文摘

非常高效。体外扩张具备干细胞造血干细胞的同时保护和自我更新潜力仍然是一个悬而未决的野心。增加数量的方法解决这个问题用三维(3 d)文化报道。在这里,我们描述一个简单的3 d coculture悬滴模型血液CD34的绳子⁺造血干细胞和祖细胞(公司)与骨骨髓来源间充质基质细胞(msc)。当种子混合细胞悬液,msc隔离成紧密的球状体。尽管niche-specific高表达的细胞外基质成分spheroid-forming msc,公司没有迁移到coculture的球状体的初始阶段,表明强烈的msc同型的相互作用。然而,一个星期后,公司附件大幅增加,导致球体崩溃了电镜和免疫荧光染色。在公司扩散方面,传统的2 d coculture系统优于悬滴模型。此外,原始造血祖细胞的扩张更青睐在2 d比3 d,克隆形成化验分析。最后,我们的数据表明,msc,当安排与传播(单层)形状,展览公司支持的品质比spheroid-forming msc。因此,3 d系统并不一定在这方面优于传统的2 d文化。

1。介绍

移植造血干细胞(HSC)是一种常见的治疗过程中患者造血障碍或血液细胞癌(1]。造血干细胞和祖细胞(公司)来自脐带血(UCB)移植被证明是一个有效的来源,结合微创复苏方法的好处和UCB低温贮藏的可能性2- - - - - -4]。但供者细胞通常是可用的小数量的限制因素进行治疗的结果。因此,一个高效的体外扩张的公司需要一个有效的培养法,确保他们具备干细胞的维护包括高自我更新潜能。

在胚胎发生造血作用发生在多个解剖区域。原始的血液开始形成卵黄囊和aorta-gonad-mesonephros地区移动,和明确的造血作用首先发生在胎儿肝脏(5- - - - - -7]。在怀孕的最后三个月期间,公司迁移从胎儿肝脏血液与骨髓造血作用的变化在出生后出现。这种现象使数量增加的CD34的隔离⁺公司的联合。

骨内膜的和独特的微环境血管龛位成人骨髓确保终身维护和调节肝星状细胞通过细胞和分子的专业组合组件(8,9]。成骨造骨细胞,微破骨细胞,内皮细胞周围,周围的周和间充质基质细胞(msc)创建一个特定的细胞外基质(ECM)和表达多种细胞因子,趋化因子和粘附受体调节HSC静止,自我更新和分化10- - - - - -14]。长期文化早期实验表明,骨髓基质细胞能够维持造血干细胞自我更新和增殖在体外(15,16]。最近的研究认为MSC是关键球员的利基在视图中越来越多的MSC亚种群在骨髓中发现基于个人CD146的表达模式,CD140a, CD51,瘦素受体,或巢蛋白(11,13,17,18]。这些亚种群显示HSC维护、高潜力的能力,指定msc作为最常用的细胞类型支持HSC扩张体外。

越来越多的努力,从二维(2 d)转换到三维(3 d)系统,因为3 d被认为反映了文化条件在活的有机体内情况更准确,而细胞层的文化。大量多样性的方法报道试图模仿固有HSC环境以3 d方式通过细胞封装与自然或人工起源或自组装多肽水凝胶和酯复合物19- - - - - -22]。文化较低的设备粘附潜力和microwell数组被测试为3 d模型,但这些应该只被视为“quasi-3D模型”(23- - - - - -25]。可以使大孔支架的生物相容性,类似于骨小梁的生理结构似乎更紧密地代表了自然干细胞栖息地(26- - - - - -28]。然而,许多这些文化的方法折磨缺点由于复杂地表的修改要求,使用动物源成分,或技术要求和耗时的生产流程,使其建立在常规干细胞实验室几乎是不可能的。

在目前的研究中,我们试图发展一个易于使用的3 d模型的扩张绳血液公司与骨骨髓来源coculture msc、两个细胞类型容易获得大多数临床实验室。在这里,我们描述一个程序挂掉的文化导致球体形成紧凑。球状体中的信息交互可视化的电子显微镜,以及niche-specific ECM的合成基质使用免疫荧光染色法进行了分析。公司在悬滴扩散coculture相比在2 d塑料碗。最后,克隆形成试验进行以调查公司扩大的分化潜力的3 d模型。

2。材料和方法

2.1。人类主要的细胞和细胞培养

脐带血液和骨髓吸入物从健康的捐赠者获得书面知情同意的妇产科或BG创伤诊所,图宾根大学分别按照当地伦理委员会指南(参考数字005/2012BO2和453/2011 / BO)。从脐带血单核细胞(跨国公司)被孤立Histopaque (1.077 g / mL)密度梯度离心(Sigma-Aldrich Taufkirchen,德国)和洗杜尔贝科的磷酸盐(DPBS;表达载体,生活技术,达姆施塔特,德国)补充了2毫米EDTA (Biochrom,柏林,德国)。跨国公司的数量被贴上anti-CD34-conjugated微根据制造商的指示(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)。CD34⁺公司是由磁性细胞分离浓缩使用mac列(Miltenyi研究)和立即使用coculture实验。跨国公司从骨髓吸入物、丰富了Histopaque (1.077 g / mL)密度梯度离心,被播种在MSC T75细胞培养瓶血压得到较好的控制扩张中符合当前良好的医疗程序规定(GMP)。GMP中包括DMEM低葡萄糖(Lonza、巴塞尔、瑞士)补充5%新鲜冷冻血浆(TCS生物科学、白金汉宫、英国),5%的人类血小板溶解产物(血细胞捐赠中心、图宾根大学),2毫米谷酰胺(Lonza), 1000年即肝素钠盐(罗斯,卡尔斯鲁厄,德国)和25毫米消息灵通的钠盐溶液(Sigma-Aldrich)。Nonattached细胞24小时后删除。贴壁细胞通常具有多功能msc按照最低标准达成共识会议推荐的国际社会的细胞治疗(29日]。在目前的研究中,msc的2段4。

2.2。3 d悬滴文化

从培养瓶分离后,5×10³msc被播种在40μL中每好一个Perfecta3D 96 -悬滴板(3 d Biomatrix Biotrend,科隆,德国)。发达球状体收集和分析在不同的时间点。

Coculture实验进行的5×10³msc及5×10²CD34⁺公司每40μL介质组成的GMP和无血清扩张介质(SFEM;干细胞技术,法国格勒诺布尔)1:4比例补充与重组人类因为flt - 3细胞因子、干细胞因子(100 ng / mL), interleukin-3,白细胞介素- 6 (20 ng / mL) (CC100;干细胞技术),从这里被称为“GMP-SFEM-CC100媒介。“细胞被保存在一个充分湿润大气有限公司为5%₂在37°C。部分媒体交换每2到3天了。

2.3。球体形成的抑制作用

在挂掉板,5×10³msc悬浮在40μ每口井的GMP中被播种。细胞治疗在一夜之间与function-blocking单克隆抗体对细胞外N-cadherin域(克隆8 c11;BioLegend,英国伦敦)或单克隆抗体anti-cadherin-11(克隆283416;研发系统、德国威斯巴登)。球体形成光学显微镜下检查,代表拍摄照片。

2.4。球体收获和Cryosectioning

Cryosections球状体被用于免疫染色。msc单独或与CD34 coculture⁺公司在悬滴培养板长达两周。MSC球状体的照片被定期和球体直径测定使用AxioVision Rel。4.8软件从蔡司(德国哥廷根)。在不同的日子里合作或单一,用PBS补充了Ca球状体^{2 +}和毫克^{2 +}(PBS^{+ +})悬滴板和固定在4%多聚甲醛(PFA;电子显微镜,哈特菲尔德,美国)30分钟在黑暗中在室温和台盼蓝染色(0.5%解决方案;PAA实验室、Colbe、德国)3 - 5分钟,嵌入Tissue-Tek O.C.T.化合物(Staufen樱花Finetek欧洲,德国)和冻结在-20°C。Cryosections 5到8μ米厚度风干1 h和储存在-20°C。

2.5。免疫荧光染色

球体cryosections解冻和固定4% PFA在室温下15分钟。样本1 h和孵化主要抗体在PBS稀释^{+ +}含有0.1%牛血清白蛋白(BSA;Sigma-Aldrich)。在这项研究中,我们使用鼠标anti-N-cadherin抗体(克隆8 c11),鼠标anti-cadherin-11抗体(283416年克隆),和鼠标anti-CD45(克隆HI30;BioLegend)和鼠标anti-CD90(克隆5 e10汽油;BioLegend)抗体。不同的层粘连蛋白链多克隆兔anti-alpha2链检测了抗血清(bios、弗莱堡、德国)和鼠标anti-alpha4(克隆3 h2)和anti-alpha5链(克隆4 b12)抗体(请提供Sulev博士Ingerpuu, IMCB,塔尔图大学爱沙尼亚)。ECM组件沾兔子anti-collagen IV型(Johannes Eble博士的礼物,明斯特大学、德国)和兔anti-collagen VI型(30.)抗体。鼠标anti-fibronectin(克隆P1H11)和鼠标anti-tenascin-C(克隆T2H5)抗体从研发系统和Abcam(英国剑桥),分别。细胞凋亡分析,部分permeabilized使用0.1% Triton x - 100 (AppliChem;舒伯特& Weiss德国慕尼黑),孵化1 h在阻止缓冲区(5%正常山羊血清,0.3% Triton x - 100在PBS),与兔抗体染色过夜裂解caspase-3(克隆5 a1e)或抗体检测裂解PARP(克隆D64E10;从细胞信号技术;新英格兰生物学实验室,德国法兰克福)+ 4°C。洗后用PBS^{+ +},主要Cy3-conjugated山羊anti-mouse抗体进行检测,Cy3-conjugated山羊anti-rabbit, Alexa萤石488 -共轭山羊anti-rabbit抗体(杰克逊ImmunoResearch;Dianova,德国汉堡)。细胞核被确定通过对比染色4′,6-diamino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI 1μg / mL;罗氏公司,德国曼海姆)。为控制染色主要抗体被删除了。照片拍摄使用Axiophot显微镜(蔡司)。

2.6。扫描电子显微镜(SEM)

CD34⁺公司与msc在挂掉盘子孵化的比例0.5:5×10³7天。在不同的时间点,coculture样本准备SEM分析。细胞悬滴用PBS^{+ +}、固定与Karnovsky固定剂(2%多聚甲醛(电子显微镜科学)、2.5%戊二醛(美国赛瓦、海德堡、德国))在室温下30分钟在黑暗中,用PBS^{+ +},并存储在70%乙醇+ 4°C,直到所有收集的样本。乙醇脱水进行越来越分级系列。样品在室温下干燥,固定化通过单组份cyanoacrylate胶盖玻片(Wevo-Cyamet 75;Wevo-Chemie、Ostfildern、德国),安装在铝持有者使用导电标签(G3347,普莱诺,位于德国)然后用20纳米金溅射镀膜层。使用扫描电子显微镜分析(XL30、飞利浦、荷兰阿姆斯特丹)。SEM图像记录的加速电压10 kV。

2.7。MSC增殖分析

5×10³msc悬浮在40μL GMP-SFEM-CC100介质被播种在平行悬挂板和乘传统的96孔板和培育在湿润环境中有5%的公司₂在37°C。根据需要进行部分介质变化。3天,7天,收获了球状体吸量到96孔板。从2 d和3 d中被文化和盘子直接转移到-80°C。MSC增殖率是由DNA分析内容(一式三份)执行使用后从英杰公司CyQUANT工具制造商的指示。校准曲线是由播种不同MSC数字在96孔板。

2.8。公司扩张分析

5×10²CD34⁺公司被播种在40μ每口井的L GMP-SFEM-CC100介质(单一)单独或连同5×10³msc (coculture)乘或悬滴96孔板(2 d或3 d、职责)。天4、7、10、14日公司扩散率由手动光显微镜下计数细胞的数量(在一式三份)。3 d细胞聚合文化被吸管混合分离,和2 d细胞文化被孵化与Accutase分离解决方案(Sigma-Aldrich) 3 - 5分钟。公司是从msc清晰可辨的基于细胞大小、形状和粒度。

2.9。克隆形成实验

为了分析2 d和3 d的影响文化条件对造血祖细胞的分化潜能,克隆形成试验进行与msc公司扩大在一式三份coculture一周。10³每复制公司在100年被稀释μL Iscove修改杜尔贝科培养基+ 2%胎牛血清(干细胞技术)并将其添加到1毫升甲基纤维素中含重组人干细胞因子集落刺激因子,interleukin-3,促红细胞生成素(MethoCult H4434,干细胞技术)。细胞镀在35毫米培养皿培养充分湿润环境中有5%的公司₂在37°C为14天。细胞聚集含有超过50个细胞被确定为单一的殖民地使用倒置显微镜(Axiovert 135;蔡司)。Burst-forming单位红细胞(BFU-E)和克隆形成unit-granulocyte /巨噬细胞(CFU-GM)殖民地以及殖民地由多功能粒细胞,红细胞,巨噬细胞和巨核细胞祖细胞(CFU-GEMM)计算的基础上由两个独立调查员形态标准。细胞的分化潜能扩大在2 d或3 d新孤立相比,nonexpanded CD34⁺公司。为不同的祖细胞CFU成倍增加计算如下:

2.10。免疫印迹

总蛋白提取是通过孵化文化汇合的MSC与提取NP-40缓冲区包含1%,150毫米氯化钠,40毫米三,2毫米EDTA, 0.5%钠脱氧胆酸盐,0.1% SDS (pH值8),一种蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)。细胞溶解产物在DTT-containing稀释样品缓冲和6% SDS聚丙烯酰胺凝胶上运行。PVDF膜(默克密理博、Schwalbach、德国)用于吸去。未指明的结合位点被封锁Tween-20 Tris-buffered盐水含0.1%和5%脱脂奶粉(罗斯)。污点膜是用鼠标孵化抗体N-cadherin和cadherin-11隔夜+ 4°C。界主要抗体检测与HRP-conjugated或AP-conjugated anti-mouse抗体(Dako,汉堡,德国)和化学发光试剂止动剂(默克密理博)或BCIP /西部电视台衬底(σ),分别。

2.11。统计分析

值表示为平均值±标准偏差(SD)。统计学意义是由双尾参数决定测试或单向方差分析使用GraphPad棱镜5软件(版本5.01)。差异被认为是重要的,,随着程度的意义。

3所示。结果

3.1。悬滴培养的msc导致球体形成和扩散被捕

3 d coculture前,msc在挂掉的行为模型。5×10³细胞被播种在40μL中每口井96井悬挂板下降。一天之内,msc容易聚合成一个紧凑的球体约380 - 400μ米直径。cryosections的苏木精和伊红染色显示海绵的核心球体与笨重的细胞间的空间包围一个紧凑的msc环(图1(一))。细胞粘附分子N-cadherin cadherin-11,早些时候证明调解手持电脑,msc(人类之间的相互作用31日),表达的都是骨骨髓来源msc经免疫印迹(图1 (b))。cryosections的免疫荧光染色显示cadherin-11整个球体的均匀分布,而N-cadherin信号更加突出的边缘而微弱的海绵状的核心(图1 (b))。然而,MSC球体形成在更高程度上受损,function-blocking anti-N-cadherin比之后添加一个anti-cadherin-11抗体,抗体形成额外的小骨料(图1 (c))。然而,这种抑制作用是短暂的,因为2天没有可检测的差异比未经处理的球状体。这些发现表明msc没有任何衬底产生紧凑的总量与紧密的同型的交互。N-cadherin和cadherin-11至少部分负责观察和信息联系的形成,但很可能额外的细胞粘附分子也参与进来。

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图1

msc在悬滴培养板块形成稳定的球状体,不扩散。5×10³间充质基质细胞播种在悬滴板块聚合成一个球体。(a)苏木精和伊红染色的球体cryosection显示了一个典型的形态学和细胞间隙在中部地区和严密的外围MSC环经过3天的文化。(b)人类骨髓msc表达细胞粘附分子N-cadherin和cadherin-11如图所示从汇合的细胞溶解产物的免疫印迹层两个不同的捐赠者。用免疫荧光染色,钙粘着蛋白显然是在MSC球状体检测。msc (c)聚集成球状体研究的抗体N-cadherin cadherin-11。1天,额外的小骨料可检测比未经处理的细胞,当所有显示类似的球状体形态文化第二天。(d)测定了MSC球状体的直径与AxioVision软件显示持续减少超过两个星期。球体大小的四个不同的捐赠者进行了分析。数据意味着±SD。(e)细胞在GMP-SFEM-CC100培养基培养的msc挂滴(3 d)或在传统2 d盘量化一式三份,显示为±SD方法。 The data are representative of three donors with comparable results. (f) Apoptotic cells in 3- and 6-day-old spheroids were detected by staining with specific anti-caspase-3 and anti-PARP antibodies. Cell nuclei were counterstained with DAPI. The immunofluorescence and light microscopy pictures are representative for MSC spheroids of at least three different donors. Scale bars: 100 μm (a、b和f)和250年μm (c)。

球体形成完工后,细胞聚集的直径逐渐下降在接下来两周的文化几乎一半的原始大小(图1 (d)),这表明,相比之下他们的高膨胀率在2 d文化条件下,msc不扩散的三维模型。的确,量化的DNA含量3和7天后显示低很多细胞数量/球体与MSC数字文化(图开始1 (e))。这个试验在GMP-SFEM-CC100媒介执行1:4比因为这混合物被确认为最优的公司扩张coculture研究(补充图S3网上(见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/4148093))。MSC增长停止在球状体只是部分原因是介质成分和主要是三维培养条件的结果,因为在MSC扩张孵化球状体介质GMP表现出相同的增长行为(补充图S1)。球状体的增殖逮捕是伴随着凋亡事件的发生。核蛋白质PARP1 caspase-3可以通过激活蛋白水解处理,在细胞凋亡诱导的关键一步。Caspase-3和裂解PARP1-positive细胞可以检测到中部地区的抱球状体(图1 (f))。凋亡细胞的数量显然是增加了一个星期后。总之,MSC球状体的特点是不断缩小直径由于总压实(比较天3和6在图1 (f))、缺乏增殖和细胞凋亡的发生。

3.2。脐带血公司扰乱MSC在悬滴Coculture球状体

CD34⁺从脐血中分离出公司就一起播种骨骨髓来源msc的比率5×10²:5×10³每口井在96年——在GMP-SFEM-CC100悬滴板和培养2周(图2(一个))。仅为msc描述,msc的coculture同样聚合为紧凑的球状体周围迅速扩张的公司(图2 (b))。扫描电子显微镜(SEM)显示,初(第三天),MSC展出球状体表面光滑,只有少数公司附加到它(图2 (c))。随着时间增加,公司附着力(第四天),直到一个星期后增加coculture当整个球体表面覆盖着公司。这里,造血细胞高度不仅msc还(图2 (c))。

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图2

附件的CD34⁺公司新成立的球状体随时间。(一)coculture实验,5×10²CD34⁺公司被播种在一起5×10³骨髓msc /悬滴培养两周GMP-SFEM-CC100媒介。(b)光学显微镜图像描绘msc聚集成球状体coculture只要一天后的文化。围绕公司大大扩展。14天后,挂掉的细胞密度非常高的球体中心成为看不见的。酒吧规模:500μm。(c)在cocultures形成球状体被扫描电子显微镜(SEM)研究了。一系列的图像从第三天增加放大(i-iv)显示了一个球体,只有少数坚持公司,确定为小圆细胞(箭头)附加的表面相对光滑的球体。4天,更多公司附加到球体(v, vi)。7天后,整个球体的表面是由公司,也似乎在彼此(第七、八世)。规模酒吧:25μm (i, ii, v,七世和八世);10μ米(iii, vi);和5μm (iv)。

球体组成的分析和测定的本地化细胞聚集,cryosections与抗体应用CD90、MSC-specific表面标记,和CD45 pan-hematopoietic标记,msc是负的。coculture在初始阶段,没有任何证据表明公司内部发生MSC球状体因为没有CD45信号检测在第三天(图3)。相反,所有的细胞都CD90阳性。在前一节中描述的球体形态已经是明显的密集外围MSC环可能阻止公司的入侵。这形态逐渐变成一个更紧凑的MSC聚合导致球体直径小。6天,CD45⁺公司发生在球体表面(图3)。coincubation两周之后,绝大多数的细胞总CD45⁺,而CD90显示微弱的片状染色强度,表明核心(图MSC的崩溃3)。在结论中,公司粘附强度的三维悬滴模型相当弱,因为他们可以很容易地分离MSC的球体由广泛的移液,没有消化的酶。尽管混合MSC-HSPC悬挂在播种时间点,两种细胞类型隔离和重新安排重复性良好,表明msc超过他们接触的同型的交互造血细胞。

图3

公司,最初由spheroid-forming排除msc、穿透经过一个星期的coculture球状体。与抗体免疫荧光染色的球体cryosections CD90检测msc和CD45检测造血细胞显示,在3天的coculture球状体完全由msc。coculture 6天之后,压实的球体发生整个球体,CD90染色仍然存在。只有少数CD45⁺细胞附着在球体表面。14天coculture,大多数细胞都沾anti-CD45抗体,而CD90⁺细胞的核心似乎崩溃了。细胞核与DAPI复染色。酒吧规模:100μm。

3.3。MSC Niche-Specific ECM合成球状体

骨髓ECM组件的表达式模式内的免疫荧光染色法研究了球状体。在成人骨髓,层粘连蛋白同种型LM511 ECM(被确认为一个重要的组成部分32,33]。与层粘连蛋白免疫荧光染色的球体cryosections chain-specific alpha5抗体显示强信号,beta1和γ链(图4(一))。层粘连蛋白的alpha4链,也表达了骨髓细胞(33),已涉及造血祖细胞的粘附和迁移32]。观察层粘连蛋白的alpha4链出现在MSC球状体(图高度4(一))。层粘连蛋白的alpha2、beta2和γ₂链,还描述了在骨髓34,35),缺席的(补充图S2)球状体。总之,msc培养积极表达LM411和LM511球状体。

(一)

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图4

骨髓MSC球状体表达ECM组件。(a)的显微图显示免疫荧光染色抱MSC球体cryosections贴上层粘连蛋白chain-specific抗体。强信号对层粘连蛋白alpha4、alpha5 beta1和γ链检测整个球状体。(b)部分coculture球状体收获3和10在天与胶原IV型抗体染色,纤连蛋白,tenascin-C, VI和胶原蛋白类型。虽然所有四个矩阵组件强烈表示早在球状体(上半部分),突出表达才发现tenascin-C和胶原蛋白类型VI的后期coculture(下图)。细胞核与DAPI复染色。酒吧规模:100μm。

基底膜组件胶原IV型检测在早期的MSC球体,表达了同样的高度,纤连蛋白,一个基本组成部分骨髓细胞外基质(图4 (b))。此外,抱球状体合成大量的大型糖蛋白tenascin-C和microfibrillar胶原蛋白类型VI。两个ECM蛋白质显示强劲cytoadhesive属性造血祖细胞(30.,36]。MSC球状体也呈阳性纤维胶原蛋白I型和蛋白聚糖perlecan(补充图开通,基底膜不可分割的一部分,这是一个antiadhesive骨髓基质(37]。10天后在文化、表达最ECM分子显然是减少除了tenascin-C VI(图和胶原蛋白类型4 (b))。这两个组件仍然产生了用支架结构,从而可能使公司聚合即使分解MSC的核心。这些结果说明各种主要骨髓ECM成分参与公司粘附和监管由早期合成MSC在球状体悬滴文化。

3.4。在2 d公司扩张Coculture超过悬滴的扩散率

3 d coculture模型的主要目的是快速和有效的扩张血液CD34的绳子⁺公司。在最初的研究中,一个卷的混合物MSC扩张中GMP与四卷公司扩张中随机补充100 ng / mL Flt-3L和自洽场,和20 ng / mL IL-3和il - 6 (GMP-SFEM-CC100)的增殖率最高(补充图S3B)。与2 d文化进行比较,MSC-HSPC悬挂被播种在相同的体积相同的细胞数量有一艘传统的平底96孔板,MSC容易坚持油井底部和公司均匀附着在MSC单层(补充图S3C)。coincubation一周后,扩大公司的数量每悬挂在一个类似的下降已经明显低于2 d(图5(a))。这种差异更加突出文化后14天()×10⁴细胞在3 d和()×10⁴细胞在二维情况下,职责)。Coculture与msc公司是有益的而在相应的公司作为一个单一系统(图5(b))。扩散的积极作用是当CD34更加突出⁺公司是coincubated MSC单层(褶皱与MSC球体(增加)成倍增加)。在2 d单作系统,扩大公司积聚在一个一半的好而在2 d coculture甚至公司分布在整个区域可以观察(补充图S3C)表明之间的直接接触和信息公司和msc是必不可少的一个有效的扩散前。

图5

公司广泛与MSC coculture单层膜增殖比MSC球状体。扩大公司在2 d或3 d条件下被播种相比500年公司结合5000年msc在96年传统文化板块或挂掉盘子,分别,其次是公司的确定数字在不同的时间点。(a)代表数据从一个捐赠者显示显著降低增殖率已经经过一个星期的coculture在3 d和2 d相比。分析了样品一式三份。使用双尾参数进行统计分析以及。(b)公司人数的成倍增加后获得coculture 500公司的扩张或单一。增殖率最高为2 d coculture检测,而公司孵化与MSC在三维球状体的扩张水平没有超过2 d单作。统计学意义是评估使用单向方差分析。数据显示为四个独立实验的平均值±标准偏差与四个捐助者(;)。

3.5。3 d Coculture不支持扩展原始的祖细胞

Multilineage分化潜力,扩大公司可以通过克隆形成单位(CFU)分析化验。14天的孵化后,殖民地从红色的祖细胞(BFU-E)、粒细胞/巨噬细胞祖细胞(CFU-GM),或multilineage粒细胞/红细胞、巨噬细胞、巨核细胞祖细胞(CFU-GEMM)可以确定基于他们的形态外观和血红蛋白的生产。CFU化验与公司扩大合作或单一7 - 8天在2 d和3 d条件下进行,因为扩散差异各自的方法在这个时间点已经显著。图6(一)描述了特定的分布因未展开的细胞或细胞cfu扩大在2 d或3 d,表示为总菌落数的百分比。总的趋势是观察后增加BFU-E扩张CFU-GEMM为代价的。这伴随着高的红色的祖细胞增殖能力相比脐带血干细胞来自其他来源(38]。公司扩大在MSC单层产CFU-GM显著高于那些孵化挂滴。当公司的增殖率一个星期后在各自的系统考虑,CFU概要文件表示为一个蜂群数量由10的成倍增加³新孤立的,未展开的公司(图6(b)), CFU-GM更明显的差异(在2 d coculture成倍增加;在二维单一;在3 d coculture;在3 d单作)。BFU-E成倍增加,CFU-GEMM往往是高在3 d coincubation系统扩张后但没有达到统计学意义。相比之下,公司的总菌落数从2 d派生coculture显著升高相比,所有其他文化的方法。根据这些结果,公司扩张与MSC在球状体悬滴没有显著有益影响克隆形成潜在的单层细胞生长与MSC。

图6

3 d模型不是有利于增强原始的祖细胞。10 Multilineage分化的能力³公司扩大在悬滴模型或二维培养板研究经过一个星期的文化有或没有msc (coculture和单作,resp) CFU化验。结果相比10 CFU形成的潜力³新孤立绳血液公司(控制)。(一)BFU-E总菌落数的比例在增加体外扩张的CFU-GEMM培养条件。CFU-GM比例的总菌落数大大增强只有在2 d coculture公司。(b) CFU成倍增加了与殖民地的数量相比nonexpanded细胞的增殖率和计算使用各自的文化条件下公司。公司扩大在一层附着MSC总量最多的殖民地。值表示为三个独立实验的平均值±标准偏差从三个捐助者。单向方差分析应用统计分析(;;)。

4所示。讨论

快速和高效体外造血干细胞移植前的扩张仍然是一个挑战,许多研究小组试图克服把越来越多的强调3 d技术。在目前的研究中,我们分析了一个简化的三维coincubation模型血液CD34的绳子⁺公司与骨骨髓来源msc在悬滴文化导致的聚合msc成球状体周围的公司。令人惊讶的是,在传统的2 d公司扩张的文化系统的增殖率高于3 d模型,尽管许多基本的表达骨髓ECM组件中检测出球状体。此外,公司扩大在挂掉盘子不如那些从2 d文化对他们的分化潜能。因此,与被广泛接受的教条,我们的研究显示,2 d传统文化,在某些方面,在某些三维系统是有利的。

悬滴培养方法大大提高了创造与多孔孔板阵列中悬滴是由重力的力量。这些板块目前广泛使用的文化系统在肿瘤生物学和药物测试研究和允许应用程序的自动化液体处理系统的高通量分析(39- - - - - -41]。此外,该系统优于其他spheroid-based方法喜欢粘附力减小文化设备或特定的表面涂层由于其出色的再现性形成的独特的大小的总量。我们所知,我们的研究是第一个使用挂滴法模仿HSC利基在体外。

最近的一项研究报告的表达水平升高的抗炎和抗癌因素抱MSC球状体(42]。与我们的研究结果,Bartosh和同事也观察到球体压实和epithelial-like的外观层表面上(43]。增强msc分化潜力的脂肪形成的和成骨的血统或上皮和神经祖细胞也证明了球体孵化方法(44,45]。这些报告强调,当msc生长层或3 d系统,不仅在细胞形态和结构变化也在转录组和蛋白质组配置文件,因此在细胞的行为。细胞生长最有可能减少在3 d环境中由于细胞接触抑制,因为大多数经验与几个相邻的邻居密切互动,这或许可以解释缺乏MSC的增殖在悬滴球状体。塑料/基质粘附的特性标准高度扩大msc。因此,减少或缺乏机会牢牢地附着在基板可能另外损害他们的扩张潜力。

ECM是一个重要的造血干细胞龛的成分。因此问题出现了外生ECM组件是否应该被添加到挂掉的文化。基底膜基质是一种广泛使用的工具来创建一个3 d环境(46]。但由于不同成分的多样化ECM分子,人工基底膜的使用可能会妨碍再现性(47]。我们的3 d模型表明,在球状体,msc产生大量的ECM组件还发现造血的利基市场在活的有机体内。尤其是层粘连蛋白亚型LM411和LM511,涉及公司粘附和迁移32,33),已经检测到抱球状体。Tenascin-C和纤连蛋白也强烈表达新形成的球状体。公司这些矩阵的附着力组件通过整合蛋白介导的α4β1,α9β1,分别,也调节公司的扩散48,49]。特异性胶原蛋白I型和microfibrillar胶原蛋白类型六世,既为公司[显示cytoadhesive属性30.,50),以及antiadhesive蛋白聚糖perlecan [37在球状体)也表达了。

然而,公司没有迁移到早期的球状体,只显示低胶亲和的msc coculture的开始。在接下来的时间点,公司附件大大增加,伴随着不同的球体压实。因此,公司的另一个重要因素,基质弹性,应考虑在2 d和3 d模型之间的比较。公司已被证明他们的微环境的生物力学特性和将这些信号转导到细胞反应(51]。改变可以改变胶基质弹性交互和人类迁移公司(52]。另一方面,msc还决定细胞命运根据弹性矩阵和单元几何(53,54进而可能影响他们HSPC-regulating功能。人们很容易推测公司更高的紧凑的MSC球状体的刚度和显示增加附件。这将符合观察在2 d文化,几乎所有的公司从一开始就坚持MSC单层coculture,因为细胞分散在塑料弹性肯定是低于细胞聚合为一个球体与细胞间隙大。未来的研究需要使用原子力显微镜测试这些推测的正确性。

不同的人类骨髓MSC亚种群形成不同大小的mesenspheres在描述最近在体外文化和促进公司扩张(18,55]。这些聚合的proliferation-promoting能力不依赖于信息的联系人。相反,我们的结果支持需要直接MSC-HSPC互动,与来自其他组织的报道(56,57]。公司扩大到一个更高的程度,在MSC单层生长,从而经历更大的接触面积比与MSC coculture球体。同样,公司扩大在2 d coculture包含非常粒细胞/巨噬细胞祖细胞和产生明显高于菌落总数。挂掉coculture仅略优越的红细胞和混合内容的祖细胞。总而言之,各自的文化条件不同的造血祖细胞的支持,和直接MSC接触显然比公司在公司中扮演着不同的角色分化增殖。

更真实的繁殖的利基在体外补充额外的骨髓细胞,如内皮细胞可能是必需的。最近,移植单位分离小鼠骨髓间充质和造血干细胞属性被证明是经常与血管相关(58]。然而,公司额外的细胞类型将不可避免地增加每个模型的复杂性和阻碍其实现由于限制材料的可用性。

5。结论

提出的3 d悬滴msc和公司提供的证据3 d模型文化并不总是优于2 d的条件。公司扩张尤其,coculture MSC单层比与MSC球体更有效率。我们的研究结果暗示两细胞直接接触公司需要扩张。虽然spheroid-forming msc完全有能力合成niche-specific ECM组件,他们强烈的同型的相互作用似乎防止广泛的与公司联系。MSC形态、表面分子的表达,及其与公司互动不同当MSC成长为一个传播时的情况相比单层生长的细胞是一个球体,减少体积和表面积。看来msc需要物理衬底以最佳发挥他们的公司支持的功能,应该考虑的一个重要问题体外扩展协议。

突出了

(我)在MSC /公司coculture悬滴,MSC隔离成紧密的球状体。(2)公司最初是排除在MSC但取代MSC在后期球状体。(3)在3 d公司扩张文化是低于2 d coculture。(iv)最多的2 d coculture后发现菌落。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

奥尔加Schmal所做的概念和设计,收集和/或装配的数据,数据分析和解释,论文写作。简•塞弗特做了收集和/或装配的数据,数据分析和解释。Tilman e·谢弗所做的数据分析和解释。克里斯蒂娜·b·沃尔特已经提供研究材料或病人,数据分析和解释。威廉k Aicher已经提供研究材料或病人,数据分析和解释。Gerd克莱因所做的概念和设计,数据分析和解释,论文写作。

确认

作者要感谢以下图宾根大学的成员:挚友Abruzzese(泌尿外科学系)技术支持在MSC隔离,伊娃罗曼(应用物理研究所)为她协助SEM分析,和克里斯托弗·西普博士(医学部门II)的批判阅读论文。这项工作是支持的合同研究“成人干细胞II”的巴登-符腾堡州Stiftung,德国(批准号P-LS-ASII / 23)。作者承认支持由德国研究基金会和图宾根大学的开放获取出版基金。

补充材料