评价的组织均匀化支持代GMP-Compliant从脐带间充质基质细胞

文摘

最近的研究表明,脐带(加州大学)是一个很好的来源的间充质基质细胞(msc)。然而,目前协议中提取和培养UC-MSCs不满足当前的良好生产规范(cGMP)标准,部分由于异种的试剂的使用。支持cGMP-compliant方法的发展,我们已经检查了enzyme-free隔离方法利用组织均匀化(张茵)其次是文化在人类血小板溶解产物(PL)补充媒体。后细胞的产量和可行性的张茵与那些获得胶原酶消化后(Col-D)。重要的是,培养细胞的动力学分析显示对数增长超过10测试通道,虽然细胞分裂的速度较低的张茵Col-D相比。这增长放缓t-H-derived细胞也反映在他们的人口倍增时间更长。有趣的是,在没有区别的表达间充质标记和trilineage分化潜力的细胞生成的使用方法。最后,t-H-derived细胞潜力更大的单独使用而Col-D /的边后卫但不是Col-D / PL和能够通过P7保持CFU-F容量。这个实验室规模的研究展示了生成的可能性,治疗剂量的优质UC-MSCs合理的时间长度内使用的张茵和PL。

1。介绍

许多研究已经强调了潜在的间充质基质细胞在组织再生(msc),免疫调节,增强作用的体外造血干细胞(hsc)的扩张1- - - - - -4]。临床应用msc主要归因于他们的低免疫原性和能力的病理学,分化成各种细胞类型,并分泌多种生物活性分子能够调节其他细胞如肝星状细胞和免疫细胞的增长。传统上,msc收获成年来源包括骨髓(BM)和脂肪组织。由于入侵细胞收获过程和逆成年人和MSC增长潜力之间的关系(5,6),是一个紧迫的需要开发这些细胞的替代来源。在这方面,围产期组织,特别是胎盘和脐带(加州大学),已成为有吸引力的msc来源。

可以成功地从所有加州大学样品分离msc。体外扩大UC-MSCs展览细胞表面标记,分化能力,和免疫调节特性与那些BM-MSCs [7- - - - - -9的优势,拥有更高的增殖/扩张潜力(更多的段落衰老)(8- - - - - -10]。这些特性反映了相对原始的自然UC-MSCs相比成人同行。此外,UC-derived细胞没有暴露于病毒和毒素和基因异常可能包含低于成人tissue-derived msc。

UC-MSCs已经被识别和分离各种解剖隔间特别是来自加州大学血管周的地区和沃顿商学院的果冻(WJ)矩阵8,11,12]。在缺乏明显的界定MSC地区之间在加州大学,很难建立region-specificity孤立的细胞。虽然很少有相关研究表明变异之间的分化潜能msc UC不同区域隔绝,没有显著差异报告在生长动力学和表型不同的隔离11]。由于没有明确的区域描述,许多调查人员选择获得细胞从加州大学的整个长度,从而提供更好的细胞产量进行进一步的操作。

代UC-MSC的基本方法包括组织外植体或collagenase-based酶组织消化(Col-D)其次是细胞培养的胎牛血清(的边后卫)支持粘附和msc的扩张。外植体的文化允许迁移的细胞组织和增长的可靠地贴壁细胞产生msc;然而,最初的文化需要更长的时间达到融合Col-D相比,和外植体增长并不代表所有区域的细胞。

为潜在的临床用途,生成UC-MSCs电流良好生产规范- - - - - - (cGMP)兼容的生产方法需要开发,可以可靠地执行在缺乏酶的边后卫。使用酶和的边后卫可能使cGMP过程开发取决于酶的来源和变化相关批次bioproducts [13]。虽然一些替代品的边后卫已经开发(如人类血清,血小板溶解产物(PL),和化学定义媒体补充),(14)缺乏非酶的细胞提取的方法。在这项研究中,一个enzyme-free,简单的细胞组成的隔离方法快速加州大学组织均匀化(张茵)使用GentleMACS分离器(Miltenyi研究)是评价。此外,孤立的细胞的增长和一代的msc在PL的存在,目的是评估支持细胞隔离cGMP-compliant协议的发展和扩张。

2。材料和方法

2.1。样品

2.1.1。脐带组织

本研究回顾和批准有关SSM卫生机构审查委员会(IRB)。脐带()获得阴道或剖腹产手术后,排干的血,并在两端夹紧。所有连线都是在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)和加工在24小时内收集。

2.1.2。骨髓

BM-mononuclear细胞(BM-MNC)样品()购买的干细胞技术公司和解冻按照制造商的指导方针。

2.2。从脐带分离msc

每个绳(12到30厘米长)分为2厘米段和加工提取细胞使用组织均匀化或胶原酶消化。

2.2.1。组织均匀化(张茵)

代表2厘米段进一步剁碎,与PBS清洗,置于一个mac管(Miltenyi研究)。Prewarmed基底媒体(低葡萄糖αMEM、生活技术)被添加到最后一卷10毫升,组织均质与GentleMACS分离器(Miltenyi研究)。管内容被转移到一个新的50毫升猎鹰管、稀释与基底媒体的3卷,然后透过100μm过滤器。

2.2.2。胶原酶消化(Col-D)

酶消化,2厘米剁碎组织与PBS洗净,放入管包含20毫升胶原酶(2.5毫克/毫升,生活技术)和孵化2小时37°C和温和的混合每10分钟。在这种酶浓度,一个小时潜伏期时间取得了最高的可行的细胞复苏(数据没有显示)。最终消化期间,样本稀释与基底媒体50毫升的体积,和上层清液转移到新管通过100年μm过滤器。

张茵Col-D样本离心机,细胞球洗两次,resuspended基础培养基。孤立的细胞从每个方法评估了显微镜下计数(使用血细胞计数器),生存能力利用台盼蓝(技术)。

2.3。文化和孤立UC-MSCs扩张

最初分离细胞代表通过零(P0)镀在多个T25烧瓶1×10的密度⁷可行的细胞/瓶完成媒体(αMEM 1%青霉素、链霉素、新霉素和1%两性霉素B)补充热灭活的边后卫(HyClone) 20%或10%人类汇集cGMP-grade PL(指南针生物医学)。3天之后,媒体包含不依从细胞被和附着细胞与一半的媒体被允许在新媒体发展变化进行每3 - 4天。一旦细胞融合达到80 - 90%,贴壁细胞使胰蛋白酶化使用TrypLE(技术),统计,和山肩通道1 (P1) 2000个可行的细胞密度/厘米²在文化媒体补充的边后卫或者PL。文化持续了10通道除非细胞表现出一致的增长缓慢或衰老的迹象。在每个通道,收获细胞数进行评估,可行性,人口倍增(PD) (9),人口倍增时间(PDT) [2,加州大学组织的累积计数/厘米。不同段落的不同整除的细胞冻存或准备细胞特性如下所述。

2.4。代的骨髓msc

BM-MNCs镀在平均2.5×10⁶每(6-well菜)和细胞培养与20%的边后卫或者完全αMEM补充10% PL。生长动力学,MSC表型,分化潜能而UC-MSCs。

2.5。低温贮藏

细胞冻存在Xeno-free冷冻溶液含有αMEM 50%, 30%的人类AB血清(康宁),和20% Cryosure-Dex40 (WAK-Chemie)。胰蛋白酶化后贴壁细胞,2×10⁶细胞被整除,颗粒状,resuspended 1毫升的低温贮藏的媒体。细胞转移到cryovials和被动冷冻先生使用的冷冻集装箱在−80°C (ThermoFisher)在一夜之间被迁移到蒸汽液氮存储。

2.6。集落形成Units-Fibroblasts (CFU-F)测定

在选定的段落(1、3、5、7),100个细胞被镀一式三份井6-well板的相应媒体(包含的边后卫或PL)有一半媒体变化进行每3 - 4天。后10 - 12天,盘子沾0.5%结晶紫和个别殖民地(> 50个细胞)的数量被数(15]。

2.7。Immunophenotyping培养的msc

在选定的段落(2、3、5、7和10),immunophenotyping是由流式细胞术使用MSC表现型工具包(Miltenyi研究)。抗体的工具包包含两个鸡尾酒:一个表现型(FITC-CD90, PE-CD105 APC-CD73, PerCP-CD34 / CD45 / CD14 / CD20)和一个同形像控制鸡尾酒。在不同的管,0.5 - -1.0×10⁶细胞悬浮在染色缓冲区包含1%的边后卫在PBS和孵化10分钟4°C与表现型或同形像控制抗体。细胞被洗和resuspended染色缓冲区。细胞也沾PerCP-CD31(研发系统)和APC-CD146 (Miltenyi研究)抗体,连同他们的同形像控制(研发系统和BD生物科学、职责),以类似的方式。数据收购Accuri C6血细胞计数器(Becton Dickinson)和至少150000事件收集每个标记。分析使用BD C6 Accuri软件(BD生物科学)来确定比例的细胞表达特定的标记。

2.8。Trilineage分化潜力的评估

UC-MSCs和BM-MSCs分化成成骨的能力进行了评估,脂肪形成的,并使用商用chondrogenic细胞分化工具(技术)。短暂,对于成骨的和脂肪形成的分化,细胞通过3镀在密度为1.5×10⁴细胞每口井(24-well板),在各自的媒体扩散。24小时后,分化诱导控制井继续在文化没有感应。文化被监视的分化和化验后21天,茜素红染色骨或14天,油红O染色脂肪形成。

chondrogenic分化,micromass文化进行分析后,制造商的指示。21天后,chondrogenic小球固定,石蜡包埋,切片,与阿尔新蓝染色评估chondrogenic分化。所有使用10倍显微照片拍摄目标的蔡司Axio观察者A1倒置显微镜和图像捕获使用AxioVision(4.8.2版)软件(蔡司)。

2.9。统计数据

所有数据在这个研究是用平均数±标准差表示。分析使用GraphPad棱镜(5.0版)软件使用的小动物——一张长有学生的以及。统计学意义是。

3所示。结果

3.1。隔离UC-MSCs:张茵与Col-D

为了扰乱UC矩阵和释放基质细胞,简单的张茵使用GentleMACS分离器进行10个不同的加州大学样本。Col-D的标准方法相比,t-H-based隔离方法有一个较短的处理时间(大约3小时和1小时)。每厘米的组织细胞数量和细胞生存能力显著不同的使用隔离方法。活细胞计数/厘米与和细胞生存能力%与%的张茵与Col-D,分别。

刚分离细胞,三个样本,筛选MSC表面标记物的表达。在其他组织来源报道16),只有很小一部分的孤立的细胞(< 2%),无论隔离方法,是积极CD90、CD105, CD73标记(数据没有显示)。

细胞释放的两种方法进行比较的能力形成msc在媒体补充的边后卫和PL。两种方法生成一个附着与呈单层形态(图1),msc塑料文化表面上生长的特点。然而,汇合的时间达到80 - 90%增长不同的在不同的培养条件。文化Col-D /的边后卫或PL达到80 - 90%的融合性的增长相对较短的时间内(天)相比,文化的张茵/ PL (天)。此外,贴壁细胞在不同的段落被流式细胞术对MSC身份验证使用面板的表面标记定义MSC(建议17)(见结果部分3所示。4)。

张茵/的边后卫文化条件下,大多数情况下显示非常缓慢的增长和扩张的失败之外P5(数据未显示);因此,这个条件(张茵/的边后卫)不到足够的UC-MSC生产和排除在我们的分析。

3.2。孤立的细胞的生长特性和扩张潜力

为了生成相关数量的msc的临床治疗应用中,当务之急是细胞对数增长的潜力和能力显著扩大文化。上面附着的细胞产生的实验使胰蛋白酶化(P1),播种在同一密度、生长动力学和评估,PD, PDT在另一个9通道(P2-P10)。更有用的评估,UC-MSCs增长相比BM-MSCs的增长。符合之前的报道(2,18,19),成功的对数增长观察msc在所有文化中在测试10通道Col-D样本的边后卫和PL。然而,8的张茵/ PL文化显示成功通过P10对数增长而观察一种非常缓慢的增长超出P7在文化的其他2样本。如图2(一个),所有成功的文化各自的动力学数据表明对数UC-MSCs和高扩张潜力的细胞生长。的确,UC-MSCs可以通过P10扩张没有损失细胞的增殖活动与BM-MSCs显示减少复制的能力超出通道5(图2 (b))。这同意先前的研究2,7,20.)建议上级UC-MSCs与BM-MSCs的增殖潜力。

在每个通道,我们计算累积细胞数量理论上可以产生从加州大学的一个厘米。年底P10,计算细胞数量超过1×10¹⁵msc / cm在所有的文化条件下(Col-D /的边后卫,Col-D / PL和张茵/ PL)。然而,细胞数量达到在Col-D P10 / PL文化(6.9×10^20.)明显高于张茵/ PL文化(5.34×10¹⁹)对应于累积PD的45.60和29.25,分别(图3)。这个相对增长缓慢的细胞从张茵也反映在长意味着PDT估计早期(P1-P3)和后期(P7-P9)段落(表1)。正如所料,在所有的文化条件下,PDT增加段落末显示培养的msc的增殖潜力的减少。

鉴于上述增长动力学数据,我们还分析了通道的数量和时间需要从1厘米线组织生成十亿个细胞。在这方面,使用的张茵或Col-D和文化在PL,超过十亿细胞可能产生超过3通道;然而,不同时间实现这一扩张之间的隔离方法(天的张茵与天Col-D)。这个数据与观测一致,Col-D文化更快的达到他们的第一阶段,一次文化的PDT较短。总的来说,这些数据表明,尽管Col-D生成UC-MSCs更快,这是可行的生成治疗剂量的细胞使用cGMP-compliant协议的张茵/ PL在合理的时间长度。基于获得的数据使用的张茵从8线样品/ PL、理论产量为3.0×10¹⁰UC-MSCs可以生成大约1月内从单一的三十厘米的长度。这个收益率将允许治疗40例(基于病人体重70公斤,平均每个剂量的双注入剂量500万细胞/公斤)在一个大酒店的临床试验。

3.3。CFU-F MSC准备的内容

骨髓间充质形式殖民地的能力被认为是一个重要的参数来判断培养细胞的质量(21]。随着通道数量的增加,预计潜在的细胞克隆细胞减少(22]。因此,我们评估单独生成使用的张茵和Col-D msc的潜力。同意建立生物学特性的msc、CFU-F殖民地所有条件的数量减少和增加段落(数字4(一)和4 (b))。CFU-F内容更高的文化补充了PL的边后卫相比,和UC-MSCs优越集落形成内容相比BM-derived msc(图4 (b))。重要的是,张茵/ PL文化有一个更大的集落形成能力相比传统文化Col-D /条件的边后卫。这表明细胞生成cGMP-compliant条件下有很好的自我更新能力相比,目前使用传统的协议。

3.4。表型鉴定和UC-MSCs Multilineage分化潜能

证明文化从加州大学细胞分离的方法建立msc、细胞流式细胞术进行评估的参考标准设定的ISCT [17]。一般来说,发现超过80%的细胞表达间充质标记(CD73, CD90、CD105)(图5)和负(< 1%)对造血(CD45 CD34)、单核细胞(CD14), B细胞(CD20)和内皮(CD34、CD31)标记。此外,UC-MSCs进行评估,最近发现pericyte-like msc (CD146的表型⁺CD31⁻CD34⁻CD45⁻)[23]。这个群体> 75%的UC-MSCs表示。对隔离方法,间充质标记都保持在长期的文化,没有任何明显的变化在10通道。此外,这些细胞表现出trilineage中胚层分化(chondrogenic脂肪形成的,和成骨的)的潜力,msc(图的特征6)。在我们的分析中,分化的潜力UC-MSCs评估在所有测试样品无论P3出现类似隔离方法和培养条件。BM-MSCs被用作一个积极控制所有分化实验。与之前的报道相一致,的能力向脂肪细胞分化UC-MSCs BM-MSCs[相比非常低20.,24]。

4所示。讨论

传统上,孤立的加州大学用培养的外植体基质细胞已经实现或通过胶原酶消化细胞内的纤维。一些方法论的差异报告(了25])从切除血管保持完好无损,使用酶消化和外植体文化的结合,采用胶原酶单独或结合胶原酶、透明质酸酶和胰蛋白酶。而酶消化的结果在一个更均匀释放的细胞,它的缺点是再最初的处理时间(3到18小时),缺乏一个标准的方法,从非人类以来non-cGMP-compliant试剂得到很难获得clinical-grade物质来源。或者,外植体文化有较短的处理时间但是他们遭受的不均匀性细胞的迁移和不当的依从性组织碎片培养皿导致变异的细胞获得文化的数量和质量(26]。鉴于干细胞的区划的异质性分布在加州大学组织(19微分细胞释放),可能会影响“具备干细胞分化能力生成的msc (9]。因此,我们试图评估,在实验室规模,这种方法会导致快速和均匀释放细胞的优势使用Xeno-free试剂支持cGMP-compliant协议的发展。

先前的报道表明,胶原蛋白是服从简单的机械破坏(27,28]。在此基础上观察,我们假设可行的细胞可能会从加州大学组织使用简单的张茵prewarmed缓冲区。因此,我们使用了GentleMACS分离器实现快速、均匀,轻微破坏加州大学矩阵释放基质细胞。简化协议和实现更好的隔离收益率从不同组织间,我们选择不带血管和羊膜绳之前的趋同性。这最小的处理并不影响生成msc的纯度,可以在极低的百分比内皮(CD31)和造血细胞(CD45)在我们的文化。我们的协议是基于简单的切割和装腔作势的整个线成小块,洗清除血栓,和均质化统一发布的组织细胞。此外,开发和描述cGMP-compliant方法一代msc、细胞生长和扩展人类PL,测试一个公认cGMP-compliant替代的边后卫(9,29日,30.]。在这项研究中,我们演示了生产大量可行的可能性UC-MSCs PL-supplemented媒体中使用简单的张茵和扩张。这里,我们继续观察不仅可行性的优越性集中PL作为培养msc (cGMP增长补充14,29日,30.]。在所有文化中,无论细胞来源和隔离方法,PL MSC的边后卫相比,促进更好的发展。

这里描述的方法有几个优点,包括均匀释放细胞,较短的处理时间,没有任何酶的细菌来源。使用生成的msc的张茵了指数增长潜力,优秀的单独使用能力,和间质表型特征。虽然张茵——派生细胞增长缓慢的Col-D相比的,他们保持着良好的CFU-F潜在的甚至在之后的段落(通过P7)。这与报告证明减少或没有单独使用能力(除了通过5)使用外植体文化生成的细胞(9]。此外,临床的目的,提出了最优时间收获细胞是通过5日或30前人口倍增31日]。使用的张茵,理论上我们可以实现临床相关的细胞数量三个段落,不到10人口从一个绳倍增,使该方法可行的临床开发。虽然collagenase-based方法生成更多的msc /厘米线在更短的时间,没有显著差异的细胞表型和使用的张茵分化细胞的潜力。鉴于监管障碍相关试剂的使用动物来源,组织均匀化增长紧随其后PL代表了一种简单、实用的替代目前使用的协议。我们隔离/扩张技术利用GMP兼容的试剂,可以进一步改编成一个完全符合GMP的方法选择等其他要求应满足临床资格捐助者筛查传染病和产品安全的保证所示没有细菌/真菌和支原体污染的情况下,可接受的内毒素水平,缺乏致瘤性的证据。

最后,我们从不同的隔离和冻存细胞培养条件(张茵/ PL、Col-D / PL和Col-D /的边后卫)在不同的段落来生成一个主银行的研究细胞用于未来的研究。如上所述的方法,Xeno-free试剂用于低温贮藏,使这个协议cGMP-compatible过程的每一步。初步调查结果直接的细胞冷冻解冻后超过6个月显示细胞恢复和生存能力80%以上。在平行,没有明显改变增长动能和集落形成潜在解冻后观察到的(数据没有显示)。未来的研究可能的目标向广泛描述cryostored细胞稳定性,nonmesodermal细胞类型分化潜力,等临床相关指标和评估免疫抑制和造血支持能力。

5。结论

这项研究描述了一个小型、非酶的cGMP-compatible方法使用整个线组织均匀化增长紧随其后血小板溶解产物作为一个用于生成UC-MSCs替代目前使用的方法。使用这种方法,临床相关数量的细胞,单独使用,满足的标准标准MSC标记表达和中胚层trilineage微分可以有效地获得治疗的应用潜力。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这个项目由圣路易斯脐带血银行和SSM红衣主教Glennon儿童医院。作者要感谢圣路易斯脐带血银行工作人员在这些研究的支持。

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