SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/2562718 2562718 研究文章 人类脂肪间充质干细胞冷冻和解冻降低 α4-Integrin表达式 Irioda 安娜卡 1、2 Cassilha 拉斐尔 3 Zocche 拉里萨 1 旧金山 塞萨尔 1 达 里卡多·科雷亚 1 费雷拉 巴西伊莱亚斯 1 Guarita-Souza 路易斯塞萨尔 4 费雷拉 Reginaldo Justino 1 Mogharbel Bassam菲利普 1 Garikipati Venkata娜迦Srikanth 5 Souza Daiany 1 Beltrame Mirian Perlingeiro 6 德·卡瓦略 凯瑟琳Athayde特谢拉 1、2 美津浓 Hiroshi 1 细胞疗法在再生医学和生物技术研究机构 贝利Pequeno普林西比研究所 加拉卡斯席尔瓦Jardim 1632 80250 - 200库里提巴 公关 巴西 pequenoprincipe.org.br 2 生物过程工程和生物技术部门 巴拉那河联邦大学的 加拉卡斯科罗内尔合金210年旧金山Heraclito多斯桑托斯 81531 - 970库里提巴 公关 巴西 ufpr.br 3 医院健康库里提巴 整形外科诊所 Rua十五de Novembro 2913 80045 - 340库里提巴 公关 巴西 hospitalsante.com.br 4 实验室的生物和健康科学研究所的主教天主教大学的巴拉那河(PUCPR) Rua Imaculada康西卡奥1155 80215 - 901库里提巴 公关 巴西 pucpr.br 5 转化医学中心 天普大学医学院 费城 PA 19140 美国 temple.edu 6 流仪分析实验室 联邦大学临床医院的巴拉那河 Rua Padre Camargo 280 Alto达格洛丽亚 80060 - 240库里提巴 公关 巴西 ufpr.br 2016年 15 2 2016年 2016年 16 10 2015年 05年 12 2015年 15 12 2015年 2016年 版权©2016年安娜卡Irioda et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

目的。低温贮藏的影响脂肪tissue-derived间充质干细胞是不清楚的记录,有越来越多的证据的重要性脂肪间充质干细胞再生疗法。本研究的目的是分析人类脂肪tissue-derived间充质干细胞表型表达(CD34、CD45 CD73, CD90、CD105,和CD49d),集落形成单位的能力,生存能力,低温贮藏前后和分化的潜力。 材料和方法。12个样品的脂肪组织收集使用吸脂技术从健康捐献者。细胞隔离是由酶消化的细胞培养通道2。低温贮藏前后immunophenotype,细胞流式细胞分析仪的可行性分析,集落形成单位的能力,潜在分化成脂肪细胞,成骨细胞,油红O和茜素红染色,分别。 结果。immunophenotypic标记表达式在很大程度上保存,multipotency维护。然而,低温贮藏后,细胞减少 α4-integrin表达式(CD49d),细胞生存能力,和集落形成单位的数量。 结论。这些发现表明,ADMSC移植后低温贮藏可能妥协的保留移植细胞在宿主组织。因此,进一步的研究是必要的标准化协议相关的低温贮藏达到完整的干细胞疗法的好处。

 1。介绍

发展的新疗法使用干细胞,间充质干细胞(MSC)来自不同起源有表现出巨大的潜力 1, 2]。虽然报告与MSC的治疗潜力,其中大部分都是造血的起源,主要表现在从骨髓(BM)所解释的广泛用干细胞临床实验,特别是在治疗oncohematological疾病( 3, 4]。然而,脂肪tissue-derived间充质干细胞(ADMSC)成为一种很有前途的候选人。ADMSC是成体干细胞分离容易从脂肪组织,细胞通过整形手术,代表了一个足够的和可访问来源的成体干细胞向脂肪细胞分化的能力,骨细胞、软骨细胞和细胞表型相似的神经元( 5]。由于ADMSC能够分化成多种细胞类型的临床利益,他们对未来有着巨大的潜力治疗诊所中使用这些细胞。尽管许多相关报道的治疗潜力ADMSC,大多数目前进行的调查主要集中在新鲜分离细胞( 6]。翻译这个细胞类型有临床价值,有干细胞银行ADMSC越来越感兴趣。

由于固有的特点ADMSC:免疫原性低,细胞产量高,骨髓细胞和多能性相比,这些细胞的冷冻保存将会是一个很方便的选择。然而,低温贮藏的影响和解冻程序可能会影响他们的治疗结果,因此应该评估。一旦细胞培养和附着在塑料、细胞冷冻保存之前,这些都是受到减去废除压力,能够把风险细胞膜的完整性和其表面的细胞粘附分子。解冻后,冻存细胞也受伤的风险膜和其他细胞功能特性;两个程序都可以影响治疗结果。

在这种背景下,本研究旨在解决是否ADMSC低温贮藏可以妥协细胞完整性、粘附分子的表达和/或ADMSC和其他干细胞的分化潜能血统。

 2。材料和方法 2.1。实验设计

脂肪间充质干细胞来源于脂肪组织12成人健康的捐赠者(10女2男)抽脂整形外科医生执行的每个病人的知情同意签字。细胞隔离是由酶和胶原酶消化类型。然后,这些细胞被培养在DMEN / F12补充10%的小腿胎儿血清,青霉素100单位/毫升,100 μ链霉素的g / mL。低温贮藏前后进行了以下分析:集落形成单位,immunophenotype,和细胞生存能力与膜联蛋白V和7-AAD流式细胞分析仪的分析以及ADMSC分化脂肪细胞和成骨细胞。

 2.2。隔离ADMSC

从健康捐献者的脂肪组织样本收集从每个病人同意后签名。所有的样本都来自专业整形诊所,使用吸脂技术。收集的样本后,他们培养的24小时之前,使用以下协议:50毫升每个样本的广泛用磷酸缓冲盐(PBS)(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)含300单位/毫升的青霉素和300年 μ克/毫升的链霉素(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)(PBS / PS)。洗后样品和残骸清除,这些被放置在50毫升管有0.075%的I型胶原酶(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),准备在PBS / PS。这些细胞被均质和孵化搅拌30分钟的37°C。孵化后,I型胶原酶活动停止通过添加同样体积的鹰修改从杜尔贝科/ F12 (DMEM / F12) (LGC生物技术、巴西),包含10%的胎牛血清(FCS) (GIBCO B生命技术公司,罗克维尔市,美国RL)作为确定为标准培养基(SCM)。然后,样本在400 g离心10分钟。上层清液被丢弃的颗粒在10毫升resuspended PBS / PS;然后,另一个离心是在400克10分钟。浮在表面的丢弃,颗粒悬浮在5毫升的培养基。细胞悬液是在100年细胞过滤器过滤 μ,正欲米(美国)。细胞计数是由血细胞计数器和利用台盼蓝(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)(1稀释的:1、10 μL细胞悬液的添加10 μ台盼蓝的L)。在那之后,1×105细胞为厘米2在25厘米2和75厘米2培养瓶收获和孵化在37°C和5%的公司2( 7- - - - - - 9]。

 2.3。培养和扩大

培养72小时后,媒介是吸气的烧瓶和细胞被洗预热PBS / PS;然后,7毫升的培养基添加25厘米2和12毫升75厘米2烧瓶。细胞保持37°C和5%孵化有限公司2。媒介改变了每周两次,直到细胞达到80%至90%的融合。达成理想的融合后,细胞被暂时用预热PBS / PS和补充胰蛋白酶/ EDTA(0 25%)(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)的解集贴壁细胞。这些细胞被孵化10分钟37°C。然后,同样体积的增加了SCM的中和胰蛋白酶行动。细胞悬液转移到无菌离心管,离心10分钟400克。浮在表面的丢弃,这些细胞被resuspended大约5毫升的SCM。细胞计数是实现血细胞计数器室,用台盼蓝(1:1稀释) 9]。细胞计数后,再次收获75厘米2烧瓶内的浓度1×103细胞/厘米2和孵化37°C和5%的公司2直到他们到达80%的融合。当他们到达理想的融合,使胰蛋白酶化和细胞被用于分析。对于每一个样本,文化是在通道2 (P2)。

 2.4。低温贮藏过程

在P2胰蛋白酶化后细胞如前所述,台盼蓝排斥法证实其可行性,细胞被提交给低温贮藏的一小部分程序。细胞数与血细胞计数器(约1×106细胞/毫升)。BFS的冷冻保护剂中有80%,10%的二甲亚砜(DMSO),(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),10%的DMEM-F12 (LGC生物技术、巴西)和青霉素100单位/毫升和100年 μ克/毫升的链霉素(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。1毫升整除(包含1×106细胞)被转移到preidentified低温管(细胞类型、密度和日期)。管在一个可编程的冷却冷冻设备(Nicool LM10;法国液化空气集团,马恩拉法兰)。在室温和低温贮藏设备开始的结束第一阶段(计划3 - 15分钟)规模达到温度−30°C;最后的步骤2(程序5-45分钟),温度是−60°C;最后,在最后阶段,第三步(计划9至10分钟),温度是−110°C。步骤3后,细胞都被转移到液氮−196°C。这种方法可以防止细胞内的晶体形成,因为冻结发生缓慢 9- - - - - - 11]。不久之后,管都被转移到液氮的保持了大约20天。所有的样品都冻存一式三份。

 2.5。解冻程序

20天后,冻存细胞解冻在37°C和转移在5毫升的SCM,轻轻均质。细胞悬液的无菌离心管和离心机转移400克10分钟。浮在表面的丢弃,这些细胞被resuspended大约5毫升的培养基。这些细胞被提交分析。

 2.6。集落形成单位(CFU)分析

低温贮藏,前后10细胞/厘米2被播种,一式三份;9厘米的井2SCM,改变了媒介文化的其他措施。14天之后,中摘除和甲醇的细胞被固定5分钟然后用0.5%的甲醇结晶紫染色5分钟。烧瓶与PBS / PS和干清洗两次。殖民地的数量超过2毫米数,结果代表前殖民地的数量到100年种子细胞(统计菌落/接种细胞)×100 12]。

 2.7。Immunophenotypic分析

所有样本分析表面标记(表的表达 1),使用单克隆抗体群分化(CD)抗原,共轭荧光染料和分析,在低温贮藏和解冻后,通过流式细胞分析仪。细胞(数量)抗体孵育描述表 1和相应的同形像。主要的抗体是在黑暗中孵化10分钟。针对CD105抗体纯化抗体,它不是与荧光共轭;由于这个原因,有必要用二次孵化抗体更多15分钟在黑暗的房间里和重做细胞清洗步骤。进一步的5 μL 7-AAD补充道,在黑暗的房间里孵化15分钟。400年之后, μ绑定缓冲添加L和样本分析流式细胞分析仪(流式细胞仪石中剑;美国圣地亚哥,正欲)[ 11, 13, 14]。在每个测试之前,设备校准使用BD Calibrite(美国圣地亚哥,正欲),根据制造商的指示。所有抗体都是按照制造商的指示使用。20.000事件(细胞)被抓获;每一个标记的百分比值通过具体分析软件进行了分析:这次1.2.1 Cyflogic版本。

单克隆抗体用于这个研究小组immunophenotypic表征。

标记 克隆 反应性 荧光染料 函数
CD34 581 / CD34 人类 FITC 干细胞标记(前体),还发现在造血祖细胞,血管内皮细胞和成纤维细胞相同的组织。也许,这是一个转导签名者,内皮特异性抗原粘连的作用。
CD45(白细胞共同抗原) HI30 人类 体育 白细胞标记。CD45蛋白质位于所有的造血细胞,而不是红细胞。
CD49d(整合素 α4) 9 f10 人类 体育 跨膜糖蛋白,整合素 α4所示。这让一些信息交互和cell-matrix和参与细胞粘附。
CD73 (ecto-5′核苷酸酶) AD2 人类 体育 一直认为这个标志可以调解costimulator信号在T细胞激活和内皮刺激脱磷酸腺苷一磷酸腺苷。
CD90 (THy-1) 5 e10汽油 人类 FITC 在信息交互的角色,cell-matrix一直猜测,神经突与相关的增长,神经再生,细胞凋亡,中期,炎症和纤维化。
CD105 (endoglin) 266年 人类 纯化 响应调制器的TGF - β细胞复杂。

2.8。细胞生存能力与膜联蛋白V和7-AAD分析

贴壁细胞的分离与胰蛋白酶(0.25%),在400 g离心3分钟,resuspended PBS的2毫升。之后,100年5毫升管 μ我增加了这个解决方案的。400年之后, μL (PBS添加在每个管;他们均质和离心机。浮在表面的丢弃,100 μL绑定缓冲的补充道。后来,5 μL膜联蛋白V增加了5 μL (7-AAD添加和管在黑暗的房间里孵化15分钟。孵化后,400 μL添加绑定缓冲和均质;收集的数据流式细胞分析仪(流式细胞仪石中剑;美国,正欲)[ 11]。

 2.9。脂肪形成的分化

DMEM-F12组成的细胞治疗与脂肪形成的介质中含有10%的边后卫,0.5 m isobutylmethylxanthine(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),1更易与L地塞米松(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),10毫克/毫升胰岛素,50 μ吲哚美辛(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),37°C和5%孵化有限公司2。用单片机控制细胞治疗。媒介改变了两次一个星期。14天之后,这些细胞被固定和沾油红染色(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)来演示细胞中的脂肪滴( 7, 8]。

 2.10。成骨分化

细胞的成骨诱导了保持DMEM-F12介质与青霉素100单位/毫升,100 μ克/毫升的链霉素,1海里的地塞米松,2毫米 β美国甘油磷酸酯(σ),50 μ美国ascorbate-2-phosphate M(σ)和37°C和5%孵化有限公司2。用单片机控制细胞治疗。35天的细胞被保存在这些条件和介质改变每周两次。实验和控制细胞被固定在2.5%戊二醛九十分钟,染色茜素红染色(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)来演示矿化( 7, 8]。

 2.11。统计分析

在这项研究中获得的结果表示为平均值±标准偏差(SD)。分子表达之间的比较分析低温贮藏前后 t 以及执行; p < 0.05 被认为是显著的。数据组织与Statistica Excel电子表格和分析了9.0版本的软件。

 3所示。结果 3.1。ADMSC表型分析

流仪分析显示一个典型的间质表型ADMSC CD73表达式,CD90、CD105而这些细胞缺乏表达CD34、CD45。有趣的是,我们观察到显著减少CD49d解冻后低温贮藏ADMSC(表表达式 2;数据 1和 2)。

在低温贮藏和解冻后表面标记表达式。

分子标记 CD34− CD34 + CD45− CD49d + CD73 + CD90 + CD105 +
低温贮藏 之前 后 之前 后 之前 后 之前 后 之前 后 之前 后 之前 后
媒介 98.88 99.3 1.12 0.78 99.79 99.8 88.67 77.8 99.57 99.5 99.55 99.5 99.4 98.3
马克斯 99.86 One hundred. 3.32 2.1 One hundred. One hundred. 96.38 93.1 99.94 99.9 99.97 One hundred. 99.91 99.9
最小值 96.98 97.9 0.14 0.03 99.27 99.6 80.15 41.6 98.51 98.5 98.15 97.5 97.87 93.9
SD 1.08 0.61 1.08 0.6 0.22 0.14 6.55 14.5 0.43 0.43 0.07 0.7 0.64 2.07
p 价值 0.113 0.158 0.791 0.007 ∗ 0.528 0.618 0.05

∗ p < 0.05 。

表面标记细胞在低温贮藏和解冻后的表情。这次1.2.1 Cyflogic所做的分析软件。的 t 以及完成; p < 0.05 被认为是显著的。结果是 p ∗ ∗ = 0001年 。

低温贮藏前后ADMSC标记的直方图。灰色的颜色代表特定的标记和白色的颜色代表一个同形像控制。

 3.2。膜联蛋白V 7-AAD染色

CD49d表达式低温贮藏前后的差异让我们看看低温贮藏前后细胞生存能力。膜联蛋白V 7-AAD染色细胞生存能力评估;我们观察到显著减少可行性从91.34%±4.54%到74.99%±14.19% ( p = 0.001 低温贮藏后),平均损失17.9%可行的细胞。关于与膜联蛋白V(凋亡),标签值非常接近的值细胞生存能力,低温贮藏前91.39%±5.5%和76.31%±13.33%解冻后( p = 0.003 )(表 3;图 3)。因此,这表明,大多数膜联蛋白V也沾染了7-AAD染色细胞,这意味着只在细胞凋亡细胞的数量是一个小的比例。

表示细胞解冻后在低温贮藏和可行性和完整性。

膜联蛋白V 7-AAD
之前 后 之前 后
媒体 91.39 76.31 91.34 74.99
马克斯 96.2 95.83 79.29 49.21
最小值 75.18 52.38 95.17 95.27
DP 5.85 13.33 4.54 14.19
p 价值 0.003 0.001

直方图的膜联蛋白V(凋亡标记)和7-AAD(可行性标记)之前和之后的细胞冷冻保存。灰色的颜色代表特定的标记和白色的颜色代表一个同形像控制。

 3.3。集落形成实验

此外,我们看着ADMSC的集落形成能力,观察到明显降低在殖民地形成能力;低温贮藏前后cfu 28.08%±7.06%和21.51%±6.61% ( p < 0.01 )。

 3.4。脂肪形成的潜在的ADMSC

评估,与lineage-specific感应介质低温贮藏后,细胞分化成脂肪形成的石油红色就是明证,而控制细胞没有油红染色(图 4)。

脂肪细胞分化后14天在感应介质:样本解冻后冻存细胞,相衬显微镜,250 x。(一)存在的脂肪滴(沾油红色)与脂肪形成的感应ADMSC栽培介质。(b)控制没有脂肪滴,指示和标准中未分化的细胞培养。规模(10 μ米)。

 3.5。成骨的ADMSC的潜力

此外,在治疗lineage-specific感应介质,细胞分化成成骨的就是明证茜素红,而控制细胞不占用茜素红染色(图 5)。

成骨细胞分化后35天成骨诱导培养基:样本解冻后冻存细胞,250 x上升。(一)ADMSC与茜素红染色,展示在细胞外基质钙的存在。(b)控制没有矩阵演示,表明与标准培养基培养的未分化细胞。规模(10 μ米)。

 4所示。讨论

ADMSC细胞有一个巨大的治疗潜力和细胞代谢研究的重要工具。因此,冻存细胞的特性及其相关解冻冻存后维护。

关于CFU分析,我们观察到明显降低在殖民地形成能力;低温贮藏前后cfu 28.08%±7.06%和21.51%±6.61% ( p = 0.01 ),分别。这些结果与结果发现吴和他的同事们(2007),低温贮藏导致粘附ADMSC效率(减少 15]。这种差异可能与整合素的表达下降 α4 (CD49d),我们观察到。米切尔et al。(2006)报道,形成殖民地ADMSC的能力远远大于BMSC,即使在低温贮藏。这个组织还报道,段落,菌落的数量越大,表明通道选择一个特定的细胞类型,可能是干细胞( 16]。相同的参数保持低温贮藏前后,然而,确实可以推迟细胞生长,又考虑到细胞适应培养条件和殖民地的规模有限。关于细胞治疗,通道的数量的增加可以妥协的安全,这就是为什么它可能与增加突变和增加细胞的转化 17]。另一方面,分化的过程中,大多数的组织学习与ADMSC报告,经过14天的脂肪形成的感应,所有样品的细胞与脂肪细胞形态一致,证实了染色的脂质油红以及PCR鉴定基因与脂肪细胞一致,不存在于未分化的细胞。罗德里格斯和同事(2004)报道,在这一时期大约90%的细胞胞内脂质积累,也可能没有明显的积累在未经处理的细胞 18]。解冻之前和之后的所有样品,与脂肪形成的诱导分化培养基油红呈阳性,显示存在细胞内的脂质(图 4(一))。在控制中,标准培养基添加脂质,没有痕迹,表明这些细胞未分化成脂肪细胞(图 4 (b))。这些结果清楚地表明,ADMSC后适当的诱导脂肪形成的分化能力。鉴别成骨分化,一些组织报道,14至21天感应后,我们可以观察到的矿化矩阵,由磷酸钙与茜素红染色 16, 19]。在目前的工作,这是观察到的只有30天后感应介质。所有的样品,之前和之后解冻,诱导的成骨分化中茜素红染色阳性(图 5(一个))。在控制中,标准培养基补充说,没有证据表明成矿,表明这些细胞未分化成成骨分化(图 5 (b))。脂肪形成的和成骨分化的结果表明,细胞是干细胞。其他研究人员报道的维护能力分化ADMSC脂肪细胞和骨细胞解冻后( 19- - - - - - 21]。在这项研究中,100%的样品有相同的诱导时间。

有一些争论MSC的标记。这是因为不同设计的不同类型的标记;然而,有一个共识,MSC - CD45 (HSC)的一个标志 22]。在这项研究中,所有的样品都对CD45不利,这是一个迹象表明他们会大MSC。在这项研究中,四个样品显示一个小的细胞CD34阳性(1 - 3%)。

在这项研究中,不同的值CD49d被发现( 88.67 ± 6.55 Katz),符合价值发现和他的同事(2005)( 78年 ± 20. )[ 23]。也许,如果这些细胞将再次提交文化,可以恢复CD49d这个表达式。在这个工作中,培养后的细胞冷冻保存是不可能由于较低的细胞的数量。然而,思考人类翻译,最可能的假设在一个细胞疗法将解冻后的直接移植细胞。因此,正如已经在文献中描述,增加文章的数量也会增加细胞的概率转换teratomes,这使得行不通的治疗( 18]。除了不同值的表达式,这个表面标记显示显著减少解冻后冻存细胞( 77.8 ± 14.45 , p = 0.007 )。这个标志代表了 α4-integrin,粘附分子的相互作用 β1整合素形成异质二聚体,后期激活antigen-4 (VLA-4) [ 13]。雷和他的同事(2007)发现低正值CD49d(平均12.6%),但ADMSC的隔离方式是通过皮下组织,而不是通过lipoaspirate;另一个问题是,他们用较低的DMEM葡萄糖;这些差异协议可以选择不同类型的细胞具有类似特征的,但不完全相同 24]。卡茨和同事(2005),一些团体之间的差异对表达CD49d无数变化的反映调整这些细胞的细胞外介质,如密度、细胞周期,文化,和通道的数量 23]。环境产生合适的干细胞利基市场和调节这些利基市场的维护针对特定细胞系。对于这个规定,干细胞在细胞外基质的粘附是至关重要的,因为它允许细胞和基质之间的沟通,是一个先决条件的维护组织( 25]。因此,这些CD49d低温贮藏后的表达变化可能意味着一个大问题在这些细胞移植,使它们与受伤的组织沟通不当。

在这项研究中,唯一可行的和完整的细胞进行了分析。Gonda et al。(2008)指出,低温贮藏可以引起结构和功能损伤细胞蛋白质和减少他们的生存能力,但immunophenotypic交流几乎不可能发生 19]。表达变化真的不会有借口,但损失的表达式非常相关,因为集团本身提到低温贮藏可以破坏膜蛋白,CD49d的情况下,代表了粘附蛋白。相关的一些研究immunophenotypic不同解冻后冻存细胞,这是一个非常重要的功能,应该研究[ 19, 26]。细胞的异常在低温贮藏和解冻后被染色设备的可行性分析(BD)膜联蛋白V PE_7-AAD 20000事件。细胞凋亡的细胞磷脂酰丝氨酸,细胞膜的内在传单的一个组成部分。当一个细胞进入细胞凋亡过程中,磷脂酰丝氨酸暴露的外壁膜,但细胞膜仍然完好无损。的细胞为膜联蛋白V代表阳性细胞磷脂酰丝氨酸的易位( 27]。解冻后的重大损失细胞完整性,16.5%低于低温贮藏前的细胞(图 5)。也许这细胞完整性和解冻也失去了吗?另一个细胞,7-AAD阳性,表明细胞膜完整性受损;因此,细胞死亡。因此,这些标记是用来区分死细胞和细胞凋亡的过程中。分析这些标记,Cyflogic 1.2.1使用软件,它提供了同形像的柱状图叠加控制每一个标记的荧光的结果和量化的比例正(不重叠的同形像控制)和负(同形像上叠加控制)的标记。因此,它是可能的分析三个变量:(i) 100%可行的细胞(负膜联蛋白V-PE和消极7-AAD);(2)死细胞(膜联蛋白阳性V-PE和7-AAD阳性);和(3)细胞凋亡的过程在细胞(膜联蛋白阳性V-PE 7-AAD和消极的)。这些参数后,在低温贮藏之前,生存能力是91.34%±4.54%。 After thawing, the cells had a significant drop in cell viability, 74.99%  ±  14.19% ( p = 0.001 ),平均损失17.9%可行的细胞。关于与膜联蛋白V(凋亡),标签值非常接近的值细胞生存能力,低温贮藏前91.39%±5.5%和76.3%±13.33%解冻后( p = 0.003 )(表 3)。这项研究表明大多数的膜联蛋白V也沾染了7-AAD染色细胞,这意味着只在细胞凋亡细胞的数量是很小的。

解冻后的ADMSC冻存细胞的异常可能与细胞的浓度解释每个cryotube。吴作栋et al。(2007)测试四个细胞浓度:2.5×1055×1051×106,2×106每毫升,发现生存能力为71.4%,81.10%,77.9%,和69.2%,分别。在这项研究中,细胞的冷冻保存1×106细胞每毫升和生存能力值相似值发现吴集团(2007);然而,吴作栋et al .(2007)所使用的方法是由锥虫蓝染色更相对手工计算;在这项研究中使用的方法更准确,通过流量仪分析( 15]。Thirumala和同事(2010)发现异常,呆在84%±8%时使用相同的冷冻保护剂在他们的研究中,但测试进行P1 ( 27]。德罗斯和他的同事(2009)发现惊人的细胞生存能力值92.5%。这么高的可行性可能与解冻的形式,这些细胞被转移到培养基的10% FCS解冻之前完成;它可以解释为,细胞在更少的时间接触DMSO溶液在室温下,细胞毒性效应而闻名( 10]。研究人员表明,许多因素影响细胞内动态细胞冷冻时,影响这些细胞的可行性。在这些因素可以突显出胞内冰的形成,可以穿过细胞膜,高浓度的细胞可以阻止细胞生长在寒冷(限制空间 15]。标准协议是用于各种细胞类型,但一些细胞特定的特征,这可能需要特别的照顾。出于这个原因,这将是理想的为ADMSC开发一个特定的协议,提高生存能力率和其他特征( 11, 19, 28]。

一些作者用作长期存储方法冷冻在冰箱−80°C而不是液态氮(−196°C),但这种方法揭示了低水平的可行性,同时保留的功能特点。其他变量影响的可行性,如冻结的速度,因为如果它将更快,有更大的概率的胞内冰的形成和顺向膜损伤( 19, 26)和血清自由媒体的选择,这可能不会受益于大细胞生存能力。然而,考虑治疗的应用程序,即使这,低可行性可以表示,降低污染的风险 26]。

 5。结论

在这项研究中,人类的标准协议脂肪间充质干细胞冷冻保存和解冻程序证明减少: α4-integrin表达式(CD49d),解冻后细胞生存能力,和集落形成单位。这些发现可以妥协的整合在宿主组织的细胞外基质细胞。进一步的协议应该建立改进和确保细胞移植。

 利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 承认

作者感谢协调改善高等教育的人员(披肩)的金融支持。

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