人脂肪源间充质干细胞低温保存和解冻减少α4-Integrin表达式

摘要

目的．不清楚地记录冷冻保存对脂肪组织衍生的间充质干细胞的影响，因为存在关于脂肪衍生的间充质干细胞用于再生疗法的重要性的越来越多的证据。本研究的目的是分析人脂肪组织衍生的间充质干细胞表型表达（CD34，CD45，CD73，CD90，CD105和CD49D），在冷冻保存之前和之后的菌落形成单位能力，活力和分化潜力。材料和方法．使用脂肪技术从健康供体中收集12种脂肪组织的样品。通过酶促消化进行细胞分离，然后将细胞培养至第2段。冷冻保存前后的免疫蛋白酶型，流式细胞仪，菌落形成单位能力，分化潜力进入脂肪细胞和骨质细胞，如油红色o证明的脂肪细胞和成骨细胞。和茜素红染色。结果．免疫表型标记物表达基本保留，多效性得以维持。而低温保存后，细胞数量减少α4-整合蛋白表达（CD49D），细胞活力和菌落形成单元的数量。结论．这些结果表明，低温保存后的ADMSC移植可能会影响移植细胞在宿主组织中的保留。因此，有必要进一步研究与低温保存相关的规范，以获得干细胞治疗的充分益处。

1.介绍

在利用干细胞开发新疗法的过程中，来自不同来源的间充质干细胞(MSC)显示出巨大的潜力[1，2］．虽然这些报道与MSC的治疗潜力有关，但大多数报道主要是基于造血来源，更多来自骨髓(BM)，这可以通过广泛的干细胞临床实验来解释，特别是在肿瘤血液学疾病的治疗中[3.，4］．然而，脂肪组织来源的间充质干细胞(ADMSC)是一个很有前途的候选细胞。由于ADMSC是成体干细胞，可以很容易地从脂肪组织中分离出来，通过整形手术获得细胞，这代表了一个丰富和容易获得的成体干细胞来源，具有分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞和表型类似神经元的细胞的能力[5］．由于ADMSC能够分化成几种临床感兴趣的细胞类型，它们在未来的临床治疗中具有巨大的潜力。虽然有许多报道与ADMSC的治疗潜力有关，但目前的大多数研究主要是在新鲜分离的细胞上进行的[6］．由于这种细胞类型具有临床翻译值，因此对ADSC的STEM CELL BANKING的兴趣越来越受欢迎。

由于ADMSC的固有特性:低免疫原性，较高的细胞产量，与骨髓细胞和多能性相比，这些细胞的低温保存将是一个非常方便的选择。然而，低温保存和解冻过程的效果可能会影响他们的治疗结果，因此应该进行评估。一旦细胞被培养并附着在塑料上，在细胞低温保存之前，这些细胞会受到减法分离压力，这会危及细胞膜的完整性以及细胞粘附的表面分子。低温保存的细胞在解冻后还存在损伤细胞膜等细胞功能特性的风险;这两个过程都可能影响治疗结果。

在此背景下，本研究旨在探讨ADMSC低温保存是否会损害ADMSC和其他干细胞系的细胞完整性、粘附分子的表达和/或分化潜能。

2.材料和方法

2.1。实验设计

脂肪来源的间充质干细胞从12个成年健康供体(10名女性和2名男性)的脂肪组织中获得，由整形外科医生进行抽脂手术，每位患者都有知情同意签名。采用i型胶原酶酶切分离细胞，在添加10%牛胎血清、100单位/mL青霉素和100单位/mL青霉素的DMEN/F12中培养μg / ml链霉素。在冷冻保存之前和之后，进行以下测定：通过流式细胞仪和7-AAD分析的菌落形成单位，免疫蛋白型和细胞活力以及7-AAD分析以及adipocytes和成骨细胞的分化。

２.２.隔离ADMSC

在每位患者的同意签名后，从健康供体中收集脂肪组织样品。使用吸脂技术从专用塑料诊所收集所有样品。收集样品后，使用以下方案在24小时之前培养它们：用磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma，Sig.Louis，Mo，USA）广泛洗涤50ml每种样品，含有300单位/ ml青霉素和300 μG / ml链霉素（Sigma，St.Louis，Mo，USA）（PBS / PS）。在洗涤样品和碎片后，将它们置于50ml管中，在PBS / PS中制备的0.075％的I型胶原酶（Sigma，St.Louis，Mo，USA）。将细胞均化并在37℃下搅拌30分钟。孵育后，通过添加来自Dulbecco / F12（DMEM / F12）（LGC Biotechnology，Brazil）的相同体积的鹰剂加入I型胶原酶活性，含有10％的胎牛血清（FCS）（GibcoB寿技术，Inc.，Rockville，USA，RL）确定是标准培养基（SCM）。然后，将样品以400g离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于10mL PBS / PS中;然后，将另一种离心在400g下进行10分钟。将上清液弃去，将沉淀物悬浮在5ml培养基中。将细胞悬浮液过滤在100℃的细胞过滤器中 μ贝克顿·迪金森，美国)。细胞计数采用血球计，使用台盼蓝(Sigma, St. Louis, MO, USA)(稀释倍数为1:1,10μ添加细胞悬浮液10 μ台盼蓝的L)。之后是1 × 10⁵细胞为厘米²在25厘米²和75厘米²收集培养瓶并在37°C和5% CO下培养₂［7- - - - - -9］．

２.３.培养和扩大

72小时后，在培养后，从烧瓶中吸出培养基，用预热的PBS / PS洗涤细胞;然后，在25cm中加入7ml培养基²75厘米处12毫升²烧瓶。细胞在37°C和5% CO下培养₂．培养液每周更换两次，直到细胞达到80%至90%的汇合。达到理想的融合后，用预热的PBS/PS短暂清洗细胞，并加入胰蛋白酶/EDTA (0,25%) (Sigma, St. Louis, MO, USA)，用于分离贴壁细胞。细胞在37°C孵育10分钟。然后，加入相同体积的SCM来中和胰蛋白酶的作用。将细胞悬液转移到无菌离心管中，400g离心10分钟。丢弃上清，将细胞重悬在约5ml的SCM中。使用台盼蓝(1:1稀释)血球计实现细胞计数[9］．计数后，在75厘米内再次收集细胞²浓度为1 × 10的烧瓶^3.细胞/厘米²并在37°C和5% CO下孵育₂直到它们达到80%的汇合点。当它们达到所需的汇合点时，细胞被胰酶化，可以进行分析。对于每个样本，在第2代(P2)进行培养。

２.４.低温贮藏过程

如前所述在P2细胞的胰蛋白酶化之后，并通过台盼蓝排除方法确认其活力，将细胞的一部分提交给冷冻保存程序。用血细胞计数计（约1×10，细胞计数细胞⁶细胞/毫升)。冷冻保护剂培养基含有80%的BFS, 10%的二甲基亚砜(DMSO)， (Sigma, St. Louis, MO, USA)， 10%的DMEM-F12 (LGC Biotechnology，巴西)，100单位/mL的青霉素和100μg/mL链霉素(Sigma，圣路易斯，美国MO)。1毫升等价物(含1 × 10⁶细胞)转移到预先鉴定的低温试管中(细胞类型、密度和日期)。试管在可编程的冷冻设备中冷却(Nicool LM10;法国液化空气公司，Marne La Vallée)。低温贮藏设备在室温下启动，第一阶段(程序3-15分钟)结束时温度达到−30°C;步骤2 (Program 5-45 minutes)结束时，温度为−60°C;最后阶段第三步(节目9-10分钟)，温度为−110°C。步骤3后，将细胞转移到液氮中，置于−196°C。这种方法阻止了晶体在细胞内的形成，因为冷冻过程发生得很慢[9- - - - - -11］．不久之后，将管转移到液氮中，在那里它们保持储存约20天。将所有样品一式三份冷冻保存。

2.5。解冻诉讼

20天后，低温保存的细胞在37℃解冻，转移到5 mL SCM中，轻轻均质。将细胞悬液转移到无菌离心管中，400g离心10分钟。丢弃上清，将细胞重悬在约5ml的培养基中。对细胞进行分析。

2.6。菌落形成单位（CFU）分析

冷冻前后每厘米10个细胞²三次播种;井中9厘米²SCM则根据培养的其他步骤更换培养基。14天后，取出培养基，用甲醇固定细胞5分钟，然后用0.5%结晶紫在甲醇中染色5分钟以上。用PBS/PS洗涤烧瓶两次并烘干。计数大于2 mm的菌落数量，100个种子细胞(计数菌落/接种细胞)× 100 [12］．

2.7。Immunophenotypic分析

分析所有样品以表达表面标记物（表1)，采用抗聚类分化抗原(CD)的单克隆抗体，与荧光染料偶联，在冷冻保存前和解冻后用流式细胞仪分析。用表中所述的抗体孵育细胞(数量)1并使用了相应的同型。一抗在黑暗中孵育10分钟。针对CD105的抗体是一种纯化的抗体，它没有与荧光结合;因此，需要在暗室中与二抗孵育15分钟以上，并重新进行细胞清洗。进一步的5μ加L 7-AAD于暗室孵育15分钟。400年之后,μ加入L结合缓冲液，通过流式细胞仪分析样品（FACS Calibur; Becton Dickinson，San Diicgo，USA）[11，13，14］．在每次测试之前，根据制造商的说明，使用BD Calibrite (Becton Dickinson, San Diego, USA)对设备进行校准。所有抗体都是按照制造商的说明使用的。捕获20.000个事件(单元);各标记物百分比值通过Cyflogic version 1.2.1软件进行分析。

2.8。用膜联蛋白V和7-AAD分析细胞活力

用胰蛋白酶(0.25%)分离贴壁细胞，400 g离心3分钟，2ml PBS重悬。之后，在5毫升试管中，100毫升μ这个溶液的L被加入。400年之后,μ在每个管中加入L PB;它们均质化并离心。上清液被丢弃，100 μ加入binding buffer的L。后来,5μ添加了annexin v，5 μ加入L 7-AAD，暗室孵育15分钟。孵化后,400μ加入结合缓冲液L并均质;流式细胞仪(FACS Calibur;Becton Dickinson，美国)[11］．

2.9。脂肪生成分化

用含10%胎牛血清的dmemf12培养基、0.5 mm异丁基甲基黄嘌呤(Sigma, St. Louis, MO, USA)、1 mmol/L地塞米松(Sigma, St. Louis, MO, USA)、10 mg/mL胰岛素和50 mg/mL成脂培养基处理细胞μM Indomethacin（Sigma，St.Louis，Mo，USA），并在37℃和5％CO孵育₂．对照组细胞用SCM处理。媒体每周改变两次。14天后，将细胞固定并用油红色污渍（Sigma，St.Louis，Mo，USA）染色，以证明细胞中的脂肪液滴[7，8］．

2.10。成骨分化

通过将细胞保持在DMEM-F12培养基中用100个单位/ mL青霉素，100μl μg/mL链霉素，1 nM地塞米松，2 mMβ-甘油磷酸(Sigma，美国)和50μm抗坏血酸-2-磷酸（Sigma，USA），并在37℃和5％CO温育₂．对照组细胞用SCM处理。细胞在此条件下保存35天，每周更换2次培养基。实验细胞和对照细胞均采用2.5%戊二醛固定90分钟，茜素红染色(Sigma, St. Louis, MO, USA)显示矿化[7，8］．

2.11。统计分析

本研究中获得的结果表示为平均值±标准偏差（SD）。为了比较冷冻保存前后的分子表达分析，以及执行;被认为是显著的。数据用Excel表格组织，并使用Statistica 9.0版软件进行分析。

结果

3.1。ADMSC的表型分析

流式细胞术分析显示了CD73，CD90和CD105表达的ASMSC的典型间充质表型，而这些细胞缺乏CD34和CD45的表达。有趣的是，在解冻冷冻保存ADMSC后，我们观察到CD49D表达的显着减少（表2；数据1和2）.

３．２．膜联蛋白v7 - aad染色

低温保存前后CD49d表达的差异使我们观察了低温保存前后的细胞活力。Annexin v7 - aad染色检测细胞活力;存活率从91.34%±4.54%显著降低至74.99%±14.19% ()，平均损失17.9%的活细胞。Annexin V(凋亡)标记值与细胞活力值非常接近，冷冻前为91.39%±5.5%，解冻后为76.31%±13.33% (） （桌子3.；数字3.）.因此，表明，大多数附睾v染色细胞也用7-AAD染色，这意味着仅在细胞凋亡中的细胞量是小的比例。

３．3.集落形成实验

进一步，我们观察了ADMSC的菌落形成能力，发现菌落形成能力显著下降;冷冻保存前后cfu分别为28.08%±7.06%和21.51%±6.61% (）.

3．4．ADMSC的成脂潜力

在用谱系特异性诱导培养基进行冷冻保存后评估它，细胞分化为脂肪发生，如油红色所证明，而对照细胞没有占用油红染色（图4）.

3.5。ADSC的骨质骨质潜力

此外，经过谱系特异性的诱导培养基处理后，细胞分化为成骨细胞，这在茜素红中得到了证实，而对照细胞没有出现茜素红染色(图)5）.

4.讨论

ADMSC是具有巨大治疗潜力和细胞代谢研究的重要工具的细胞。因此，在解冻冷冻保存后，冷冻保存细胞的表征及其维持是相关的。

关于CFU分析，我们观察到菌落形成能力显著下降;冷冻保存前后cfu分别为28.08%±7.06%和21.51%±6.61% (）， 分别。这些结果与Goh及其同事（2007）发现的结果一致，即冷冻保存导致ADSC的粘附效率降低[15］．这种差异可能与整合素表达减少有关α4 (CD49d)。Mitchell等人(2006)报道，即使在超低温保存后，ADMSC形成菌落的能力也比bmmsc大得多。该小组还报告说，传代越多，cfu的数量就越多，并建议传代选择一种特定的细胞类型，可能是干细胞[16］．在冷冻保存之前和之后保持相同的参数，并且确实可以是细胞生长的延迟，考虑到细胞再次适应培养条件和菌落的有限尺寸。关于细胞疗法，通道的数量的增加可能会损害安全性，这就是为什么它可能与增加突变相关并增加细胞的转化[17］．另一方面，关于分化过程，大多数与ADMSC的群体一起报告，在14天的脂肪发生诱导后，所有细胞样品都具有与脂肪细胞一致的形态，通过用油红色染色脂质确认作为PCR，鉴定与脂肪细胞一致的基因，并且不存在于未分化的细胞中。Rodriguez和同事（2004）报道，在此期间约90％的细胞积累细胞内脂质，并且在未处理的细胞中可能没有显着的积累[18］．所有样品，在融化前和融化后，诱导成脂分化培养基油红染色阳性，显示细胞内存在脂质(图)4(一)）.在对照培养基中加入标准培养基，没有脂质的痕迹，说明这些细胞未分化为脂肪细胞(图)4 (b)）.这些结果清楚地表明，ADMSC具有适当的诱导成脂分化能力。为了识别成骨分化，一些研究小组报道，在诱导后14至21天，我们可以通过茜素红染色的磷酸钙观察矿化基质的存在[16，19］．在目前的工作中，在诱导培养基中只观察到30天后。所有样品，在融化前和融化后，诱导到茜素红阳性的成骨分化培养基(图5（a））.在对照培养基中加入标准培养基，未见矿化迹象，说明这些细胞未分化为成骨分化(图)5（b））.成脂分化和成骨分化结果均表明细胞为干细胞。其他研究人员报道了解冻后脂肪细胞和骨细胞中ADMSC分化能力的维持[19- - - - - -21］．在这项研究中，100％的样品具有相同的诱导时间。

MSC的标记物存在一些争议。这是因为不同类型的标记有不同的设计;然而，人们一致认为MSC对CD45 (HSC的一种标志物)呈阴性[22］．在本研究中，所有样本的CD45均为阴性，提示MSC可能较大。在本研究中，4个样本显示少量CD34阳性细胞(1 - 3%)。

在本研究中，我们发现CD49d的值各不相同(），符合Katz及其同事（2005）（)[23］．也许，如果这些细胞再次进行培养，就有可能恢复CD49d的表达。在本工作中，由于细胞数量较少，无法在低温保存后培养细胞。然而，考虑到移植到人类，在细胞治疗中最有可能的假设是在解冻后立即移植细胞。因此，正如已经在文献中描述的，增加传代的数量也增加了细胞转化的可能性，如畸胎瘤，这使得不可行的治疗[18］．除表达值不同外，该表面标记在低温保存的细胞解冻后显著降低(，）.这个标记表示α4-整合素，一种粘附分子，与β1形成异源二聚体，晚期激活抗原-4 (VLA-4)的整合素[13］．雷和同事（2007年）发现了CD49D的低阳性值（平均为12.6％），但ADMSC的隔离方式通过皮下组织而不是通过脂肪痉挛;另一个问题是他们使用低葡萄糖的DMEM;这些差异协议可以选择具有相似特征的不同类型的单元格，但不相同[24］．Katz和同事(2005)认为，组间CD49d表达的一些差异反映了这些细胞对细胞外培养基的无数变化的调整，如密度、细胞周期、培养时间和传代数量[23］．环境为干细胞产生适当的乳头物，并调节对特定细胞系的这些核性的维持。对于该调节，干细胞在细胞外基质中的粘附性是至关重要的，因为它允许细胞和基质之间的通信，是维持组织的先决条件[25］．因此，低温保存后CD49d表达的变化可能是这些细胞移植的主要问题，导致它们不能与受损组织正常通信。

在本研究中，只分析活的和完整的细胞。Gonda et al.(2008)认为低温保存会对细胞蛋白造成结构和功能损伤，降低其活力，但几乎不可能发生免疫表型交换[19］．表达变化真的不会有借口，但表达的损失是非常相关的，因为该组本身提到冷冻保存可能导致膜蛋白损伤，这是CD49D的情况，这代表粘附蛋白。少数研究与解冻冷冻保存细胞后的免疫蛋白差异有关，这是应该研究的一个非常重要的特征[19，26］．用活力试剂盒(BD) Annexin V PE_7-AAD对20000个事件进行染色，分析低温保存前和解冻后的细胞活力。细胞凋亡以磷脂酰丝氨酸为特征，磷脂酰丝氨酸是细胞膜内小叶的组成部分。当细胞进入凋亡过程时，磷脂酰丝氨酸暴露在细胞膜外壁，但细胞膜完好无损。Annexin V阳性的细胞代表磷脂酰丝氨酸易位的细胞[27］．解冻后，细胞完整性显著下降，比低温保存前降低了16.5%(图)5）.也许细胞的完整性也会随着解冻而丧失?另一细胞系7-AAD阳性，表明膜完整性受损;因此，出现了细胞死亡。因此，这些标记物被用来区分死亡细胞和处于凋亡过程中的细胞。使用Cyflogic 1.2.1软件对这些标记进行分析，该软件提供了同型对照的荧光覆盖直方图，并量化了阳性(不重叠同型对照)和阴性(重叠同型对照)标记的百分比。因此，有可能分析三个变量:(i) 100%活细胞(Annexin V-PE阴性，7-AAD阴性);(ii)死亡细胞(Annexin V-PE阳性，7-AAD阳性);(iii)细胞凋亡过程(Annexin V-PE阳性，7-AAD阴性)。根据这些参数，冷冻前存活率为91.34%±4.54%。 After thawing, the cells had a significant drop in cell viability, 74.99%  ±  14.19% ()，平均损失17.9%的活细胞。Annexin V(凋亡)标记值与细胞活力值非常接近，冷冻前为91.39%±5.5%，解冻后为76.3%±13.33% (） （桌子3.）.本研究表明，大部分Annexin V染色的细胞也被7-AAD染色，这意味着只有凋亡的细胞数量较少。

低温保存细胞在解冻后的ADMSC活力可以用每个低温管中细胞的浓度来解释。Goh等人(2007)测试了四种细胞浓度:2.5 × 10⁵，5×10⁵， 1 × 10⁶和2×10⁶活性分别为71.4%、81.10%、77.9%和69.2%。在本研究中，低温保存细胞在1 × 10⁶每ML的细胞和可生存率发现类似于由Goh Group（2007）的值的值;但是，Goh等人使用的方法。（2007）通过台盼蓝染色，更相对于手动计数;本研究中使用的方法更准确，流式细胞术分析[15］．Thirumala和他的同事(2010)发现，在他们的研究中，使用相同的冷冻保护剂时，存活率保持在84%±8%，但测试是在P1 [27］．De Rose及其同事（2009）发现了细胞活力的惊人值92.5％。这种高可活力率可能与解冻这些细胞的形式有关，这些细胞在完全解冻之前将其转移到培养基中，以10％FCS转移到培养基;可以通过以下事实解释：细胞在室温下与DMSO接触的时间较少，以其细胞毒性作用已知的[10］．研究人员发现，当细胞被冷冻时，许多因素会影响细胞内的动态，从而影响这些细胞的生存能力。在这些因素中，可以强调的是细胞内冰的形成，它可以穿透细胞膜，细胞的高浓度可以限制空间，阻止细胞在冻结期间生长[15］．一种标准方案用于各种细胞类型，但有些细胞有特定的特性，可能需要特别护理。因此，开发一种针对ADMSC的具体协议，以提高其存活率等特性将是理想的[11，19，28］．

一些作者采用−80°C而不是液氮(−196°C)冷藏的长期储存方法，但该方法显示出较低的生存能力，同时保留了功能特征。其他变量也会影响生存能力，比如冷冻速度，因为如果冷冻速度更快，细胞内形成冰的可能性就会更大，从而造成细胞膜损伤[19，26]以及选择血清自由介质，可能无法受益于大的细胞活力。但是，考虑到治疗应用，即使是这种情况，也可以通过降低污染的风险来表明低生存率[26］．

5.结论

在该研究中，人脂肪衍生的间充质干细胞冷冻保存和解冻课程的标准方案展示了下降：α4-整合素表达(CD49d)、细胞活力和解冻后菌落形成单位。这些发现可能会损害细胞在宿主组织的细胞外基质中的整合。进一步完善和保证细胞移植的方案。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

承认

感谢高等教育人才培养协调组织(CAPES)给予的财政支持。

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