文摘
虽然神经发生的机制已经被记录在其他生物,人类和这些物种之间可能存在根本性的差异指的是种特异的上下文。基于原则从其他系统,发现神经感应和规范所需的信号通路的人类胚胎干细胞(为)的胚胎早期发育完成在活的有机体内在一定程度上。这突显出的有用性为其在理解早期人类神经发展和强化了需要集成的原则为一个有效的神经发育生物学和生物学hESC分化。
1。介绍
发展的脊椎动物中枢神经系统(CNS)是最早的事件在胚胎胚芽层感应,它一直被认为是一个步骤后胚胎外胚层的形成(1]。这种发展涉及多个步骤,开始感应的神经上皮从胚胎外胚层和完成大脑的不同部位的模式。中枢神经系统是一个复杂的组织,细胞的数量和各种细胞类型。此外,数十亿神经元交互非常精确的方式以形成功能的神经网络。中枢神经系统随着时间的推移形成在胚胎发生和迅速转换从简单的大脑和脊髓神经板。形成许多不同类型的神经元和胶质细胞在成年中枢神经系统,胚胎细胞增殖和分化在严格控制的方式,在过去的几年里已经取得了快速进展的理解背后的分子机制启动,增殖,分化的中枢神经系统2]。小鼠、鸡和斑马鱼长期以来被认为是生物模型研究脊椎动物发展。研究这些生物提供了胚胎发育的分子机制和细节开始显示潜在的病理生理机制的一些重要的发展/人类先天性异常。然而,在人类发展的终极追求理解的机制,目的是预防和治疗人类发育缺陷,这些研究仍显不足。理解分子相互作用基本人类发展的可用性是有限的人类胚胎和stage-specific量不足和细胞特定类型的材料。这些问题现在可以解决人类胚胎干细胞的使用。
2。人类胚胎干细胞的特性
人类多能干细胞(hPSCs),这里包括人类胚胎干细胞(为)和人类诱导多能干细胞(万能),能够无限扩展,并分化成为所有人类生殖层在体外和在活的有机体内(3,4]。在胚胎发育期间,多能干细胞存在只有短暂和迅速分化成各种体细胞发育过程(5]。然而,它可以隔离体外多功能鼠标和人类胚胎干细胞胚胎囊胚的内细胞团和维护他们在实验室。人类胚胎干细胞(为其有能力更新和维护他们的发展潜力为衍生品的所有三个胚芽层,即使长时间未分化增殖和/或克隆推导(6]。此外,为能增加胚胎外的谱系,包括滋养外胚层和原始ectodermal-like细胞(4,7]。有趣的是,为其能够表达高水平的端粒酶,碱性磷酸酶,关键转录因子也被认为在维护至关重要的内细胞团多能性(8,9]。这些因素包括POU-family转录因子OCT4、NANOG homeodomain dna结合蛋白质,SOX-family SOX2转录因子。定义的胚胎标记抗体SSEA-3和SSEA4为以及细胞表面表达的蛋白多糖被几个单克隆抗体,包括TRA-1-60和交易——1 - 81 (10]。的成功推导为其提供了一个独特的机会来研究早期人类发展前景,认为举行一个盛大的生物制药和再生医学11,12]。指出,为其差异化的文化遵循分层的信号,调节胚胎发育的胚芽层的生成和特定的细胞类型在一定程度13,14]。此外,由于难以获得早期人类胚胎和stage-specific和细胞特定类型材料数量不足,似乎为其提供了一个有效的模型来理解复杂的信号交互发生在人类胚胎。特别的能力定义为其分化成神经血统,神经元,星形胶质细胞,少突胶质细胞,是基础研究在神经发育早期发生的事件顺序(14,15]。完全,为一个合适和有效的系统地址信号通路的重要角色参与神经血统的承诺,最终,神经紊乱的病理模型。
3所示。人类胚胎干细胞的应用前景
虽然成功的建立为引发了许多伦理问题,涉及开发、使用、和破坏人类胚胎,为其提供另一种有用的细胞来源几个潜在的应用在基础科学和治疗。直接hESC分化在体外沿着选择的途径将允许人类发展早期事件的调查,包括监管信号细胞承诺和形态发生。此外,细胞也可以用于候选药物的筛选和致癌或有毒物质,无法分析人类胚胎由于道德约束。然而,调查的潜在效用为治疗人类疾病处于婴儿阶段,因为有几个问题需要考虑,也就是说,效率,安全,和功能(12]。
今天在再生医学的最紧迫的问题是缺乏合适的供体器官和组织。的多功能发展潜力为和移植的成功分化衍生品为动物疾病模型强化这个细胞的有前途的应用类型。这个证据橡皮的原则使用hESC-derived特定细胞再生细胞移植治疗人类疾病的来源16,17]。的一个关键问题导致为技术用于细胞和组织治疗人类移植和主机之间的组织相容性。最近的数据支持这一概念,为其分化及其衍生品具有免疫特权属性(18),这表明细胞诱导免疫耐受为其可能提供一个潜在的工具(19]。maternofetal免疫耐受的基础上观察到的怀孕期间随着上述免疫的ESCs分享特权属性,是否为和他们的后代可以被认为是潜在的向量耐受诱导同种异体接受者需要成为一个地区活跃的调查(20.,21]。
在另一个场景的词“个性化的多能干细胞”,人们可以用自己的体细胞重编程回到多能干细胞的状态。第一次证明了重组的可行性体细胞核转移(SCNT)或克隆。病人的体细胞融合无核的卵母细胞;此后,为其在文化和建立可以诱导在体外分化为不同的细胞和组织(22]。然而,体细胞核重编程的一个卵母细胞仍然是低效率的过程。此外,访问人类卵母细胞的来源不仅是一个难得的机会,也是一个道德问题世界范围内(23]。作为替代SCNT重组,成人成纤维细胞可以直接重新编程状态,类似于为其表达的只有四个因素,OCT4、KLF4, SOX2,原癌基因(3],术语“诱导多能干细胞”等“重编程”的细胞或万能。然而,重编程体细胞技术是必要的病毒,nononcogenic, nongenetic修改万能干细胞可用于治疗前的人类患者(24]。
另一方面,为其分化及其衍生品可以用于筛选开发新的潜在的药物和有毒以及诱变化合物。在原代细胞培养或建立细胞系通常用于两个目的,为其提供了一些优势。为有能力区分有效地产生无限数量的细胞代表三个胚胎胚芽层。hESC-derived发育等价的人群提供了一个更严格的评估体系产生畸形的embryotoxic物质的影响,除了一般诱变和细胞毒性的影响25]。一个协议的基础上为其分化已经建立和验证用于毒性测试(26]。此外,基因改造使hESC线条的剪裁为特定目的。例如,特定的基因可以被改变来增加对诱变剂敏感性或药物(27,28),或组织报告基因可以引入检测基因表达改变诱导有毒化学物质或药物(29日]。
最后,通过分析了解哺乳动物胚胎发生早期的胚胎是由许多复杂的因素,包括大小、可用性和胚胎和子宫环境的复杂性。由于为其前体所有胚胎血统,这些细胞允许跟踪历史从根个体细胞谱系树的树枝在简化和可控的文化环境。为系统分化在体外提供了实验模型,可以用来增强在体外的研究在活的有机体内哺乳动物胚胎发生、促进更好的理解基因和信号通路调节发展决策。一个担忧是,细胞培养没有复杂的细胞和组织间的相互作用,在不同的发展阶段胚胎诱导的关键。然而,这些细胞间的相互作用在很大程度上可以重新创建文化在未来为了反映了组织工程的结合在活的有机体内环境,允许更好的系统研究胚胎发生。
4所示。神经分化人类胚胎干细胞
从动物实验越来越多的证据表明,神经系统的形成可以诱导信号来自胚胎的地区被称为“组织者”分泌一些分子包含一个直接的神经活动,包括大脑在内——卵泡chordin,过分生长。这些分子作为中央抑制剂骨形成蛋白(BMP)信号通路,守恒的抑制机制从节肢动物神经发生脊椎动物(30.]。BMP的对抗已经被认为是神经诱导的关键和启动过程和神经上皮的规范,这被认为是发生一个默认的路径(31日,32]。基于这个基础,为其有效地诱导神经祖细胞通过应用BMP抑制剂,‘诺金’,到文化系统33,34]。然而,挑战这个模型和其他研究结果表明,一些额外的因素,包括成纤维细胞生长因子(fgf)和切口,也参与神经诱导过程。畸变的FGF信号减弱神经感应过程从鼠标的ESCs35],FGF信号显示的缺陷与BMP通路互连,以防止神经干细胞的分化30.]。同样,切口神经信号中扮演一个重要的函数入口的ESCs的命运36]。本构激活鼠标ESCs的Notch信号不改变其表型但在撤军自我刺激促进神经分化。相比之下,抑制Notch信号抑制神经的命运的承诺。然而,建议Notch信号导致神经分化需要并行通过FGF信号通路(37]。出于这个原因,一个平衡的观点神经感应过程最有可能要求将指导和抑制信号。
几个策略来实现在体外从为神经分化,针对产区特定神经祖细胞或成熟的神经元或神经胶质亚型(38- - - - - -40]。这主要是通过细胞聚合或胚状体的身体(EB)形成神经感应介质和高纯度的人群的神经祖细胞可能进一步孤立和培养41,42]。这些神经祖细胞可以扩展为25岁以上人口倍增neurospheres悬浮培养。neuroectoderm neurospheres表达标记,包括巢蛋白、polysialylated (PSA) N-CAM Musashi1, PAX6 [41]。重要的是,神经祖细胞可以分化成所有衍生品的神经系统,神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。重要的是,EB-based协议可以诱导特定的神经元亚型,例如,前脑胆碱能神经元,这显示成熟和功能的电生理概要43]。然而,由于为多能,神经分化通过EB文化包含几个局限性。首先,由于集群EB的性质,很难想象细胞形态的不断变化对治疗的反应。接下来,由EB形成神经转换的效率是有限的和神经系选择是必要的,以确保神经祖的浓缩。此外,hESC总量的结构防止补充形态因子或生长因子的均匀分布。高浓度的形态因子或生长因子是必要的为了分散细胞内聚集的因素44]。因此,细胞表面的EB和内部形态因子的总量将会遇到不同的梯度。,由于这个原因,一个广泛的细胞或细胞命运源于neurospheres截然不同的发展阶段。克服的局限性EB协议,一种简单的方式来重建神经祖细胞的神经分化,实现高效生产是基于单层分化为其制度。时指出,运用类似的单层分化系统用于指导鼠标ESCs神经命运,为其成为nonneural谱系细胞的大部分。这主要是高度活跃的结果BMP信号通路在为其7]。此后,成功的方法,诱导有效的神经转换为显示,通过直接抑制BMP / SMAD信号(33,34]。补充为‘诺金’,一个BMP的对手,在神经诱导中生成一个高度纯和形态不同的细胞表达几个神经祖细胞标记,包括PAX6 Musashi1, SOX2,没有检测中胚层和内胚层的谱系标记(33]。强化所需的神经祖细胞的纯度,利用神经特定监管元素控制的表达荧光蛋白是一种强大的替代工具,有效识别和隔离hESC-derived神经祖细胞的荧光细胞分选技术(45]。
5。人类胚胎干细胞作为人类神经的发展模式
大脑是外胚层的胚胎起源。在神经胚形成过程中,神经板折叠在本身,成为神经管。因此,前脑、中脑和后脑的中枢神经系统和形成。细胞命运决定在开发大脑控制的信号分子,由邻近组织分泌。神经系统疾病动物模型的发展是具有挑战性的,常常质疑它完全概括人类表型。为其提供另一种方法,因为神经细胞分化在体外为显示几个属性相当于发展中胚胎大脑(46]。正如上面提到的,至少有两个系统发达为探索人类神经发育,细胞聚集和细胞的贴壁培养系统(42,47]。突出,定向分化为附着系统显示显著的相似性在体外分化和在活的有机体内neuroectodermal发展(图1)。的形态为其转换为柱状神经上皮分化的7 - 10天后,进一步发展成神经的前面莲座状结构在分化(14 - 17天42]。因为为一般都是从5 - 6天囊胚的胚胎,一代的柱状神经上皮分化的第十天,和神经花结形成14 - 17天对应的原肠胚形成阶段的第三周,成立后,神经管的人类胚胎的妊娠第三周(48),分别。完成后的神经板的发展在活的有机体内神经管的生成将陆续开始,但不会发生在发展中神经管均匀和同步。相反,神经管的背腹侧的和rostrocaudal域为了设置一个网状的结构位置信号沿其轴(49]。这强调了关键需要建立位置信息,可以有效地促进特定亚型的神经元和神经胶质细胞的生成在体外从为。模拟位置指令在实验室文化,形态因子或生长因子影响背腹侧的rostrocaudal命运的选择可以应用在同一时间或顺序的方式。通过应用FGF8,已知影响mid-hindbrain神经元表型,和声波刺猬(嘘),ventralizing因素,进一步' hESC-derived神经祖细胞进入中脑多巴胺神经元(50]。没有这些位置的因素在体外异构神经元亚型分化导致的生产。这表明一组特定的形态因子的补充一个特定的时间点是至关重要的神经祖细胞进入模式所需的神经元亚型(15,51]。
“神经形成莲座状结构”形态的标志在体外分化为神经血统,模仿在活的有机体内结构发展中神经管(48]。在化学定义为媒介的文化与BMP抑制剂,‘诺金’,导致PAX6的生成+/ SOX1−神经诱导PAX6 FGF2的花结和成功的补充+/ SOX1+神经祖细胞(52]。Rosette-forming神经祖细胞表达前脑标记,如Forse1,提出了最广泛的分化潜能,相比于其他神经祖细胞的数量(53]。这些细胞可以传播FGF2的存在和保留高Forse1表达水平,尽管FGF2公认caudalizing因素的神经祖细胞(39]。此外,神经细胞圆花饰能够乘以对称细胞分裂和有能力区分前后的细胞类型,中央周边神经系统的神经元亚型和长期稳定在一个文化通过刺激嘘和Notch信号通路53]。hESC-derived神经元突触发生也可以用来研究当镀到特定的馈线细胞(54]。除了功能神经元,hESCs-derived神经祖细胞也能产生星形胶质细胞和少突胶质细胞在基底条件下或有益的文化系统,这是媒介补充纤毛神经营养因子和血小板源生长因子(PDGF) [55]。承认在早期神经发育、神经胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞等提出后出现的大多数神经元细胞类型(56]。神经发生的类似场景gliogenesis过渡是守恒的,当外植neuroectodermal细胞培养或为其分化的神经血统(14,57]。转录组剖面在神经分化为揭示不同的多级神经衍生的分子特征。从这项研究中获得的信息可能反映了人类胚胎的大脑发育机制(14]。神经元和神经胶质的时序变化hESC-derived神经祖细胞的分化值得注意的让人联想到样品的时间观察胚胎组织。这是暗示内在程序调节神经元和神经胶质血统发展保留hESC分化。分化星形胶质细胞,一个健壮的导数hESC-derived神经祖细胞,通常表达特定astroglial标记,包括胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和S100β;然而,少突胶质细胞被认为是一种罕见的人口获得hESC-derived神经祖细胞(42]。已经证明OlLIG2-positive神经祖细胞很容易获得为其为了应对嘘和RA的治疗58]。这些OLIG2-positive祖细胞生成主要的运动神经元在神经发生;然而,OLIG2-positive祖细胞保持后神经性的时期,成为成熟的少突胶质细胞。这表明OLIG2-positive神经祖细胞能增加少突胶质细胞和突出OLIG2少突细胞发展的重要性在活的有机体内(59]。
6。神经发育障碍的方法模型人类胚胎干细胞
神经发育障碍是由于中枢神经系统的损伤在胚胎和早期产后生活。早发性的神经发育障碍引起的基因突变可能受到为。这个员工的进步胚胎植入前的基因诊断(PGD)在体外受精。胚胎通过PGD诊断先天性疾病可以捐赠的研究和培养到囊胚阶段hESC推导。到目前为止,一些神经障碍疾病机制已经接近使用diseased-specific为。
脆性X综合征(FXS)是最常见的一种认知障碍。是由FMR1基因的突变引起的,编码蛋白FMRP [60]。FMR1基因包含CGG重复5′上游的启动子区域,和这个地区健康人龋齿55重复。CGG重复可以扩大在配子形成,当它达到200重复会导致FMR1基因甲基化和基因沉默。FXS-hESCs来自PGD囊胚和显示正常人类多能干细胞的性质61年]。值得注意的,虽然FXS-hESCs包含200 - 1000 CGG重复,FMR1基因unmethylated和FMRP正常表达。蛋白FMRP的沉默是发现FXS-hESCs的分化。在FXS-hESCs异常神经分化过程中被发现,而正常控制为(62年]。神经元的缺陷来自FXS-hESCs包括神经元形态、时间的发展,和关键神经的异常表达谱系标记(62年]。在FXS-hESCs,神经祖细胞主要引起GFAP-positive胶质细胞,而控制为其成为Tuj1-positive神经元。此外,FXS-hESC神经元动作电位的频率和振幅降低,以及自发的突触活动。
亨廷顿氏病(HD)是一种遗传性神经退行性疾病居多的扩张造成的计画基因CAG重复。计画基因编码一个伴的polyglutamines名为杭丁顿蛋白(计画)。高清的特征是电动机、认知和精神异常,但确切的机制显示重复计蛋白质引起的神经元变性还不清楚。值得注意的是,由于高清的专门单基因特征,这使得潜在的使用为HD模型病理候选药物和屏幕。稳定计画突变蛋白的表达被引入健康为(63年]。神经元来自这些hESC线显示计画骨料和丰富文化的细胞死亡。这种有害的表型可以获救沉默突变体计画表达(63年]。击倒的另一个基因与高清病理学、rh等也显示恢复HD的病理变异神经元(64年]。HD-hESCs能够概括的一些主要表型发现在动物模型中,允许在一个详细的未来研究人类的上下文。
Rett综合症(RTT)是一种单基因和x染色体相关神经发育障碍。主要RTT病人受到MeCP2基因突变的影响,表现为出自闭症行为,感官缺陷,共济失调,头小畸型。MeCP2甲基CpG结合蛋白,作为全球转录抑制因子。采用基因组编辑技术引入突变MeCP2同基因的RTT-hESCs生成(65年]。MeCP2-mutant神经元表现出中央RTT的分子和细胞表型,包括形态学和生理缺陷。惊人的全球基因表达在MeCP2-mutant神经元表达下调,这反映了显著降低蛋白质合成,可以通过药物和基因操作获救65年]。此外,神经核的大小不能以正常的速度扩大在神经分化,而控制为(66年]。这是伴随着显著减少核苷酸结合以及减少脑源性神经营养因子(BDNF)水平。重新MeCP2可以恢复核大小的表型和BDNF表达水平,表明MeCP2在RTT病理学的角色和功能66年]。
Lesch-Nyhan综合征(LNS)是一种罕见的x连锁的神经紊乱。HPRT1基因的突变,编码hypoxanthine-guanine phosphoribosyl转移酶(HGPRT),是一个LNS的温床。HGPRT酶是一种重要的代嘌呤核苷酸和HGPRT不足会导致血液中尿酸的积累。精神发育迟滞是成为LNS的症状。有一个尝试使用为LNS病理模型。引入突变HGPRT野生型为通过同源重组(67年]。LNS-hESCs憎恨一些表型模仿LNS病理,尤其是尿酸积累。尽管一些下游的目标HPRT1变异进行了探讨,神经分化LNS-hESCs尚未执行。
恶性神经胶质瘤是最激进的神经肿瘤在儿童和成人。H3F3A基因的体细胞突变被发现在主要神经胶质瘤患者。H3F3A基因编码组蛋白H3.3 H3变体和结果在一个赖氨酸27-to-methionine变化(H3.3K27M) [68年];然而,在神经胶质瘤H3.3K27M突变的作用形成不完全理解。hESC线进行H3.3K27K生成和分化成神经祖细胞(69年]。神经祖细胞来源于H3.3K27M为其损失p53表达和PDGFRA失活,导致肿瘤的转换。转录组的分析揭示了一个重置了神经祖细胞发育更原始的干细胞状态。这种变化是按照主调节器的主要修改数量的组蛋白标记基因(69年]。这些为其的神经衍生品也可以用来筛选化合物,阻止肿瘤细胞增长。
唐氏综合症(DS)称21三体综合症引起的或额外的21号染色体,这是一种神经发育障碍与认知异常表现。DS经常与淀粉积累早发性老年痴呆症协会(EOAD)。这可能是由于额外的副本超过400 21号染色体上的基因定位。临界区,21 q22.1-q22.3包含基因,编码的淀粉样蛋白,这是重要的神经发育和神经发育障碍70年]。因此,大脑中的淀粉样蛋白斑块的积累会导致认知能力下降,EOAD DS患者(71年]。以前的报告显示,为抑制分化成npc积累的淀粉样蛋白-β(一个β1-42),这可以解释为nonamyloidogenic通路的要求为其进入神经血统(72年]。
自闭症谱系障碍(ASD)是另一个重要的神经发育障碍,表现差的社会互动和交流,以及重复的行为。尽管孤独症谱系障碍的具体原因还有待发现,许多风险因素已确定可能导致其发展的研究文献,包括遗传因素。删除16 p11.2地区16号染色体上是被充分研究过的ASD病因之一(73年]。最近,为其报道16日在ASD模型由基因组工程p11.2轨迹。有趣的是,转录activator-like效应核酸酶(取得),这是一个重要的工具在基因组编辑,能够定向分化和突出为合适的模型来研究自闭症谱系障碍病理(74年]。
基于上述的例子,它证明了为其存在一个合适的平台系统模型神经障碍。他们的应用程序的理解大脑疾病的分子病理可以重大基础研究和治疗的目的。
7所示。未来的视角和挑战
分化过程的概念为其关键技术发现的时间变化在活的有机体内发展已成为被广泛接受,不仅对神经系统,而且对其他细胞谱系13,75年]。几个早发性神经障碍显示疾病的成功利用为其建模。不成熟表型的神经元来自为阻碍建模的应用晚发性疾病(76年]。晚发性疾病也可以通过该系统建模progerin-induced老化(77年]。值得注意的,hESC分化系统包含一些局限性和其他系统。虽然分化为显示疾病发展的早期阶段,详细的描述在体外神经衍生品以验证是必要的在活的有机体内同行和验证阶段个体发生疾病。
除了为,诱导多能干细胞(万能)和诱导神经元(iNs)集中专注和受雇为一种疾病建模系统(78年,79年]。万能和iNs可能产生体细胞diseased-specific患者。因此,这些细胞作为小说平台功能研究特定突变(78年]。然而,应用程序则和iNs模型疾病是由几个原因限制,特别是开始重新编程细胞的表观遗传障碍。印迹基因和表观遗传异常相关的疾病,如脆性X综合征(80年),如Angelman综合征(81年),和氏综合症82年),似乎不完全重编程,无法重置他们的表观遗传记忆32),这意味着iPSC和技术需要进一步发展,以克服这些问题[83年]。
另一个挑战是发展高效协议获得特定神经衍生品。每个神经障碍通常是受到特定的神经元亚型的影响。另外,相关的神经元亚型也需要孤立使用特定神经元报告基因为了获得纯粹的人口进行进一步分析。它是指出在体外微分系统不能提供一个空间组织存在于胚胎中作为精确的特异性microdomains或利基。文化系统的进一步发展,结合组织工程技术,将提供一种改进的微环境,提高对所需的神经元细胞类型分化为其效率。hESC-derived神经的使用衍生品来探索大脑发育和疾病机制仍处于发展中阶段,当完成后,该系统将为科学家和临床医生提供一个巨大的承诺。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是支持Suranaree科技大学(SUT)研究和开发基金。