人类脐带血液血清培养支持人类饲养细胞多能性干细胞系

文摘

尽管人类多能干细胞(hPSCs)可以增殖强劲feeder-free文化系统,基因不稳定hPSCs据报道在这样的环境。另外,馈线使hPSCs维持多能性细胞。馈线细胞通常生长在一个包含胎牛血清的培养基(的边后卫)与hPSCs coculture之前。使用的边后卫可能限制hPSCs的临床应用。最近,人类脊髓血液血清(hUCS)显示出积极的影响的文化间充质干细胞。有趣的是测试hUCS是否可以用于馈线hPSCs细胞的文化。本研究旨在取代的边后卫与hUCS培养人包皮成纤维细胞(高频电炉)馈电单元前准备。在hUCS-containing培养基培养结果表明,高频电炉(HFF-hUCS)显示成纤维细胞的特性,扩散率高,人口翻倍,和正常核型形成经过长时间的文化。灭活HFF-hUCS表示重要的基因,包括激活素A, FGF2, TGFβ1,参与维护hPSC多能性。此外,hPSC线维持多能性,分化能力,和核型稳定后与灭活HFF-hUCS cocultured延伸段。因此,结果证明的好处hUCS hPSCs文化系统。

1。介绍

人类多能干细胞(hPSCs)可以生成使用胚胎植入前的胚胎从孤立的多能细胞,称为“人类胚胎干细胞(为)”(1)或体细胞重编程的使用外源性基因,导致“人类诱导多能干细胞(hiPSCs)”(2]。为和hiPSCs分享表型和分子遗传相似之处(3]。hPSCs可以用作模型发育生物学研究、毒性和细胞疗法(4]。一般来说,hPSCs推导和传播通过与支持馈线coculture细胞与小鼠(1,2]。馈线细胞多能性的发挥重要作用,支持hPSCs通过产生一个复杂的微环境对hPSCs的增长。馈线细胞分泌生长因子,如FGF2 TGF -β1,或苯丙酸诺龙,涉及特定通路控制hPSCs的多能性。此外,细胞外基质,如层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白,产生的喂食器,是必要的细胞相互作用,细胞迁移,细胞增殖(5]。

对于治疗的目的,避免了交叉污染的动物病原体通过更换鼠标hPSCs馈线细胞与给料机应考虑来自人体组织。人类馈线细胞,如人类包皮成纤维细胞(高频电炉),人类间充质干细胞(hMSCs),人类羊膜上皮细胞(hAECs),或人类喇叭tube-derived细胞,被用作hPSCs文化支持馈线细胞(6]。此外,先前的研究已经证明转基因人类馈线细胞可能产生的长期支持hPSCs [7,8]。对于日常文化,人类细胞与胎牛血清的培养基培养补充的边后卫。尽管的边后卫促进人类细胞增殖,人体细胞裸露的牛病毒或其他病原体污染的风险。临床用途,使用动物产品在人类细胞培养应该避免。因为人类血清(HS)显示了一个积极的影响的文化间充质干细胞,它似乎是一个有前途的替代人选的边后卫。先前的研究证明,海关可以用于培养细胞支持馈线为(9,10)和hMSCs显示更大的扩散HS-containing介质与FBS-containing介质(11,12]。尽管如此,商品不仅提升hMSC细胞增殖也增强成骨分化(13]。由于进步hPSCs的治疗应用研究,有必要开发维护hPSCs xeno-free文化条件。最近的研究表明,馈线细胞和hPSCS可以生成和培养良好生产规范(GMP) [14,15)作为一个有用的一步hPSCs在再生医学领域中的应用。最近,人类脊髓血液血清(hUCS)显示出积极的影响的文化间充质干细胞(16,17]。因此,有趣的是测试hUCS是否可以用于馈线hPSCs细胞的文化。

本研究的目的是比较(i)增长,扩散,和核型稳定的高频电炉当培养介质包含hUCS (HFF-hUCS)与的边后卫(HFF-FBS),(2)灭活HFF-hUCS和灭活HFF-FBS的特点,和(3)的多功能特点hPSCs之后长期cocultured灭活HFF-hUCS和灭活HFF-FBS。

2。结果

2.1。补充血清对人包皮成纤维细胞的形态和增殖

高频电炉是在含有hUCS或培养基中培养的边后卫,随后被观察和形态学和增长。我们第一次观察到细胞的差异附件两个文化之间的媒体。在离解后5小时,几乎所有分离HFF-FBS被附加到培养皿表面。高频电炉从圆形变成fibroblastic-like形状。相比之下,大多数HFF-hUCS仍然悬浮在培养基。然而,在离解后24小时内,没有明显的细胞依附和形态学差异HFF-FBS HFF-hUCS和大部分的细胞附着在培养皿中并显示典型的成纤维细胞形态(图1(一))。

种子细胞后,HFF-hUCS的增长和HFF-FBS不断观察直到达到confluency。我们观察到高频电炉培养媒体逐步扩散和达到confluency播种细胞后3至4天。增长的行为类似早期(p4 + 1)和中间通道(p4 + 10)(图1 (b))。相比之下,高频电炉培养在中没有补充和血清培养基补充附加10% KSR文化菜但是细胞不能达到confluency甚至被培养(图7天1 (c))。

尽管HFF-hUCS HFF-FBS并没有明显的增长行为不同,我们观察到一些扩散动力学的差异。HFF-hUCS的扩散动力学和HFF-FBS测定随着人口倍增时间(PDT)连续文化13通道(p4 + 13)。在通过数字4 + 3到4 + 13,HFF-hUCS显示显著短(PDT HFF-FBS相比(图2(一个))。高频电炉的PDT在中无血清培养的补充,并配以10% KSR无法确定由于其扩散不足。

2.2。人包皮成纤维细胞的核型分析在长期文化包含人类脐带血液血清的培养基

观察血清补充的主要影响高频电炉的扩散,表明hUCS促进更好的高频电炉扩散的边后卫。然而,之前使用高频电炉馈线细胞培养人类多能干细胞(hPSCs),我们研究了高频电炉的遗传稳定性通过核型分析HFF-hUCS和HFF-FBS p4 + 13使用G-banding方法。结果表明,培养高频电炉hUCS-containing中没有改变这些细胞的核型。培养后hUCS——或者FBS-containing中高频电炉保持正常核型的46岁的XY(图2 (b))。

2.3。影响补充血清灭活形态和基因表达的人包皮成纤维细胞馈线细胞

在目前的研究中,我们使用HFF-hUCS和HFF-FBS p4 + 5和p4 + 10准备支线层。丝裂霉素后C-inactivation, HFF-hUCS HFF-FBS(图显示典型的成纤维细胞功能3(一个))。灭活HFF-hUCS和灭活HFF-FBS hPSC培养基中培养24小时,收集和总RNA并使用rt - pcr进行基因表达分析。如图3 (b)、灭活HFF-hUCS和灭活HFF-FBS表示激活素A, FGF2 TGF -β1,BMP-4,涉及维护hPSC多能性。

2.4。人类多能干细胞多能性维持与灭活HFF-hUCS馈线Coculture后细胞

在目前的研究中,核型正常hPSC线,包括Chula2。他和HFSK # 11。臀部,。检查hPSCs的多能性之前,细胞不断生长在灭活HFF-FBS或HFF-hUSC馈线细胞至少10个章节。hPSCs的形态,当灭活HFF-hUCS馈线上培养的细胞,没有明显不同于细胞灭活HFF-FBS馈线上培养的细胞。hPSC线显示,未分化的殖民地和定义的边界和明显的突出的核(图4(一))。

灭活HFF-hUCS hPSCs培养和灭活HFF-FBS馈线细胞多能性基因表达,包括OCT-4 NANOG, REX1和UTF(图4 (b))。疣状表明hPSCs培养灭活HFF-hUCS和灭活HFF-FBS馈线表达多能细胞标记,包括SSEA-3 TRA-1-60,交易- 1 - 81,OCT-4(图4 (c))。此外,SSEA-4表达式使用流式细胞仪定量分析表明之间的SSEA-4阳性细胞百分比为cocultured灭活HFF-FBS和灭活HFF-hUCS没有明显不同(与、职责)。有趣的是,比例SSEA-4-positive hiPSCs cocultured灭活HFF-hUCS ()明显高于hiPSCs cocultured灭活HFF-FBS ()()(图4 (d))。

2.5。人类多能干细胞分化能力和核型稳定

灭活HFF-hUCS hPSCs培养的分化和灭活HFF-FBS证实基于胚状体的身体(EB)随后在体外分化形成。结果表明,hPSCs培养灭活HFF-hUCS和灭活HFF-FBS馈线细胞悬浮培养中形成三维EBs(图5(一个))。EBs的体外分化为三个胚胎胚芽层证实了使用疣状外胚层(巢蛋白,PAX6),中胚层(BRACHYURY SMA)和内胚层(法新社)。rt - pcr结果也证实了EBs向外胚层的分化能力,(巢蛋白),中胚层(BRACHYURY)和内胚层(法新社)。此外CDX2,滋养层标记,也发现在EBs(数字5 (b)和5 (c))。

为了评估hPSCs的体内分化,细胞被允许在免疫缺陷小鼠注入后生长和分化。畸胎瘤形成体内分化进行了试验测试。的存在结构,类似于外胚层的内胚层、中胚层组织分化能力的畸胎瘤证实hPSCs cocultured灭活HFF-hUCS和灭活后HFF-FBS(图5 (d))。

后coculturing hPSCs灭活HFF-hUCS和灭活HFF-FBS超过10的段落,hPSCs受到核型分析。结果表明,coculture二倍体hPSC行与灭活HFF-hUCS馈线细胞没有改变这些细胞的核型稳定。Chula2。他保持了46,XY染色体组型和HFSK # 11。臀部保持了46,XY染色体组型两种类型的馈线细胞(图6)。

3所示。讨论

人类多能干细胞的成功推导(hPSCs),包括人类胚胎干细胞(为)1)和人类诱导多能干细胞(hiPSCs) [2),承诺不仅用于治疗患者的细胞或组织损伤,但也对药物发现和探索人类发育生物学。为可以来源于胚胎植入前的胚胎,而hiPSCs可以通过编程生成的体细胞胚胎干细胞的阶段。为和hiPSCs是传统派生和cocultured小鼠胚胎成纤维细胞(mef) [1,2]。由于使用hPSCs衍生品进行治疗的进步发展项目,生产临床级hPSCs是必要的。因此,重要的是要开发一个文化系统实用、简单,临床相关hPSCs的产生和传播。尽管feeder-free文化系统是理想的临床级hPSCs派生的文化条件和文化,这个文化系统仍面临一些限制。首先,许多研究报道的成功的推导和文化hPSCs feeder-free文化系统下使用人工基底膜代替支线层,导致健壮hPSCs扩散。然而,人工基底膜是细胞外基质与老鼠,这使得它们不适合临床级hPSCs作为培养的细胞外基质。其次,更相关的细胞外基质起源于人类重组蛋白,包括vitronectin、纤连蛋白、层粘连蛋白及其组合支持hPSCs的多能性。然而,大规模的人类蛋白质生物功能的净化或生产复合技术是费力而昂贵的(18]。第三,feeder-free文化系统的能力来维持的遗传稳定性hPSCs仍存在争议(19]。hPSC行派生和/或培养feeder-free条件下获得核型异常在随后的文化(19,20.]。

另一方面,传统的文化系统,利用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为馈线细胞,仍广泛应用于确保hPSCs自我更新和多潜能。mef扮演重要角色的监管hPSC多能性通过必要的细胞因子的分泌或分子和细胞外基质(21,22]。因担心使用mef动物病原体和免疫原,几个报告推荐使用人类成纤维细胞,包括人类新生儿包皮成纤维细胞(高频电炉)而不是mef (23- - - - - -25]。结果表明,高频电炉显示支持馈线为hPSCs细胞的特点。有趣的是,目前的临床试验使用hPSCs治疗黄斑变性患者采用馈线文化传播体系hPSCs前细胞分化成视网膜色素上皮(RPE)细胞(26,27]。馈线细胞出现因此保持一个不错的选择对于coculture之前hPSCs使用hPSCs临床治疗。

然而,高频电炉常规培养的胎牛血清和传播——(的边后卫)包含介质之前失活和用作培养hPSCs馈线细胞。的边后卫包含几个未知因素和广泛用于补充在动物和人类细胞培养基。在培养基的边后卫补充影响扩散,维护和人类干细胞的分化28,29日]。然而,使用高频电炉的边后卫的文化可能会导致污染的牛hPSCs病原体(s),通过馈线细胞。为了减少交叉污染,可以取代人类的血清的边后卫。

在目前的研究中,我们试图改善文化条件hPSCs使用人类血清和馈线细胞。本研究中使用的人类血清是人类脊髓血液血清(hUCS)。hUCS曾被证实有有利影响隔离,增殖,分化人类羊水干细胞(hAFS)和沃顿商学院是由我们的合作者(果冻间充质基质细胞16,17]。商业人包皮成纤维细胞(高频电炉)用于本研究已证明是支持馈线细胞为其派生的hiPSCs [23- - - - - -25]。因此,本研究的目的是检查的可行性为培养高频电炉使用hUCS之前馈线细胞的制备及后续使用灭活高频电炉与hPSCs coculture。我们首先证明hUCS可以有效地替代常规文化高频电炉的边后卫。hUCS改善高频电炉的扩散和维持这些细胞的核型和正常功能。其次,mitomycin-C-inactivated高频电炉,以前培养与hUCS-containing媒体,表达了候选基因,包括苯丙酸诺龙,FGF2, TGF -β,这通常表示由馈线hPSC支持细胞(21]。第三,hPSC行cocultured与灭活高频电炉,以前生长在hUCS-containing媒体,维持多能性,分化和正常核型。

血清包含因素细胞提供营养,保护细胞不受压力,影响几乎所有的细胞类型的附件。用人类的主要优势血清培养的人类细胞,尤其是人类干细胞,避免动物病原体对人类细胞的污染。然而,只有使用人类血清的有益作用在人类干细胞文化已经证明(11- - - - - -13]。文化条件下使用在目前的研究中,我们观察到的血清类型提出了高频电炉培养基影响酶分解后的高频电炉的附件。金属堆焊后不久,高频电炉FBS-containing中附着在表面的文化菜肴,而高频电炉hUCS-containing媒介保持漂浮。然而,24小时后,高频电炉在hUCS-containing介质附着在表面并显示形态类似于高频电炉FBS-containing媒介。的延迟附件HFF-hUCS培养皿表面可能反映了不同的细胞因子,生长因子、细胞外基质中包含hUCS和的边后卫30.,31日]。

有趣的是,血清的来源还影响高频电炉的扩散动力学。人口倍增时间(PDT)高频电炉在文化中包含hUCS短于观察的边后卫。扩展PDT限制了细胞的寿命和使用这些实验。因此,hUCS提供了更多的营养和更好的生理环境适合高频电炉细胞分裂而的边后卫。先前的研究已经表明,使用人类血清培养高频电炉延伸的通道数量培养高频电炉。因此,许多高频电炉股票可以获得馈线供应hPSC文化(5,9]。细胞的染色体的稳定性是最重要的问题之一的应用干细胞细胞疗法。在人类干细胞的常规文化,每5 - 10通道定期染色体稳定性分析。长期的文化或文化环境的改变可能会导致培养细胞的核型不稳定(18,30.]。有趣的是,核型分析的结果在目前的研究表明,尽管培养基与hUCS补充,这血清没有改变高频电炉的核型经过长时间的文化。综上所述,hUCS不仅增强了细胞增殖,还保留了高频电炉核型稳定。因此,hUCS适用于高频电炉培养基补充。

使用高频电炉作为培养hPSCs馈线细胞,细胞分裂的高频电炉应灭活。高频电炉的失活可以执行通过与mitomycin-C伽马射线或补充到培养基中。长时间的孵化与高浓度的mitomycin-C可能损害成纤维细胞(32]。在目前的研究中,高频电炉培养hUCS——FBS-containing媒体处理的标准浓度mitomycin-C标准孵化时间(33]。的差异之间的形态外观没有明显观察到灭活高频电炉hUCS和FBS-containing培养基培养。高频电炉在hUCS培养耐药和幸存丝裂霉素C治疗,类似于高频电炉培养的边后卫。之前它已经证明了不同的生长因子的分泌,细胞因子和细胞外基质(ECM)区分支持nonsupportive馈线细胞(21]。蛋白质组学的方法通常用于描述之间的组合和交互网络ecm支持维护为(34,35]。此外,支持feeder-related基因的表达的检测,如FGF2、苯丙酸诺龙,或TGF -β1,也可以用来检查支持用于培养hPSCs之前喂食器。在目前的研究中,灭活HFFs-hUCS HFFs-FBS同样表达了所选择的基因,包括苯丙酸诺龙,FGF2, TGF -β1,通常发现在支持馈线细胞。这些结果是一致的与Eiselleova和他的同事们(21]。从表达的基因灭活高频电炉为维护提供了复杂网络的hPSCs多能状态,表明hUCS文化媒体的补充可能不会改变高频电炉的支持馈线细胞性质。

我们进一步测试的多能性hPSC线经过长时间的与灭活HFF-hUCS或灭活HFF-FBS coculture。hPSC线与灭活cocultured高频电炉无血清培养基。的无血清培养基被认为是合适的培养基为维护hPSCs为了使用hPSCs细胞疗法。结果表明hPSC行cocultured与灭活HFF-hUCS喂食器维持多能性与正常hPSC菌落形态和多能转录因子的表达,包括OCT-4 NANOG, REX1, UTF,多能标记,包括SSEA-3 TRA-1-60,交易- 1 - 81、OCT-4。此外,SSEA-4表达式的量化结果,决定通过流式细胞术,表明灭活HFF-hUCS有效支持hPSCs的多能性的方式类似于灭活HFF-FBS。此外,hPSC行分化成三个胚胎胚芽层在体外和体内,维持一个正常核型,证实这些细胞的多能性1,2,25]。

目前的研究证实的有益作用hUCS hPSCs培养支持馈线细胞。值得注意的是,使用血清池的重要问题从不同的捐赠者和血清hUCS lot-to-lot可变性。控制hUCS的质量,需要考虑几个问题如捐助者必须没有任何传染病的历史,后血清生产过程必须进行严格的无菌技术,或血清对木糖醇的污染被测试。重要的是,每一批的能力应该初步检测血清培养的成纤维细胞馈线细胞之前在大规模使用血清。另外,HFF-hUCS条件指在我们的研究中可用于推导的新成立的hPSC线前适应这样的线xeno-free / feeder-free hPSC线的强大传播文化条件。

总之,这些结果表明,hUCS是一种有效的替代来源的血清的培养基补充高频电炉。hUCS不仅支持高频电炉的增长,但也灭活HFF-hUCS维护支持馈线的特性细胞hPSC线的文化。这些发现好处hPSCs xeno-free文化条件的优化。

4所示。材料和方法

4.1。人类被试

在目前的研究中,人类被试的使用,人类细胞系,并依法进行了血清泰国医疗委员会的指导方针和法规和医学院,朱拉隆功大学。

4.2。血清

本研究中使用了两种类型的血清,人类脐带血液血清(hUCS)和胎牛血清的边后卫。收集的hUCS是我们的合作者和血清收集协议是前面描述的16,17]。总之,每个母亲捐赠脐带血监控以确保没有肝炎等传染病的历史和人类免疫缺陷病毒(HIV)。脐带血血清凝血后获得的是在室温下6 - 12小时,在2800转离心5分钟20°C。hUCS是透过0.22微米孔隙大小。20集中在每一批血清样本,检测支原体污染,保持在−20°C之前被使用。这个hUCS足以确保增长和维持人类间充质干细胞如前所述的multipotency [16,17]。HyClone的边后卫(供应商推荐的人包皮成纤维细胞)是购自热费希尔科学(美国UT Logan)。

4.3。人包皮成纤维细胞的文化

冻人包皮成纤维细胞(高频电炉;产品目录号CRL 2429)从美国购买类型文化收集(写明ATCC;美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。crl - 2429高频电炉证明是支持馈线细胞的生成和文化hESC线(23- - - - - -25]。crl - 2429高频电炉最初在FBS-containing介质分离和培养。高频电炉在通道数目(p) p4从供应商购买。在接收到冻结的股票,这些细胞被解冻和扩展根据制造商的指示用细微的修改。简单,细胞培养使用高频电炉培养基组成88% Iscove修改杜尔贝科的介质(IMDM;热科学),1% Glutamax(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA), 1% penicillin-streptomycin(表达载体),和10%的边后卫在10厘米组织培养菜37°C公司5%₂的气氛。confluency在80 - 90%,细胞分离与p5 TrypLE选择(表达载体)和(p4 + 1)开始,高频电炉是培养在中包含(i) 10%的边后卫或(ii) hUCS 10%。此外,高频电炉在中无血清培养的补充和10%击倒血清替代(KSR;英杰公司)。

4.4。高频电炉扩散

高频电炉的扩散是由计算人口倍增时间(PDT)。高频电炉培养在hUCS-containing介质(HFF-hUCS)或FBS-containing介质(HFF-FBS)之间的PDT决心p4 + 1和p4 + 13。总共1×10⁵每一个细胞被镀6-well盘。细胞分离、计数和confluency通道在80 - 90%,这发生在金属堆焊后大约4天。在每个通道,使用公式的PDT决心PDT = [log10 (NH)−log10 (N1)] / log10(2),其中N1是镀细胞数量和NH在收获细胞数量,如前所述[12]。细胞增殖试验进行了一式三份。

4.5。给料机细胞的制备

HFF-hUCS和HFF-FBS p4 p4 + 10 + 5是用来准备馈线细胞。高频电炉服用10μ克/毫升的丝裂霉素C (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)为3小时。处理高频电炉与PBS洗了5次,分离与TrypLE选择(表达载体),和镀文化盘子的密度细胞/厘米²。

4.6。人类多能干细胞的文化

karyotypically正常hESC线(Chula2.hES)来源于冷冻胚胎(25p15之间)和e, nonintegrating hiPSC线(HFSK # 11.臀部)是人类皮肤成纤维细胞产生使用仙台病毒携带外源基因(36p15之间)和e。最初,hPSC线路派生和培养高频电炉支线层。hPSC线不断保持在mitomycin-C灭活HFF-FBS或mitomycin-C采用无血清灭活HFF-hUCS hPSC培养基。无血清hPSC培养基由80%击倒杜尔贝科的修改鹰介质(KO-DMEM), 20%击倒血清替代(KSR),不必要的氨基酸1%,1%,Glutamax penicillin-streptomycin 1%, 0.1毫米β巯基乙醇(所有从英杰公司)和8 ng / mL基本成纤维细胞生长因子(bFGF;研发系统,明尼阿波利斯,美国)。

培养基是每日更换,hPSC线路机械通过使用23 G针每隔5 - 7天。连续培养后灭活HFF-FBS或HFF-hUCS至少10通道,多能标记的表达决心通过疣状,rt - pcr和流式细胞术。此外,核型分析和体外和体内分化进行。

4.7。免疫染色的多能标记

连续培养至少10通道后灭活HFF-FBS或者HFF-hUCS,表面的表达和细胞内的标记,包括stage-specific胚胎抗原(SSEA) 3, tumor-rejection抗原(TRA) 1-60交易- 1 - 81,和转录OCT-4,决心。检测表面标记,hPSC殖民地是固定使用4% PFA 15分钟,洗3次与PBS和孵化屏蔽解决方案,包含5%的山羊血清或PBS兔血清(σ)5%,1小时。固定细胞孵化主要抗体在4°C过夜。所有主要的抗体稀释1:100年,阻塞的解决方案。隔夜孵化后主要抗体,细胞与PBS洗3次,其次是孵化与二次抗体室温1小时。二次抗体稀释在1:200与PBS。消极的控制进行不添加主要抗体。与二次抗体孵化后,这些细胞被洗3次与PBS和孵化10分钟和4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;σ)核染色。随后,这些细胞被洗了一遍又一遍用荧光显微镜下检查。 The primary antibodies used in the present study were SSEA-3 (Abcam, Cambridge, MA, USA), TRA-1-60 (Chemicon Millipore, Billerica, MA, USA), TRA-1-81 (Chemicon Millipore), OCT-4 (Abcam), NESTIN (Chemicon), PAX6 (Abcam), BRACHYURY (Abcam), smooth muscle actin (SMA; Abcam), alpha-fetoprotein (AFP; Abcam), and CDX2 (Abcam). The secondary antibodies used in the present study were FITC-conjugated goat anti-rabbit IgM (Abcam), FITC-conjugated goat anti-mouse IgM (Abcam), or Cy3-conjugated goat anti-mouse IgG (Chemicon).

4.8。基因表达分析

逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)进行分析支持馈线闲暇的基因的表达(激活素A、FGF2 TGF -β1,BMP4)灭活HFF-FBS和灭活HFF-hUCS pluripotent-specific基因的表达(OCT-4, NANOG、REX1 UTF)在hPSCs cocultured与灭活HFF-FBS或灭活HFF-hUCS以及分化基因(巢蛋白、BRACHYURY和法新社)拟胚体(EBs)。每个条件的总RNA提取三个独立的实验和基因的表达进行了分析。

EBs的总RNA, hPSCs灭活HFF-FBS,灭活HFF-hUCS提取使用GeneJet (Fermentas热费希尔科学,波罗的海,维尔纽斯,立陶宛)根据制造商的指示。一微克总RNA的反向转录互补DNA(互补)使用RevertAid H -合成第一链cNDA工具包(Fermentas热费希尔科学)根据制造商的指示。聚合酶链反应(PCR)进行快速使用KAPA2G HotStart ReadyMix (2 x) (KAPABIOSYSTEMS,开普敦,南非)。PCR产品可视化在1%琼脂糖凝胶。其他地方描述的和引物PCR条件(2,21]。

4.9。流式细胞术

hPSCs coculture后与灭活HFF-FBS或灭活HFF-hUCS馈线细胞至少10通道,的表达SSEA-4 hPSCs评估使用流式细胞仪。天6通道后,hPSCs殖民地机械收割了,分离成单个细胞使用TrypLE选择(表达载体),其次是在1500转离心5分钟。PBS的细胞被洗,离心机,沾FITC反SSEA-4(美国BioLeagent,圣地亚哥,CA)在37°C 1小时。细胞核是复染色使用propidium碘(π;σ)。在PBS的细胞被洗一次,500年resuspendedμL (PBS和受到分析使用流式细胞仪(美国加利福尼亚州圣何塞BD生物科学、)。流仪分析的实验被重复三次。

4.10。在体外分化

评估hPSC体外分化,hPSC殖民地被切成小块,在hESC培养基培养缺乏bFGF诱导EB的形成。EBs悬浮培养基培养7天,随后在Matrigel-coated盘子镀一个额外的14天。共有21天培养后,细胞被应用。permeabilized分化细胞被固定,应用如上所述。外胚层分化细胞应用(巢蛋白,PAX6),中胚层(BRACHYURY SMA)、内胚层(法新社),滋养层(CDX2)标记。此外,执行rt - pcr检测分化的基因表达21-day-old EBs如上所述。

4.11。体内分化

的体内分化hPSCs被畸胎瘤形成化验检查。畸胎瘤形成的协议分析是类似于我们以前的报告25]。总之,共有1×10⁶细胞的未分化hPSCs皮下注入6-8-week-old裸体小鼠的侧面积。两只老鼠被用于畸胎瘤hPSCs每组的测试。注入的细胞可以分化为8 - 10周。之后,小鼠安乐死和畸胎瘤组织从小鼠中删除。畸胎瘤组织与10%多聚甲醛溶液固定,嵌入在石蜡块。4μm部分被苏木精和伊红染色())和检查对胚胎胚芽层。的拥有是依法进行的老鼠研究所动物实验伦理委员会的指导使用(批准号7/57)。

4.12。核型分析

分析染色体稳定性、核型分析HFF-FBS和HFF-hUCS p4 + 13和hPSCs后对两种不同类型的馈线细胞连续培养15章节。与0.1 HFF-FBS和HFF-hUSC孵化μ克/毫升的秋水仙胺(表达载体)15个小时,当hPSCs孵化为3小时。细胞随后使胰蛋白酶化和孵化0.075氯化钾20分钟37°C的5%的股份有限公司₂气氛,其次是修复3:1甲醇/醋酸。中期被传播到显微镜载玻片和染色使用标准G显带技术。染色体是根据国际分类系统对人类细胞遗传学命名(ISCN)。

4.13。统计分析

使用SPSS统计分析软件22.0版本。学生的t以及用于评估人口倍增时间的差异和SSEA-4表达式的百分比。结果给出意味着±均值的标准误差(SEM),和价值观被认为是具有统计学意义。

利益冲突

作者没有利益冲突声明。

作者的贡献

Ruttachuk Rungsiwiwut和Praewphan Ingrungruanglert贡献同样这项工作。

确认

作者要感谢Wipawee Pavarajarn,从医学院,朱拉隆功大学,技术援助。这项工作是财务支持通过泰国的国家研究中心和朱拉隆功大学(GRB_APS_08_56_30_05)。

引用

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