵通的pH值8。

一层薄薄的胶原蛋白I (GIBCO生活技术,蒙扎,意大利)被放置在水凝胶如下:1毫升的胶原蛋白10μ克/毫升(20毫米醋酸)被添加到水凝胶在35毫米板。1小时后在室温下孵化解吸气,水凝胶被冲洗三次1 x PBS消除紫外线下酸和交联_365海里光。水凝胶被用冷水洗一次,阻塞以1%乙醇胺(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)50 mM消息灵通的pH值8 30分钟在4°C。最后,凝胶在紫外线消毒和孵化无血清培养基(杜尔贝科的修改鹰的媒介和RPMI 1640;GIBCO生活技术,意大利蒙扎)。

2.2。细胞培养

RLSCs [17)是生长在DMEM(杜尔贝科的修改鹰的介质)(GIBCO生活技术,蒙扎,意大利)以10%的边后卫(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州),2毫米谷酰胺(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)和抗生素在胶原蛋白(GIBCO生活技术,蒙扎,意大利)涂布菜(BD猎鹰,富兰克林湖,新泽西,美国)和0.4 kPa和80 kPa水凝胶获得如上所述。3 Nontumorigenic鼠嗯/ E14灯头和WT /肝细胞(19,20.)生长在RPMI 1640年10%的边后卫(GIBCO生活技术,蒙扎,意大利),50 ng / mL EGF, 30 ng / mL IGF II (PeproTech Inc .,落基山,新泽西,美国),10μg / mL胰岛素(罗氏,曼海姆,德国)和抗生素,在胶原蛋白我(GIBCO生活技术,蒙扎,意大利)涂布菜(BD猎鹰,富兰克林湖,新泽西,美国)和0.4 kPa和80 kPa水凝胶获得如上所述。200.000细胞被播种在每个25毫米与水凝胶盖玻片。形态分析是由相差显微镜检查。

2.3。免疫荧光

细胞与4%多聚甲醛固定,permeabilized磷酸盐triton - x - 100 0.2%,和孵化一夜之间在4°C以下抗体:1:50山羊多克隆anti-HNF4α圣克鲁斯生物技术(C-19 sc - 6556年,美国),1:50鼠单克隆anti-E-cadherin(美国BD生物科学Pharmingen 610181), 1: 400年兔单克隆anti-Vimentin(美国Epitomics 2707 - 1),和1:50鼠单克隆anti-YAP (sc - 101199,圣克鲁斯生物技术,美国)。二次抗体如下:抗体Alexa萤石594年anti-mouse Alexa萤石488年anti-rabbit Alexa萤石488和anti-mouse Alexa萤石594(所有从分子探针,尤金,或者美国),稀释1:500。细胞核与DAPI染色(分子探针D1306)。准备检查使用尼康Eclipse E600荧光显微镜配备40 x客观和coolSNAP HQ2 CCD相机(光度)。数字图像处理与Adobe Photoshop 7软件(Adobe Systems,山景,CA)。

2.4。RNA提取、逆转录和实时聚合酶链反应(RT-qPCR)

总RNA提取miRNeasy迷你设备(Quiagen-GmbH、希尔登,德国)和reverse-transcribed iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(Bio-Rad实验室、Inc .、大力神、钙、美国)。互补脱氧核糖核酸RT-qPCR扩大了使用微型内髓实时PCR检测系统(Bio-Rad) GoTaq qPCR大师混合(WI Promega,麦迪逊,美国)。得到了相对量Rpl34方法和规范化。

特定的引物列表如下:HNF4α:5′-TGCGACTCTCTAAAACCCTTGCCG-3′, 5′牧师-GCCCATGGTCAACACCTGCACA-3′;白蛋白:5′-ACAGACCGGAGGGCTTATCT-3′, 5′牧师-TGGTGTAGACAGGTCAGGATGT-3′;竞技场队伍(转体基因):5′-GTCCTCTGATGGTCAAAGTC-3′, 5′牧师-CTCCTTCTACAAACTTCTCATCTG-3′;HNF1α::5′-AGACCATGTTGATCACAGAC-3′,牧师:5′-GGGTGGAGATAAAAGTCTCG-3′;Apoc3: 5′-GGACGCTCCTCACTGTGG-3′, 3′牧师-CACGACTCAATAGCTGGAG-3′;钙粘蛋白(背景):5′-CTACTGTTTCTACGGAGGAG-3′, 5′牧师-CTCAAATCAAAGTCCTGGTC-3′;蜗牛:5′-CCACTGCAACCGTGCTTTT-3′, 5′牧师-CACATCCGAGTGGGTTTGG-3′;波形蛋白:5′-AGCAGTATGAAAGCGTGGCT-3′, 5′牧师-CTCCAGGGACTCGTTAGTGC-3′;Cyp2b10: 5′-CAAAGTCCCGTGGCAACTTC-3′, 5′牧师-TCTCCATATTTTTCTCGAAGCTGAA-3′;和Rpl34: 5′-GGAGCCCCATCCAGACTC-3′, 5′牧师-CGCTGGATATGGCTTTCCTA-3′。

2.5。西方墨点法

细胞的细胞溶解Laemmli缓冲区1 x(三60μ米pH值6.8,2% SDS, 2 - 10%甘油、5%β巯基乙醇)。相同量的提取分离通过sds - page和转移到硝化纤维素膜(微孔、马、美国)。屁股被封锁的1小时5%脱脂牛奶(Bio-Rad实验室、Inc .、大力神、钙、美国)准备在TBST 1 x和孵化隔夜用以下主要抗体:α-ERK1 (K23;1:1000)和α到(c-22;1:1000)(圣克鲁斯生物技术有限公司、钙、美国),phospho-p44/42 MAPK ERK1/2 (4370;1:1000)(细胞信号技术波士顿,美国),和α波形蛋白(克隆V9;1:1000)(微孔、马、美国)。墨迹是孵化HRP-conjugated anti-rabbit二级抗体(Bio-Rad实验室、Inc .、大力神、钙、美国)。在体外检测免疫反应性增强化学发光反应(Cyanagen西星NOVA 2011年,博洛尼亚,意大利)遵循制造商的指示。

2.6。细胞周期分析

细胞被洗PBS,固定在4:1甲醇:丙酮,孵化与核糖核酸酶(2 ng / mL) (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)和propidium碘(π)在室温下30分钟。流式细胞仪DNA含量进行评判,用流式细胞仪石中剑(美国BD生物科学)。

2.7。染色质免疫沉淀反应(芯片)分析

芯片分析如前所报道(275)通过使用μ克以下抗体:兔子anti-H3K4me3(07473),兔子anti-H3K27me3(07449),兔子anti-H3AcK9(07352),或兔免疫球蛋白是一种消极控制(12307)(所有微孔美国马)。5 ng DNA免疫沉淀反应和相对控制被用作RT-qPCR分析模板,在重复执行。引物用于放大HNF4 HNF1/6共识α启动子如下:向前5′-TCCGAAAGACCCAAGTGTGG-3′和反向5′-GCCAATCACGTCCCAGATCA-3′。

2.8。尿素生产/分泌分析

分析了尿素生产在24小时和48小时文化RLSCs浮在表面的,正电胶/ E14灯头和WT / 3培养塑料和0.4 kPa水凝胶。尿素与比色尿素水平量化分析工具(Abnova、钙、美国),根据制造商的指示。新鲜的培养基作为消极的控制。

2.9。统计分析

数据表示为均值±标准差的意思(SD)的三个独立的实验(除非另有说明)和学生的以及用于统计分析。所有的测试都是双尾和一个值< 0.05被认为是统计学意义(值< 0.05 =,值< 0.01 =,值< 0.001 =)。

3所示。结果与讨论

3.1。软底物促进快速和均匀RLSCs向肝细胞分化

首先,我们探讨了基体刚度RLSC自我更新和分化的作用。这一目标,我们镀RLSCs衬底的聚丙烯酰胺凝胶(以下称为“凝胶”)弹性模量为0.4 kPa,匹配的内在健康肝脏硬度,和80 kPa,对应的刚度fibrocirrhotic薄壁组织(2]。控制,RLSCs种植在聚苯乙烯的高刚性衬底菜(刚度> 1 GPa)。所有基板被涂上一层1型胶原,已被证明能促进干细胞和肝细胞的粘附在标准的文化条件下(17,19]。

自细胞形态概括的分子事件控制特定分化程序,我们首先评估RLSCs种植在基质的形态变化与不同的弹性。相差光学显微镜分析显示,24小时后文化0.4 kPa凝胶,细胞经历了齐次微分获得立方形的形状,建立严密的信息交互,并被安排在定义良好的上皮岛屿周围的空地(图1(一))。不同,细胞在80 kPa矩阵,以及细胞培养在塑料、interdispersed增长,保持成形状。

免疫荧光分析证实了替代程序执行的细胞在不同刚度(图1 (b))。RLSCs种植在低刚度矩阵表示,持续24小时后,肝脏特异性转录因子HNF4α在细胞核和膜的上皮钙粘蛋白标志(钢筋在48小时);与此同时,他们失去了间充质/干细胞标记波形蛋白的表达。细胞培养更高的刚度(80 kPa和塑料),相反,没有获得上皮/肝细胞特异性标记(只有几个细胞表现出微弱的HNF4α表达式)和维护波形蛋白的表达。

我们排除在外,波形蛋白荧光信号的变化是由于不同溶解度的蛋白质在细胞生长表面具有不同的刚度28),通过免疫印迹分析证实了免疫荧光数据(图1 (c))。

更广泛的分析上皮/肝细胞和间充质/具备干细胞标记细胞培养在不同刚度被RT-qPCR表现在转录水平。在刚度低衬底,上皮钙粘蛋白基因(背景)和HNF4 hepatocyte-specific基因α,HNF1α、白蛋白、竞技场队伍和Cyp2b10强烈表达了24小时后,在48小时内(图进一步调节2(一个));另外两个实验补充图1所示的表达水平Cyp2b10报道补充图2是一个网上(补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/5481493)。前后一致地,间充质/干细胞标记波形蛋白表达下调和蜗牛。另一方面,相同的基因的表达在细胞生长高刚性衬底仅略调制相比,塑料(图上的文化2(一个)和补充图1)。

最后,我们评估RLSCs种植在柔软的水凝胶的分化状态评估的能力,这些细胞合成和分泌尿素培养基;事实上最重要的肝脏功能之一是能够解毒氨有毒化合物转化成尿素。

上层清液的水平的尿素RLSCs生长在柔软的水凝胶在24和48小时被发现强烈增加相比,控制(RLSCs种植在塑料)(图2 (b))。

总的来说,这些数据表明RLSCs已经执行一个有效的程序上皮/肝细胞分化后24小时内文化与低弹性模量矩阵,没有特定的有益的刺激。相反,一个高刚度的水凝胶主要是维护RLSC表型,推迟发病肝细胞分化的过程。

3.2。软基质影响的信号通路转导参与肝细胞分化

凝胶硬度和分化之间的因果关系是早期提出的修改通路对细胞外基质的硬度和具备干细胞参与/分化。

ECM高刚度是由焦感觉到粘连/整合素系统,因此激活erk激酶地图在调节许多细胞功能起着至关重要的作用,包括维护具备干细胞和去分化成熟的上皮细胞(29日- - - - - -31日]。从这些证据,我们在实验条件探讨ERK1/2激活状态通过其磷酸化形式的调查。如图3(一个),持续高ERK1/2磷酸化水平,观察到RLSCs种植在僵硬的凝胶在标准条件,似乎大大降低了细胞培养的软凝胶后3小时,至少在24小时内文化。

按照收购分化表型和ERK失活,流式细胞仪分析显示显著积累的细胞周期G1期RLSCs种植在低刚度,而僵硬的凝胶或塑料(图3 (b)),加上一个减少在S期细胞的比例。

最近,Yorkie-homologues YAP的识别(Yes-associated蛋白质)和小胡子(转录与PDZ-binding主题共激活剂)作为核机械信号继电器的ECM刚度和细胞形状报道(32]。

此外,这些转录因子与相关几个数据大量具备干细胞基因的表达,建立关键作用YAP /小胡子在维持干细胞多能性(33,34]。有趣的是,最近的重要报告由一个至关重要的作用,这些分子也在肝脏细胞的命运:YAP调节HNF4α在肝细胞分化[转录活动35)及其在先进的肝癌抑制恢复肝细胞分化[36]。此外,急性失活的河马通路信号在活的有机体内,导致高架YAP活动,已证实成人肝细胞去分化和驱动肝脏生长和细胞出现“椭圆”(37]。从这些观察结果,我们分析了狂吠的定位,因此,我们观察到核本地化这个因素RLSCs培养时的塑料或高刚度(他们保持成表型),而发生了明显的细胞质本地化软刚度(细胞开始上皮分化程序)(图3 (c))。始终与YAP定位、目标基因的差别强烈的对这些Ctgf [38)(图中观察到细胞培养软凝胶3 (d))。

这些结果相关联的上皮/肝细胞分化RLSCs种植在软底物与细胞质狂吠的本地化和一个不活动的erk信号扩展到肝脏干细胞所观察到的其他细胞系统关于ECM刚度的作用转导和细胞的行为。

3.3。软底物促进HNF4早期表观遗传修饰α启动子

从最近的报告描述生物物理微环境之间的新关系,转导和表观遗传修饰在细胞重编程(39- - - - - -41),针对新分子的识别工具,监测和/或诱导迅速和有效的肝细胞分化在体外,我们探讨了促进HNF4 stiffness-induced染色质的修改α在我们的细胞模型。

如图4激活的肝细胞分化程序RLSCs HNF4早期的表观遗传修饰有关α启动子。特别是,通过芯片分析,我们发现增加的赖氨酸乙酰化作用的9组蛋白H3 (H3K9Ac,已知一个激活染色质修饰)结合位点的转录激活物HNF1和HNF642),在48小时内从软基质细胞播种,而细胞种植在塑料。在同一地点,更早(24小时),我们已经强调了增加组蛋白H3 Lys4 trimethylation (H3K4me3),组蛋白修饰与活跃转录。相反,在同一地区,我们观察到明显降低水平的组蛋白H3 Lys27 trimethylation (H3K27me3),一个后生修改已知转录抑制相关。这种减少也观察到在播种后24小时低刚度,因此前H3K9Ac水平的增加。

这些结果符合HNF4的早期转录激活α在软基板和确认刚度矩阵可以影响表观遗传调控在干细胞分化。此外,识别早期的染色质修饰参与分化的前体细胞可以促进开发新协议的细胞重新编程和分化的基础上,利用小分子能够抑制或激活特定的染色质修饰符,所讨论的林和吴43]。

3.4。软底物有效地维持培养肝细胞的分化状态

获得完全的永生化肝细胞分化表型文化,一起维护新孤立肝细胞的分化,细胞生物学家代表了一个进一步的挑战。它很大程度上观察到,事实上,这一系列肝脏特异性功能逐步失去当肝细胞培养。这些表型的修改主要是根本性的变化的结果,与降低基因表达的转录相关的肝脏特异性基因,可以解释为“去分化”的孤立肝细胞(8]。研究软基板是否可以维持或改善肝细胞的分化状态,我们利用肝细胞细胞系都来自嗯老鼠的肝脏(嗯/ E14灯头)(19从WT)和小鼠肝脏(WT / 3) [20.]。

如图5肝细胞嗯/ E14灯头(图5(一个)(图3)和WT /5 (d))培养0.4 kPa获得更加明显和齐次上皮表型在24小时后播种:细胞在上皮组织群岛与典型的鹅卵石外观和有界空间急剧分隔。值得注意的是,肝细胞显示显著改变hepatospecific基因的表达谱,似乎强烈调节和间叶细胞的基因差别明显对这些还表现在细胞培养在塑料(数字5 (b)和5 (e);表达水平Cyp2b10报告补充图2 b和c)。肝的解毒功能也分析评估肝细胞合成和分泌尿素的能力。嗯/ E14灯头(图5 (c)(图3)和WT /5 (f))细胞株生长在柔软的水凝胶,尿素生产的水平相比似乎增加了控制(肝细胞生长在塑料)。

因此,虽然很多肝脏功能丢失当肝细胞培养在标准条件下,大量的肝脏基因产品和肝的功能(如尿素生产)可以有效地表达和维护细胞培养在柔软的细胞外基质。这些结果似乎特别相关,因为他们可以有助于改善肝细胞系的可靠性和推广的文化有区别的肝细胞,使维护功能分化状态。

4所示。结论

这项工作的目的是为解决生殖细胞生物学在文化的迫切需求,尽可能密切的生理条件,在活的有机体内,维持每个细胞的生物类型。特别是,我们已经开发出一种肝细胞的培养方法,考虑基质的刚度的影响。事实上,它现在清楚的是,细胞的培养基质的弹性也不同于记者的器官或组织可能改变他们的基因表达,因此,他们的形态和分子表型。丙烯酰胺水凝胶的使用/ bisacrylamide精确可调刚度使得我们研究属于软组织细胞,如肝实质,更机械生理背景。尽管聚丙烯酰胺凝胶可能会干扰蛋白质的粘附在血清或分泌细胞(这可能,否则,作为胶粘剂锚和,因此,控制细胞行为),比较细胞种植在相同类型的水凝胶,但不同刚度了衬底的相关性肝细胞分化过程中刚度。

首先,通过控制基板的刚度,我们能够诱导一个快速和有效的肝细胞分化的干细胞/前体细胞。这个协议还允许分析和识别,在限制时间内,所涉及的分子事件的早期阶段分化的过程。确定分子可能是有用的工具来指导和控制在体外生物过程,如具备干细胞分化和。事实上,尽管真正的参与肝脏居民阀杆/前体细胞在慢性损伤后肝再生仍在讨论(44- - - - - -49处理),它仍然是非常重要的在体外这些细胞的分化命运获得功能性肝细胞的来源用于细胞治疗和组织工程的协议。

此外,新的文化协议是用于诱导/恢复肝细胞细胞系的完全分化表型。这允许给一个新值的细胞系作为模型在活的有机体内。事实上,考虑到困难隔离成熟肝细胞肝移植组织和维护长期的文化新孤立的肝细胞,改善方法的无限增殖细胞的培养已成为迫切需要。培养法和细胞系所示表示新工具,可能是有用的肝脏生理进行研究,实现高效的生物人工肝脏生物模块。

因此,肝细胞的迅速放大后(由标准文化获得)及其快速和有效的分化(获得通过轮垦软矩阵)可以代表一个创新的方法来文化起源和分化肝细胞系。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢克劳迪奥·Cavallari技术支持。他们承认的赠款援助Associazione Italiana / la Ricerca南Cancro (IG 14114),意大利卫生部门(“Ricerca Corrente”),意大利大学和科学研究(普林斯顿2010 lc747t_003, FIRB RBIN06E9Z8)。

补充材料