相关的理论和实践问题,扩大hMSC微载体生产流程

文摘

人类间充质干细胞的潜力(hMSCs)同种异体细胞治疗创造了大量的利益。然而,这是以有效扩大程序的可用性。有前景的结果已经报道了生物反应器操作微载体。最近的出版物关注microcarrier-based搅拌生物反应器已经证明了的成功使用计算流体动力学(CFD)和悬挂标准(,)迅速扩大hMSC从mL -中试规模的扩张。然而,一个障碍可能是大型microcarrier-cell-aggregates的形成,这可能导致传质限制和非均匀分布的干细胞文化肉汤。microcarrier-cell-aggregate形成的依赖在叶轮速度和剪切应力水平是追究人类派生基质/脂肪干细胞(hASCs)转轮规模通过记录索特平均直径()与时间。种植在悬挂标准提供值0.2至0.7毫米,细胞密度最高(1.25×10⁶细胞毫升⁻¹hASCs),最高的扩张因素在7天(117.0±4.7),同时保持特定的表面标记物的表达。此外,中止判据的适用性研究扩大microcarrier-based过程首次wave-mixed生物反应器。

1。介绍

细胞疗法已成为越来越重要的再生医学领域的约10亿美元的全球收入显示(1,2]。已经有一个明显的hMSCs日益增长的兴趣,尤其是那些显示潜力巨大广泛的同种异体疗法(如患干燥眼科黄斑变性、糖尿病、克罗恩病、移植物抗宿主病,和急性心肌梗塞1,3- - - - - -8])。2015年9月,171年第一阶段,2和3的临床试验与hMSCs运行(https://www.clinicaltrials.gov/),这一事实并不令人惊奇。由于他们的存在在产后组织(如脂肪组织、骨髓、脐带组织,血液,和外周血)比胚胎干细胞和更低的监管限制,hMSCs更方便和更广泛的接受临床应用(9- - - - - -14]。一个所需的大量hMSCs治疗剂量(35 - 350细胞每剂)解释了有效需求和可伸缩的在体外扩展程序(1,15]。虽然静态堆叠板系统,与40层,提供所需的细胞1×10的数字⁹细胞semicommercial和商业生产过程,很难确保干细胞数量和质量层的数量增加(16,17]。

Microcarrier-based确定了生物反应器代替平面栽培技术,可以满足生产规模的需求而言,生物处理经济和优化(18]。hMSC密度最高(1.4×10⁵-0.8×10⁶细胞毫升⁻¹)和最大扩张因素(EFs) 40 - 50之间实现搅拌生物反应器操作与固体或多孔微载体serum-supplemented(5 - 10%胎牛血清白蛋白的边后卫)培养基,培养长达21天(19- - - - - -30.]。为了成功地扩大microcarrier-based搅拌生物反应器与hMSCs过程,休伊特et al。24),拉菲克et al。19应用中止准则。这一标准,采用高剪切敏感性(31日,32的hMSCs考虑可以归因于Zwietering [33从1950年代末)和他的研究。代表了最低叶轮速度就完全中止最小剪切应力的微载体。然而,这并不能保证所有微载体的均匀分散在培养基。Kaiser et al。27)和Schirmaier et al。20.]介绍了标准,提出了流体流动模式的前期预测和水动力部队使用计算流体动力学(CFD)和粒子图像测速仪(PIV)。标准的下限标准,允许当地运动的微载体在生物反应器底部,但没有一个微载体在休息的时候。通过使用标准,Schirmaier et al。20.)取得了最高的数量(1×10¹⁰)hASCs和EFs 7日内(41.7)在microcarrier-based搅拌生物反应器中试规模(35 L工作容积)。然而,如图所示,法拉利等。34),与骨骨髓来源hMSCs生长在转轮烧瓶在葡聚糖微载体(Cytodex 1),大型microcarrier-cell-aggregates可以出现,这可能导致传质限制和,最后,失去干细胞特性,减少了细胞生长,甚至细胞死亡。这就提出了一个问题:是否有microcarrier-cell-aggregate大小之间的依赖,叶轮速度、剪切应力,细胞数量和细胞质量。

出于这个原因,我们的研究目标之一是调查时间hASC纺纱的增长速度不同的叶轮(考虑暂停标准)和剪切应力水平,同时也考虑到microcarrier-cell-aggregate大小。所有这些调查是基于先前发表的特征调查(CFD模拟,悬架的研究和PIV测量)我们组(Kaiser et al。27])。第二个目的是检查是否可以使用标准hMSC wave-mixed生物反应器大规模生产过程一维运动。在这种类型的生物反应器,传质是通过扩散波,它的强度可以调节生物反应器的摇摆角,摇摆速度,和填充水平。波摇摆引起的固定,surface-aerated袋(35- - - - - -38)包含中、微载体的细胞连接。虽然这生物反应器类型是建立在种子培养液和microcarrier-based疫苗生产过程连续动物细胞系,只有两个出版物描述其适用性的扩张hMSCs [39,40]。Timmins et al。39)培养人类胎盘msc CultiSpher-S微载体,取得EFs的16.3 7天内低啊₂(5%)的条件。在常氧条件下Akerstrom [40]增长nonspecified hMSCs Cytodex 3微载体在18天,收获20×10⁶细胞,对应的EF 6。我们决定使用一个生物抑制剂CultiBag RM 2 l(光学版本)和采用的剪切应力在转轮hASCs烧瓶(4.9×10⁻³0.18 N m⁻²),它要求前悬挂、CFD和PIV种植系统的调查。

2。材料和方法

2.1。生物工程特征的生物抑制剂CultiBag RM 2 l

2.1.1。悬架的研究

悬架实验进行了专门研制的介质与Lonza包含5%的边后卫和两种不同类型的名为“聚苯乙烯微载体(笼罩,美国)。三种不同的工作卷(1.5 1.0 0.5 L, L, L)和微载体固体测试分数从0.7到2.1%。名为“聚苯乙烯微载体由粒子与密度之间的1090和1150公斤米⁻³(MC-1)和1022和1030公斤之间⁻³(MC-2)和直径在160和200之间μ米,在125年和200年之间μm,分别。由此产生的名义增长表面每克约515厘米²和360厘米²。MC-1应用建立一个初始multiregression模型预测的悬挂标准(,wave-mixed系统)和没有意义的进一步培养研究中描述的部分2。2。

为了更好地评估生物反应器底部,一个透明的、刚性的摇摆平台使用有机玻璃制成的。此外,镜子被放置在摇摆平台来改善光生物反应器底部的可访问性。悬架特性研究对不同4°之间摇摆角度和10°。摇摆角保持不变,摇摆率逐步增加到最多35 rpm。标准的wave-mixed生物反应器被定义为摇摆的结合率和摇摆角,微载体的接触反应器底部不超过1。同样,搅拌生物反应器,标准的下限。

2.1.2。计算流体动力学

内的流体生物抑制剂CultiBag RM 2 l是模仿使用流利的15有限体积解算器(ANSYS, Inc .)、美国)。由于液体的运动界面,Volume-of-Fluid(受到)方法用于模拟。为了这个目的,一组单一的动量方程,基于Reynolds-averaged n - s方程(跑),解决了。阶段之间的界面是跟踪随着时间的推移,使用体积分数的平衡方程,可以描述的th由以下阶段: 条款,,在(1)表示流体速度矢量,流体密度和体积分数的th阶段。通过假设一个共享的速度场之间的阶段,一个动量平衡方程(见(2)是解决整个流体域: 在哪里定义所有体积力除了重力。在(2)、粘度和密度加权平均值: 相体积分数的计算是基于以下约束: 一个好的近似的摇臂式运动生物反应器被一个谐波振荡函数,偏转角的地方的时间点可以预测由以下方程: 这导致(6),进入流利的用户定义函数和描述了运动包固体: 湍流模型使用条件风场运输模型,一组方程湍流动能,湍流耗散率,具体湍流耗散率被解决。提供了模型的详细信息(41,42]。枕状袋的体积被离散成1.5×10⁶四面体控制量,保证可接受的计算精度和可计算周转时间。模拟进行了三种不同的工作卷(1.5 1.0 0.5 L, L, L)通过修补相应的液相。摇率(14-35 rpm)和摇摆角(4到10°),选择基于悬架研究的结果。速度压力耦合和体积分数的预测是使用简单的算法和geo-reconstruction方法完成提供的流利。时间步大小是固定在0.005秒。收敛时假设剩余工资低于10⁻⁵。然而,每个时间步迭代的数量限制在100年为了限制中央处理单元周转时间。

2.1.3。此外

PIV测量进行验证CFD模型。为此,FlowMaster PIV系统(LaVision、德国)与双脉冲Nd: YAG激光生成一个1毫米厚激光板使用(海里,英国litron激光)。流体流动模式的生物抑制剂CultiBag RM 2 l被捕在两个不同的位置(从侧面,从下文)。一边录音,特制的袋子用一块有机玻璃沿中心线的使用。这使得处理图像在边缘的记录袋沿垂直激光平面,这是位于中间的半袋。从下面录音进行了整个包。为此,又一个透明的摇摆平台结合镜子下面使用的平台是为了提供光学可访问性对反应堆底部。激光板水平放置1厘米以上包底。成像仪Pro X4 CCD相机(LaVision,德国)与一个分辨率为2048×2048像素是用来获取图像和定位在90°角相对于激光场的直接测量和镜子底部调查。戴维斯®8.2软件(LaVision、德国)是用于控制相机,遍历系统,激光,图像采集,流场的预测。为了想象流体流动模式,rhodamine-coated荧光粒子密度为1.19公斤/米⁻³(LaVision)被添加到包里。一组800双每帧图像位置记录为了获得统计上显著的结果,基于一个审讯的8×8像素重叠50%。测量工作进行了三卷(0.5 L, 1.0升和1.5升),不同的摇摆角度(6°和10°),和摇摆率(15 rpm, 25 rpm, 35 rpm)。锁相测量记录通过光电屏障关注的边缘摇摆平台。对于每个实验设置,图片是在短暂的偏转角度的谐振动4°10°。

2.2。培养研究

2.2.1。细胞、微载体和媒介

低温贮藏hASCs(德国科隆Lonza GmbH)得到一个通知,自愿的捐助(hASCs,第三段,人口翻倍的水平10)被用于所有扩张发生在serum-reduced(5%的边后卫)条件在一个特别发达的媒介(美国Lonza)名为“聚苯乙烯微载体(笼罩,美国)。微载体(MC-2)使用密度从1090到1150公斤米⁻³在125年和212年之间,粒子大小μ米,平均表面积约360厘米²g⁻¹。

2.2.2。分析

每天离线采集标本来确定葡萄糖,乳酸,谷氨酰胺,通过生物传感器(酶)和铵离子选择性电极在BioProfile 100 +(美国新星生物医学)。此外,4′,6-diamidino-2-phenylindole DAPI染色进行和microcarrier-cell-aggregates测量。总测量进行了基于宏观(手提摄影机)和微观照片,由一个用户定义的MATLAB分析(MathWorks, Inc .)、美国)脚本和戴维斯®8.2软件。细胞密度测量使用NucleoCounter nc - 200每样一式三份(ChemoMetec、丹麦)。微调控制项中包含所有microcarrier-cell-aggregates烧瓶和2 L袋用TrypLE选择(美国Gibco生命技术)和孵化前的30分钟37°C hASC收成。

从Miltenyi流仪调查(MACSQuant设备研究,德国)总是与microcarrier-free细胞收获后,执行纯化hASCs样本。样本沾fluorochrome-conjugated反CD14、CD20, CD34、CD45、CD73, CD90、和CD105抗体(MSC表现型装备,Miltenyi研究,德国),代表国际社会推荐的最小表面标记细胞治疗。

2.2.3。康宁转轮瓶查看

为了研究不同叶轮速度的影响细胞生长和聚集形成,六种不同的叶轮速度(25 rpm, 43 rpm,= 49 rpm,= 63 rpm, 90 rpm, 120 rpm)研究了low-serum条件下(5%)在转轮瓶(美国康宁公司)实验MC固体分数的0.01%。对于每一个条件,两个转轮烧瓶(100毫升文化卷)的增长意味着微载体表面360厘米²注射低温贮藏hASCs (3×10³细胞厘米⁻²)和培养为8天37°C, 5%的股份有限公司₂,80%的湿度(常氧)。

在接种之前,微载体悬浮体平衡1 h,推荐的供应商。接种后,4 h依恋阶段实现支持细胞附件叶轮打开之前。接种后4天,50%的生长介质换成新鲜,预热介质。为此,附加的MCs细胞被允许定居,之前50%的介质取代新鲜,预热介质。细胞附着和收获过程被开发和优化Schirmaier et al。20.]。

2.2.4。生物抑制剂CultiBag RM 2 l概念验证种植

名为“聚苯乙烯微载体的固体部分调整到1.43%(7 722厘米²)的概念验证培养生物抑制剂CultiBag RM 2 l。平衡的微载体和接种的细胞进行两个1 L摇动烧瓶。为此,在一夜之间,微载体悬浮培养在37°C, 5%的公司_2,和80%的湿度。每个摇动烧瓶内的细胞接种6500厘米⁻²微载体的低温贮藏hASCs。促进细胞附着,20 h静态依恋阶段接种后被发现最合适的。之后,部分微载体悬浮(平均增长表面= 360厘米²)转移到转轮烧瓶作为控制。转轮的hASCs烧瓶是培养作为转轮实验部分描述2.2。3(叶轮速度= 49 rpm)。剩下的微载体悬浮(意味着增长表面= 7 362厘米²)转移到生物抑制剂CultiBag RM 2 l。预热介质被添加到实现工作总量的1.5 L。实现类似的剪切应力在转轮瓶,这个生物抑制剂CultiBag RM 2 l是充溢着500毫升的媒介。摇摆角和摇摆速度基于生化工程调查(= 4°31 rpm;部分3.2.1之上)。培育9天hASCs 37°C, pH值7.3和0.05 vvm。接种后5天,摇臂平台关闭,包挂允许附加的MCs细胞安定下来。大约15分钟后,50%的培养基可以替换为微不足道的细胞微载体丢失。

3所示。结果与讨论

3.1。康宁转轮瓶

图1(一)显示时间的活细胞密度测量在转轮烧瓶。总结了叶轮速度依赖性生长参数表1。最大的活细胞密度(0.25±0.02)×10之间⁶hASCs毫升⁻¹和(1.25±0.05)×10⁶hASCs毫升⁻¹发现接种后7天。最高的活细胞密度在叶轮的速度达到49 rpm和63 rpm和标准。在悬浮细胞密度标准四到五倍的活细胞密度在120 rpm。这可以归因于两个局部剪切应力水平较低3倍和3倍五倍降低特定功率的输入和(表1)。

在指数增长阶段,hASC增长最快(23.7±0.1 h的倍增时间)计算旋转瓶培养的49 rpm ()。hASC增长最慢(41.3±0.1 h的倍增时间)被发现在120 rpm。尽管低剪切应力,hASCs也慢慢变得更加以叶轮速度低于悬挂标准。这可能是由于混合和由此产生的沉积微载体的不足,因为并不是所有的MCs永久暂停。传质限制细胞生长可能发生损害。

它清楚地可以看到从图1 (b)统计上显著的,更高的EFs(单向方差分析两两比较;Holm-Sidak方法,,)获得(117±4.7)(97.4±3.7)标准。EFs最低和实现在最高的叶轮速度,4倍低于25 rpm和叶轮速度低的43 rpm。

增长的结果(细胞密度,翻倍,和EFs)支持我们的假设操作microcarrier-based搅拌生物反应器在悬挂标准较低确保最大hMSC增长。

从表是显而易见的2乳酸产量最高,决定在120 rpm,而最大的活细胞密度最低。相比之下,特定的乳酸生产速度49 rpm ()比120年降低了3.6和1.7倍左右rpm和25 rpm。此外,表明,葡萄糖的代谢成能量更为高效,工作时标准。经过7天的培养,观察活细胞密度下降,这是培养独立的参数。因为底物和代谢产物的限制可以被排除在外(浓度的培养:葡萄糖/谷氨酰胺≥14.8/4.0更易与L⁻¹;乳酸/≤铵24.8/1.51更易与L⁻¹;(43,44]),这可能是由于microcarrier-cell-aggregates的大小,影响细胞生长。

图2(一个)清楚地显示了microcarrier-cell-aggregate发展。索特平均直径的时间配置文件显示所有测试叶轮速度。正如所料,最高的索特平均直径3.18±0.42毫米的测量以最低的叶轮转速(rpm) 25日8天,相比明显高于其他条件。在这个叶轮速度,积累更大的总量低于观察叶轮。这些发现是在良好的协议与我们先前的CFD Kaiser et al .(公布的调查27]。由于循环回路直接诱导下叶轮,降低流体速度发生在这一地区,促进更大的沉降总量。索特平均直径叶轮最低速度大约是七倍的悬挂标准。有趣的是,索特平均直径为0.55±0.06毫米在120转7天没有明显低于暂停标准(:0.58±0.07毫米;:0.47±0.03毫米),证明三倍高特定输入功率对整个microcarrier-cell-aggregate大小无显著影响转轮的玻璃瓶。结果表明,活细胞密度的降低可能归因于两个主要原因:(I)太高了局部剪切应力(0.437 N m⁻²),出现高乳酸浓度和(2)传质限制由于大microcarrier-cell-aggregate大小(> 0.6毫米)或过低(<叶轮速度49 rpm)。数据2 (b)和2 (c)说明DAPI染色的图片microcarrier-cell-aggregate样本取自运行(7天)标准。

最终培养(7和8),大多数的细胞微载体之间的观察,特别是在大microcarrier-cell-aggregates(图2 (c))。减少细胞密度盛行在索特平均直径约0.6毫米,这是还指出的种植。

任何影响比表面标记物的表达(CD14、CD20、CD34、CD45 CD73, CD90、和CD105),然而,不是发现,在最大叶轮速度和产生的剪切应力水平(最大特定功率输入3.63 W m⁻³和最大局部剪切应力水平的0.437 N m⁻²)或最大索特直径(3.2毫米),反映了最大microcarrier-cell-aggregation大小。因为所有流仪结果相互协议好,只有那些以转轮运行样本如图3。这些细胞被CD73高度积极的(> 95%),CD90、CD105表面标记。造血标记CD34、CD45和CD14和CD20缺席(< 2%)的样品。

3.2。生物抑制剂CultiBag RM 2 l

3.2.1之上。悬架特性

一般来说,dune-like存款的微载体在摇摆利率大大低于标准。这种效应是独立的摇摆角,可以解释为振荡流体流动,一种建设性和破坏性的干扰。随着摇摆利率增加dune-like存款减少,由于更高层次的混合。几乎完整的微载体悬浮被观察到标准。所有调查的条件,标准在2.5完成了摇摆利率高出-8.3%(大约1 rpm)。结果表明,之间的区别和wave-mixed系统的标准远低于搅拌生物反应器(20 - 40%)21,22,27,45,46]。这种现象可以解释为期刊减速和加速的粒子在wave-mixed生物反应器。履行的摇摆利率决定标准4和10°之间摇摆角度范围12 - 26 rpm工作腔容积0.5升,15至32 rpm为1.0 L, 17岁和35岁之间rpm为1.5 L。相应的摇摆率标准在相当范围内。令人惊讶的是,摇摆率之间的线性关系被发现和摇摆角度为每个特定的微载体固体部分。基于多元回归分析相关(见(7))标准被发现: 在哪里(°)定义了摇摆角,[L]工作容积,[g]微载体的数量,(厘米²100毫升⁻¹比生长表面,[公斤米⁻³微载体的密度。预测和测量值之间的最大偏差是大约3 rpm和,因此,是可以接受的。在图4,标准的等高线图显示了三种不同的卷工作。可以看到,的依赖标准在摇摆角减少工作体积增加。

3.2.2。流体流动

摇摆的25 rpm和摇摆角10°,CFD-predicted流体的速度沿等高线中期生物反应器平面如图5(一个)。明显高于流体速度(0.75年代⁻¹)发生在最大挠度为0.5 L工作容积。这是预期的,因为自由表面的运动增加较低工作卷。明显抑制了流体与流体流动速度的0.55年代⁻¹在最大挠度预测更高的工作容积的1.5 L。这一趋势还可以看到成交量加权平均流体速度图5 (b)并独立于摇摆率和摇摆角。最大的成交量加权平均流体流动速度0.5 L, 25转/分,10°高出约1.8倍比为1.5 L(0.14年代⁻¹)。此外,仿真结果表明,摇摆角的变化对流体流动速度的影响高于摇率的变化。最低的成交量加权平均流体流动速度的0.05年代⁻¹得到31 rpm和4°和对应标准的生物抑制剂CultiBag RM 2 l(微载体固体分数1.43%)。Kaiser et al。27]预计成交量加权平均流体流动速度的0.06年代⁻¹为旋转瓶的标准。因此,在1.5 L是可取的扩张hASCs,当可比流动条件与转轮的玻璃瓶。

3.2.3。剪切应力和特定的输入功率

剪切应力分布的概况和具体的功率输入中生物抑制剂CultiBag RM 2 l(包括工作容积、摇摆角和摇摆)总结了表3。剪切应力计算根据Wollny [47],对数的正态分布得到了类似于搅拌生物反应器(27,48]。与搅拌生物反应器不同,流体流动行为wave-mixed系统不能被假定为常数。因此,剪切应力分布计算为每个偏转角在单个包振荡。

在图6(一)、angle-dependent概要的成交量加权平均剪切应力作为模范地提出了三种不同的工作卷10°和25 rpm。当地的剪应力遵循周期性振荡,发生在最大挠度值最高。这并不令人惊奇,因为流体流动加速减速到一个较低的速度,然后在另一个方向。最高的地方剪切应力发生在最低的工作容积的0.5 L值6倍的地方剪切应力的1.0 L和1.5 L卷工作。当地最低的剪切应力值(0.214 N m⁻²)获得的1.5 L, 4°, 31日rpm标准和微载体固体体积分数为1.43%。这些当地最大剪切应力是类似的旋转瓶的标准。10°和25 rpm, angle-dependent特定功率输入基于转动轴的时刻作为一个例子,如图所示6 (b)。一般来说,特定权力的配置文件输入对应的局部剪切应力。最高的功率系数输入出现之前不久的最大挠度。特定的输入功率262 W的最高水平⁻³确定为0.5 L,而最低的特定输入功率为17.69 W m⁻³并取得了1.5 L, 4°, 31 rpm (标准)。电源输入结果与那些通过Loffelholz et al。36和他et al。35]。

3.2.4。PIV测量

验证数值模型,一条线是沿电场测量后的PIV分析数据(见图7PIV的等高线数据)。25转/分,10°,和1.0 L工作容积,CFD-predicted PIV-measured流体速度为例进行描述(a)和底部视图录音(b)图7。短暂的偏转角的测量进行7°时降低了袋子。平均相对偏差只有细微的差别不到15%的被发现之间的预测CFD和PIV测量数据: 之间的差异可以解释的数据偏差最低测量角度和形状的袋子,因为没有流体结构相互作用被认为是在模拟。最大的偏差发生的边缘附近包(见图7(一)和7 (b);l/l₂0.23 - -0.38)。流体流动的抑制高卷也看到的PIV测量工作。除了看进一步的结果(例如,空间波的特征),它可以假定,建立了受到模型提供了可靠的流体流动的预测。

3.2.5。概念验证培养

概念传播的hASCs生物抑制剂CultiBag RM 2 l是成功的,尽管EF 9天后低大约三倍(6.59±0.56)比控制旋转(图8(一个))。2.85×10提供的收获⁸hASCs。Akerstrom [40类似的EF)报道,但在培养时间的两倍。然而,种植过程没有优化的依恋阶段中执行摇动烧瓶和随后的接种的细胞。第一个microcarrier-cell-aggregates已经接种后观察3天。骨料直径的增加在栽培和达到最大大小约6毫米(只有少数总量)的培养。图8 (b)显示了典型地DAPI-stained microcarrier-cell-aggregate样本的栽培。

4所示。摘要和结论

在这项研究中,中止准则的优越性为大众传播hASCs microcarrier-based搅拌生物反应器所示。最高的活细胞密度和EFs hASCs搅拌培养系统中实现。这些结果证实凯撒的观察et al。27),Schirmaier et al。20.],Jossen et al。22]。

在纺纱,活细胞密度最低的是实现最大叶轮速度(120 rpm)。在这个叶轮速度,最大剪切应力比增加了130%。有趣的是,索特平均直径,测量评估时间microcarrier-cell-diameter,低于那些在25岁rpm却与较低的悬挂标准。独立于叶轮的速度,观察活细胞密度的下降意味着索特直径0.6毫米,即使剪切应力水平低和底物限制排除在转轮的规模。细胞密度的减少可能是由于细胞的供给不足大microcarrier-cell-aggregates的中心,虽然具体的表达谱的变化表面标记不存在。然而,正如报告无载体与hASCs查看,细胞总直径0.2毫米的可能已经是至关重要的,减少细胞增殖潜力(34,49]。因此,后续microcarrier-based作品hASCs纺纱和搅拌生物反应器不仅应该包括延长细胞质量控制(分化和凋亡化验)也应注意microcarrier-cell-aggregates细胞的数量。问题是一个关键microcarrier-cell-aggregate总细胞的大小和数目可以定义和使用作为实现最大的收获标准细胞数量所需的细胞质量hMSC扩张。这些研究需要后续调查的扩散限制和检查的细胞生存能力内的聚合和聚集的周长。

这些调查结果代表一个一步高效和健壮hASC大规模生产流程,也对microcarrier-based, wave-mixed生物反应器,暂停标准在第一次决定。这样的一个例子wave-mixed生物反应器是生物抑制剂CultiBag RM 2 l,允许2.85×10⁸hASCs概念验证后收获种植在执行条件。我们建立multiregression模型使得悬架的快速定义标准不同卷可能和支持microcarrier-based的优化工作,wave-mixed生物反应器用于hASC查看。进一步回归模型中微载体类型的考虑甚至会允许hMSC hASCs以外的扩张。

缩写

方差分析:	方差分析
CCD:	中的电荷耦合器件
CFD:	计算流体动力学
DAPI:	4′,6-Diamidino-2-phenylindole
英孚:	膨胀系数
流式细胞仪:	Fluorescence-activated细胞分类
的边后卫:	胎牛血清
hASCs:	人类脂肪基质干细胞/派生而来
hMSCs:	人类间充质干细胞
msc:	间充质干细胞
此外:	粒子图像测速技术显现的
跑:	Reynolds-averaged n - s方程
简单:	Semi-implicit喜欢压力方程的方法
受到:	Volume-of-Fluid
ns:	不显著。

符号

拉丁符号

:	比生长表面MCs(厘米2100毫升)
:	索特平均直径(毫米)
:	体积力[N]
:	重力加速度(9.81年代−2]
:	湍流动能[m2年代−2]
:	数量的MCs [g]
:	悬挂标准(rpm)
:	压力(Pa)
:	特定的输入功率(W m−3]
:	时间[s]
:	倍增时间[h]
:	体液[m3]
:	流体速度[m s−1]。

希腊符号

:	相体积分数(-)
:	湍流能量耗散率[m2年代−3]
:	层流(分子)粘度(Pa年代)
:	π(3.14159)[-]
:	密度(公斤米−3]
:	最大比生长速率(h−1]
:	在时间点偏转角(°)
:	最大偏转角(°)
:	特定的湍流耗散率[s−1]
:	意味着角速度[s−1]。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究是基于一个研究项目的结果(CTI项目没有。12893.1)在技术上和经济上支持Lonza在瑞士和委员会的技术和创新。

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