文摘
神经再生驻留在成人中枢神经系统的某些特定区域。成年神经发生发生在生活中,尤其是海马和subventricular subgranular区域的区域,在生理和病理条件下,可以调制。众多技术和动物模型开发了演示,观察神经再生,但为了研究特征的分子和细胞机制和多种类型的细胞群参与激活的神经发生和gliogenesis,调查人员已经转向在体外模型。Organotypic文化最好的概括的3 d组织中枢神经系统,可以探索利用许多技术。在这里,我们审查的使用organotypic文化作为一个可靠的和良好定义的方法来研究神经发生的机制在正常和病理条件。作为一个例子,我们将关注这些文化的可能性提供研究阿尔茨海默病等疾病的病理生理学,帕金森病和脑缺血。
1。介绍
在神经科学研究中使用organotypic文化涵盖实验之间的差距在体外和在活的有机体内模型。它提供了一个机会来培养CNS组织数周或数月,给复杂的细胞系统开放的可访问性。Organotypic文化主要是由P3-P10动物(大鼠或小鼠),或者有一些例外,从成人中枢神经系统组织(例如,1])。年轻的动物产后已经拥有重要的细胞结构和易于处理的胚胎组织,和神经细胞存活的外植体比成人片。然而,神经退行性疾病与衰老和成人的大脑现在不能由年轻动物模型与文化特征。尤其是年轻的大脑不同于成人大脑突触的发育和遗传和代谢。第一次尝试文化从成年老鼠大脑切片和鼠标失败了,因为他们的能力,以减少厚度。片从年轻或围产期动物可以减少他们在350 - 400毫米到100毫米厚度的1或2周后孵化,而成熟的成人片几乎保持厚度超过两周种植期和顺向中央坏死细胞层(见[1]审查)。几种技术的线索被用来克服文化和实现技术organotypic从成人片。逐步减少血清的培养基允许增加细胞活力6-8-week-old老鼠文化(2]。目前还不清楚为什么成功完成撤军血清造成延长细胞的生存能力,但可以推测,血清的负面影响可能是由于过度的神经营养和能源资源(3]。
使用organotypic文化的优势源于其效用在实验中需要长期生存,如生活记录(4,5]或药理学(慢性药物应用程序)以及电生理学和遗传学(6]。
第一次尝试维持中枢神经系统组织切片在长期文化一直是“滚管”技术(7]。这种技术,最后详细特征更Gahwiler和Knopfel [8,9),开发经验的基础上,基于大量的研究与外植体文化(10]。
在滚筒上管文化中,组织是嵌入在血浆凝块和连接在一个玻璃盖玻片。嵌入式的盖玻片切片组织位于管经历连续缓慢旋转细胞培养孵化器。气相界面的氧化作用是由连续的交流产生的缓慢旋转。技术先后几次修改(例如,11,12]),但辊管技术总是收益率非常薄的文化(从最初的400μ米到50μ米)间接优惠使用需要最佳的光学实验条件(例如,电子显微镜或电生理)。
90年代初,Stoppini和他的同事们(13公布一个新方法培养organotypic片。在这种方法中,脑部切片放在半多孔的膜,在气液界面培养。没有凝促进突触重组的研究,成为一个有用的工具来研究塑性和萌芽已经在第一天的文化。这种技术是文化的真正优势很容易准备和提供巨大的优势所需的三维结构时(从最初的400μ米厚度、片培养100 - 150μ米)。如下描述更详细,气液界面已成为一个关键的仪器来研究成年神经发生。Organotypic片可以获得不同的大脑区域(图中描述1研究),但成年神经发生在正常和病理条件下,海马区域包含SGZ和包含SVZ的片是最优先。因此,例如,神经发生在阿尔茨海默病和帕金森病可以在海马和内嗅皮层或美国研究纹状体黑质/ / SVZ /皮质片(14,15]。Organotypic文化匹配的立体的空间,神经祖细胞迁移达到成熟在活的有机体内。摘要Vergni和他的同事(16),我们理想代表了片文化包括subventricular区,随着空间扩展精密的数学模型来描述成神经细胞活化和迁移后氧和葡萄糖剥夺。
(一)
(b)
2。成年神经发生在中枢神经系统
神经发生在正常成人大脑主要发生在齿状回subgranular海马区(SGZ)和嗅球的subventricular侧脑室区(SVZ)。在这两种情况下,神经性的利基市场,SGZ SVZ,主机多功能细胞产生成神经细胞或glioblasts生活。在神经源性干细胞利基市场(1型SGZ SVZ)或B细胞产生更增生性的祖细胞(2型或C细胞),进而产生成神经细胞(3型或细胞)或glioblasts [17]。成人SGZ神经发生是相关的研究特别是对修复机制的研究失去记忆相关的神经退化或神经障碍(审查[18])。SGZ迁移到新成神经细胞生成的齿状回的颗粒区覆盖短距离,而成神经细胞中生成SVZ穿过吻侧迁移流(RMS)嗅球(OB),最后他们径向迁移并分化成新的神经元。
成人神经干细胞(NSC)是神经胶质的特殊形式,源于胚胎径向神经胶质(19]。他们拥有一个区域内模式相关的SVZ胚胎起源和反映能力产生不同类型的OB中间神经元(例如,颗粒细胞、TH +或calbindin + periglomerular细胞;参见[20.])。神经性一半是保证不同族群的多功能细胞以不同标记的表达在不同的时间阶段,如表所示1。国家安全委员会可以被激活,可以诱导神经发生,在不同条件下。一个主要的角色在活的有机体内是由血管和地方血管丛,使营养因素或压力信号分子。这是最近证明了Katsimpardi et al。21),会使老动物的神经发生输血后年轻的动物。没有当地发行量organotypic文化是固定的媒介,通过使用不同的营养因素内在刺激信号,主要是转录因子,例如,sox2 olig2或bmp家庭(22,23]。
3所示。技术用于研究神经发生在OC
从技术的角度,organotypic文化代表了一个多功能的工具来研究神经发生和细胞再生。在活的有机体内神经发生是一个多步骤的过程,包括增殖、迁移和分化的神经干细胞以及集成到现有网络和功能(24]。每个提到的步骤可以化验organotypic片。方法多用于研究细胞增殖是细胞复制的标签标记。最常用的是核苷酸类似物5-bromodeoxyuridine (BrdU)或5-iododeoxyuridine Ki67 (IdU)和核蛋白质。BrdU和IdU纳入复制DNA(在S期),而Ki67蛋白质是所有阶段的核内蛋白表达的细胞复制,都是后来通过免疫荧光可视化。此外,BrdU和诱导器可用于时间窗实验和细胞特征(审查[25])。感染逆转录病毒的荧光蛋白通常用于时间流逝实验。不同感染时间设置允许研究者执行直接连接和谱系研究新生成的细胞在体外(12,26]。
研究细胞分化、BrdU / IdU免疫荧光抗体可以结合不同的标记的区别见表1。分化也可以化验organotypic文化来源于转基因动物表达荧光报告基因。这是记者的鼠标线的情况下神经干细胞和祖细胞表达各种荧光蛋白(DsRedTimer GFP, CFPnuc, H2B-GFP, mCherry)巢蛋白启动子的控制下(27]。与这些动物,我们可以遵循所有进程的分化和增殖和评估各种神经性和antineurogenic刺激引起的变化(28]。使用荧光报告基因也方便验证的最终集成新生成的细胞电生理学的一个先前存在的网络。
可以使用Organotypic文化特别是研究新细胞的机制集成到现有的电路。在模型中提出的Tønnesen et al。29日),他们移植在体外培养GFP-TH neurospheres overexpressing胚胎Wnt5a纹状体organotypic片。他们观察神经元分化(表达神经元标记和自发的动作电位),突触的形成,和多巴胺D2受体的功能表达。在相同的工作,作者可以激活或灭活optogenetically移植细胞表明双向神经元突触移植细胞和宿主之间的相互作用和广泛的移植物内的突触连接。
4所示。Organotypic文化作为中枢神经系统神经退化的模型和研究神经发生
4.1。缺血
脑缺血是由大脑的氧气和营养物质的损失。在活的有机体内生成缺血小鼠大脑中动脉阻塞的产生的损害特定领域(皮质、纹状体和海马),神经元变性,小胶质细胞的激活。在organotypic片缺血性损害是由氧气和葡萄糖剥夺模型(OGD)。生成的神经元损伤分为中央核心,由坏死神经元死亡,和周围半影,凋亡神经元死亡更慢。这后半部分发送死亡信号和启动一个双重与神经性的通信领域。一方面,半影发送求救信号生成保护性因素和激活的SVZ神经发生(30.]。另一方面,死亡信号释放的焦点变性形成生化屏障阻碍成神经细胞从SVZ迁移到受损区域。这也是模仿在网上通过使用皮质纹状体/ SVZ /文化(16]。在本文中,我们确定了细胞外ATP和小胶质细胞激活因素阻碍神经发生和SDF-1之间的交互α及其受体CXCR4作为一个关键信号通路开成神经细胞迁移。
在神经发生的影响神经炎症OGD已经很大程度上研究海马organotypic文化。在这种文化中,OGD CA1区和小胶质细胞产生选择性损伤招聘到受损区域。数篇论文表明,抗炎治疗organotypic片促进SGZ神经发生的通过p38增殖的抑制蛋白激酶和金属蛋白酶31日,32]。金属蛋白酶参与几个神经炎症的激活事件。还在OGD,这类酶能维持神经炎症和调节齿状回神经发生。事实上,文化的调制后微环境OGD海马organotypic文化能促进扩散glioblasts少突细胞祖细胞的主要代(32]。
4.2。帕金森病
帕金森病(PD)是由多巴胺能神经元的选择性神经退化引起的。主要受影响地区的黑质(黑人)和纹状体。然而,多巴胺能变性也影响大脑皮层等其他领域,苍白球和丘脑。缺乏多巴胺和多巴胺的不平衡和glutamatergic信号引起动作迟缓的经典运动症状,刚性,震颤,休息和姿势反射损失。系统”年代。黑质纹状体/皮质”复制在体外与不同organotypic文化。第一次尝试是由Plenz和们33];他们cocultivated辊管技术所涉及的三个主要方面PD变性:大脑皮层、纹状体和黑质。几天后,三个区域是由新型酪氨酸羟化酶阳性纤维连接(TH+)。另一个coculture模型研究多巴胺能变性是由结合Meynert基底核、腹侧中脑,顶叶皮层、背侧纹状体的产后7 - 9幼鼠(34]。然而,这些organotypic片的SVZ的存在是非常重要的在成年神经发生兴趣。事实上,SVZ直接受TH纤维支配表明这些能够维持神经源性小众的维护。organotypic模型,描述了我们保持在一个单片之间的连接美国黑质纹状体/皮质和SVZ [15]。在这种文化中,多巴胺能变性可以获得通过机械损伤或6-OHDA注入。在这两种情况下,损失的多巴胺刺激SVZ的TH表达和增殖细胞,表明多巴胺能损伤后神经源性小众可以激活。此外,尽管6-OHDA生成更具体的多巴胺能变性,机械损伤可以用来研究glutamatergic通路或GABA-ergic变性允许我们代表,分别,早期或先进的PD模型(见[35]审查)。
4.3。阿尔茨海默病
阿尔茨海默病(AD)是一种慢性神经退行性疾病的特点是一个逐步失去记忆和痴呆。广告仍然未知的原因和病因学和受影响的大脑区域更多的海马体和大脑皮层。在分子水平上,大脑病人的特点是淀粉样斑块(密度和不溶性病原体中的β-淀粉样蛋白的沉积β)和神经原纤维缠结(细胞内聚集的过度磷酸化microtubule-associated tau蛋白)。神经退行性病变的第一个证据在广告内嗅皮层的神经元丧失胆碱能纤维连接海马的CA1层(36]。广告是由不同的动物模型模仿从无脊椎动物37]啮齿动物(38]。除了鼠标SAMP8 [39),所有转基因模型结合不同的淀粉样前体蛋白基因突变,τ,presenilin 1。
代表细胞改变的最佳organotypic模型中观察到的广告是海马切片。吸纳和他的同事们(14)使用一个organotypic片,他们保持内嗅皮层和海马之间的联系。这个模型可以特别有用研究胆碱能变性和激活SGZ神经发生的。感应片具有不同的神经退化得到治疗β肽。几个动物模型,β连同神经损伤可能发挥作用在成年神经发生的规定(4]。特别是,低浓度和小肽导致增加苔藓纤维密度和刺激内源性SGZ神经发生。尽管如此,神经炎症有关β毒性可以调解SGZ神经发生的抑制多种促炎细胞因子的释放。
5。本次研究其他Organotypic模型
除了在大脑中神经发生,organotypic文化也被研究在脊髓和pn细胞再生。Organotypic片老鼠成年脊髓可以用液态空气界面40]。脊髓细胞合并BrdU和表达巢蛋白,Oct3/4, Dppa内在质量和造型有再生在脊髓损伤41]。肠神经干细胞(ENSC)与成人肠。他们表达标记喜欢Ret,我和CD49b [42和主要可以分化成神经胶质43),但也为神经元和myofibroblasts。如果神经性ENSC已经证明的潜力在活的有机体内结果,仍然有差异在体外。体外organotypic文化从纵向肌肉和肌间神经丛组织证明5-ethynyl-2′脱氧尿苷掺入ENSC和潜在增殖依赖于PTEN / PI3K / Akt通路(44]。探讨神经发生在听觉系统,Aburto和他的同事们(45)使用organotypic文化移植鸡耳囊泡(OV)。神经上皮的耳祖细胞通过细胞增殖、细胞命运规范,退出细胞周期、迁移和神经干细胞的分化表现特征。在这种情况下,自噬涵盖了相关作用在维护和促进凋亡细胞的清除神经元分化的祖细胞(45]。LC3B的抑制自噬基因标记,organotypic文化misregulation OV引起的细胞周期和影响神经发生。
GDNF能等因素导致的最终neuritogenesis NSC-derived pn organotypic片所示的小鼠螺旋神经节神经元(46]。刺激GDNF-family受体α肾小球滤过率(GFR) 1 (α1)激活两条平行的途径,PI3K / Akt和MEK / Erk特别是在早期产后。
6。结束语
Organotypic神经性的利基市场的文化代表一个有效的替代方法来研究神经发生在中枢神经系统,补充在活的有机体内模型和neurosphere文化。此外,这些文化代表脑损伤模型的一个好方法在广告等疾病,帕金森病,或中风,研究如何实现神经发生大脑修复这些疾病的潜在机制。Organotypic片已经使用尤其是毒性研究;因此,在神经发生的研究中,他们成为了有价值的试验药物对神经发生激活规范或改善细胞命运的影响。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。