外生硫酸乙酰肝素提高了TGF -β在人类间充质干细胞通过激活3-Induced软骨形成TGF -β/ Smad信号

文摘

硫酸乙酰肝素(HS)与生长因子相互作用,参与调节软骨形成。然而,HS TGF -的影响β介导的间充质干细胞(MSC)软骨形成和分子机制仍然未知。在这项研究中,我们研究了外源性的影响商品本身,结合TGF -β3 chondrogenic分化的人类msc和可能的信号机制。结果表明,海关就没有明显的影响人类msc和TGF - chondrogenic分化β/ Smad2/3信号通路。然而,合并后的TGF -β3 / HS呕吐的治疗导致显著增加合成、分泌软骨基质蛋白,cartilage-specific基因表达与细胞治疗TGF -β3。此外,III TGF - HS抑制类型β受体(TβRIII)表达和增加TGF -β3-mediated II型(T的比率βRII) I型(Tβ国际扶轮)TGF -β受体和Smad2/3磷酸化水平。TGF -的抑制剂β/ Smad信号,SB431542,不仅完全抑制HS-stimulated TGF -β3-mediated Smad2/3磷酸化也完全抑制HS TGF -的影响β3-induced chondrogenic分化。这些结果表明外源HS增强TGF -β3-induced chondrogenic人类msc分化通过激活TGF -β/ Smad2/3信号。

1。介绍

间充质干细胞(msc),因为他们的广泛增殖能力和强劲的chondrogenic潜力,是一种很有前途的细胞来源软骨修复(1,2]。有效chondrogenic诱导msc的修复软骨损伤仍然是一个巨大的挑战。很多研究都集中在msc的因素和分子机制增强chondrogenic潜力(3,4]。因素中,生长因子调节软骨形成中起着重要作用[5]。转化生长因子-β3 (TGF -β3),TGF -的成员β总科,是应用最广泛的生长因子诱导msc分化[6]。研究已经证明,TGF -β3刺激软骨形成体外和体内,产生更多的胶原蛋白II和aggrecan比TGF - MSC文化中β1或TGF -β2 (5,7]。

TGF -β提高chondrogenic标记的表达通过激活典型TGF -β/ Smad信号。TGF -β信号是通过顺序启动的两个丝氨酸/苏氨酸激酶受体的激活:II型(TβRII)和I型(Tβ国际扶轮)TGF -β受体。TGF -β配体,结合TβRII磷酸化,激活Tβ国际扶轮形成中的一个大型复杂的,然后激活下游Smad2/3分子和诱导TGF -β端依赖转录程序(8]。类型III TGF -β受体(TβRIII),也叫betaglycan,是一种广泛表达硫酸乙酰肝素(HS)和硫酸软骨素蛋白聚糖(CS)被认为是一个coreceptor TGF -β(9]。TβRIII调节TGF -β信号通过绑定和呈现TGF -βT s配体βRII [10,11]。

最近,有越来越多的证据表明,细胞外基质(ECM)是细胞的重要组成部分,在msc增殖和分化中起着核心作用的调节生长因子ECM和细胞之间的相互作用12,13]。乙酰肝素硫酸盐(HSs)是高度硫酸粘多糖(笑话)14,15]。体内,它们共价连接到不同的核心蛋白质形成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs),存在于细胞表面或ECM的多个组织,包括开发和成熟软骨(16,17]。研究已经证明,HSPGs软骨发育和骨骼的生长中起重要作用18- - - - - -20.]。HS连锁HSPG交互与各种chondroregulatory分子一直在通过各种信号通路参与调节软骨形成,包括成纤维细胞生长因子(fgf),骨形成蛋白(bmp), TGF -β年代,Wnt和刺猬(20.]。TGF -β年代chondroregulatory很重要因素已经被证明与HS (21]。陈等人报道,HSPGs可能发挥重要的作用在调节TGF -β通过潜在转化生长因子的调节β结合蛋白(LTBP1)总成(22]。细胞表面HS蛋白聚糖可以调节TGF -β响应性上皮细胞和其他细胞类型(10]。然而,外生的直接作用在TGF - HSβ介导的软骨形成的msc和相应的分子机制还有待证实。

我们使用了一个人类MSC在体外(hMSC) chondrogenic分化模型来研究外生HS TGF -的作用β3-induced软骨形成和TGF -β/ Smad信号。我们的研究结果表明,外生HS明显强化TGF -βhMSCs 3-induced chondrogenic分化,通过调节TGF -的表达模式β受体,通过激活下游Smad信号通路。

2。材料和方法

2.1。细胞隔离和文化

第一附属医院的伦理委员会批准了中山大学的这项研究中,所有受试者提供书面知情同意。骨髓样本从三个健康志愿献血者的年龄18到22年。他们没有身体疾病。hMSCs被下面的方法分离和纯化的密度梯度离心法23]。短暂,骨髓样本添加到Ficoll-Paque (1.077 g / mL) (TBD、天津、中国)和离心20分钟500 g。单核细胞在低糖resuspended杜尔贝科的修改鹰介质(L-DMEM)(美国纽约Gibco,英杰公司公司)补充10%胎牛血清(的边后卫)(Gibco,英杰公司公司,乌拉圭),37°C下5%孵化有限公司₂。48小时后,不依从细胞通过改变介质中删除。细胞通过在文化融合了80 - 90%。我们使用细胞通道3通道6在我们的实验。

2.2。Chondrogenic hMSCs在球文化的分化

人类msc是收获和resuspended 2×10⁷细胞/毫升,按照以下程序(24]。细胞液滴(4×10⁵/ 20μL)被分成四组。第1组(C组)保持在chondrogenic控制介质组成的high-glucose DMEM (H-DMEM),补充了50μg / mL维生素C、100 nM地塞米松,1毫米丙酮酸钠,40岁μg / mL脯氨酸,其+环球文化补充预混料(美国纽约BD生物科学)(最终浓度:6.25μ6.25 g / mL牛胰岛素μ6.25 g / mL转铁蛋白,μ5.33 g / mL亚硒酸μg / mL亚油酸和1.25毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA))。组2 (HS组)保持在控制中,补充了100μg / mL HS(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)。3组(T组)保持在控制中,补充了10 ng / mL TGF -β3(美国落基山PeproTech)。4组(T + h组)保持在控制中,补充了100μg / mL HS和10 ng / mL TGF -β3所示。细胞液滴在37°C / 5%孵化有限公司₂。每3天中被改变,诱导软骨组织收获3天,7、14、21。

2.3。粘多糖的定量分析(呕吐)

收获软骨球被洗,然后消化在磷酸盐(PBS)解决方案包含0.03%的木瓜蛋白酶,5毫米半胱氨酸盐酸盐,10毫米EDTA-Na2 16 h在65°C。DNA浓度测量使用赫斯特33258绑定化验。简单地说,一个整除的溶解产物与0.7的反应μg / mL赫斯特33258解决方案(美国圣路易斯Sigma-Aldrich) 10分钟,然后测量使用SpectraMax M5标(分子器件、桑尼维尔,美国)在340 nm激发和发射465海里。1,9-dimethylmethylene蓝色(DMMB)(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)染料结合试验用于检测插科打诨的浓度。同样,溶解产物是反应的整除DMMB 10分钟在没有光的情况下,解决方案和吸光度在525纳米测量使用Varioskan Flash多模读者(美国马热科学、沃尔瑟姆)。GAG内容规范化对DNA含量。

2.4。组织学和免疫组织化学

chondrogenic颗粒的不同群体收获chondrogenic感应后7天。1天的颗粒固定在4%多聚甲醛和嵌入在石蜡。石蜡切片(4μ米厚)deparaffinized使用二甲苯,患者通过分级系列乙醇洗,最后在PBS冲洗。部分被苏木精和伊红染色(他)(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)软骨结构和0.1%阿尔新蓝(AB)(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)蛋白多糖。免疫组织化学,水化部分与胃蛋白酶溶液治疗10分钟37°C, H孵化为3%₂O₂10分钟和阻止血清15分钟,然后用兔子反被允许在一夜之间反应胶原蛋白II型多克隆抗体(Abzoom生物学实验室,达拉斯,TX,美国),稀释1:1000 4°C的温度。后来,生物素化的山羊anti-rabbit免疫球蛋白(美国旧金山EarthOx)申请了30分钟。部分与peroxide-conjugated孵化链霉亲和素工作方案和沾3、3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)(金山金桥,北京),染色是可视化使用Axio观察者Z1显微镜(蔡司,哥廷根,德国)。

荧光免疫组织化学染色,组织部分在10毫米微波柠檬酸缓冲,阻塞1 h和PBS包含5% BSA,和适当的反应在一夜之间主要抗体(人类Tβ国际扶轮抗体(圣克鲁斯、达拉斯、美国);人类TβRII抗体(RD系统);和人类TβRIII抗体(圣克鲁斯、达拉斯、美国)),在4°C稀释1:50。组织部分是孵化与异硫氰酸荧光素(FITC)共轭二次抗体(稀释1:100)在室温下1 h。最后,部分与(4′,6-diamidino-2-phenylindole) DAPI染色(1毫克/毫升),覆盖着甘油,检查使用蔡司LSM 710共焦显微镜(卡尔蔡司,海德堡,德国)。

2.5。RNA提取和实时PCR分析

总RNA提取颗粒使用RNAsimple总RNA工具包(Tiangen,中国)和反向转录成cDNA使用PrimeScript RT试剂盒(豆类,大阪,日本)chondrogenic感应后第七天。实时聚合酶链反应(PCR)进行了一式三份使用Bio-Rad实时PCR检测系统与智商5光学系统软件(美国Bio-Rad实验室、大力神、CA)和SYBR绿色我主人混合(豆类,大阪,日本)。下面的基因的表达进行了分析:aggrecan(能);胶原蛋白II型,α1 (COL2A1);SRY基因(性别决定区域Y)盒9 (SOX9);Tβ国际扶轮;TβRII;和TβRIII。的水平glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)基因的表达作为内部控制。引物序列表中列出1。为每个目标基因的相对表达水平计算使用方法。

2.6。免疫印迹

chondrogenic感应24 h后,蛋白质提取从丸radioimmunoprecipitation化验(里帕)裂解缓冲含有蛋白酶和磷酸酶(CWBio,北京)。蛋白质浓度与bicinchoninic然后测量酸测定用BCA蛋白质分析工具包(CWBio、北京、中国)和保存在-80°C。免疫印迹,等量的蛋白质被十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移到一个聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)(美国波士顿微孔)250毫米100分钟使用PowerPac基本电泳仪(美国大力神Bio-Rad)。PVDF膜被封锁的1 h和5%脱脂牛奶/ Tris-buffered盐水含0.1% Tween-20 (TBST),然后是孵化一夜之间在4°C与适当的主要抗体:兔子anti-phospho-Smad2 (Ser465/467) / Smad3 (Ser423/425)(细胞信号),兔子anti-Smad2/3(细胞信号,丹弗斯,美国),和anti-GAPDH单克隆抗体(美国旧金山EarthOx)。所有主要的抗体应用于1:1000稀释。主要的抗体反应后,目标蛋白质检测使用HRP-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白(稀释1:10000)1 h。免疫复合物被发现使用西方SuperSignal Pico化学发光底物(美国纽约皮尔斯),他们通过图像定量可视化Las4000mini(英国通用电气医疗集团)。磷酸化的蛋白质含量Smad2/3量化和归一化总Smad2/3数量。

2.7。抑制TGF -β/ Smad信号

评估的作用TGF -β/ Smad信号在海关的监管TGF -β3-induced hMSCs chondrogenic分化,细胞治疗有或没有SB431542(美国圣路易斯Sigma-Aldrich) 2 h之前刺激通过10 ng / mL的TGF -β单独或100μg / mL HS加上10 ng / mL TGF -β3所示。SB431542是选择性的激活素受体激酶的抑制剂ALK5 (Tβ国际扶轮),而Smad2和Smad3 ALK5基质。SB431542已经证明是被特定抑制剂TGF -β/ Smad途径[25]。7天后chondrogenic归纳法,收集细胞,phospho-Smad2 (Ser465/467) / Smad3 (Ser423/425)抗体检测到免疫印迹。hMSCs chondrogenic分化能力的化验为II型胶原免疫组织化学染色和实时PCR chondrogenic基因表达。

2.8。统计分析

定量数据都表示为平均值±标准错误(SE)。统计分析,由单向方差分析LSD执行以及,使用SPSS 16.0统计软件SPSS,芝加哥,美国)。被选为阈值的意义。

3所示。结果

3.1。HS促进TGF -β3-Induced Chondrogenic hMSCs分化

商品本身没有提升插科打诨的合成大大不同的时间点(图1(一);)。Cartilage-specific基因表达(图1 (b);)和蛋白多糖和胶原蛋白II型分泌(图1 (c))也不是相比显著升高与未经处理的控制。细胞治疗TGF -β3生产更多的呕吐(图1(一);在天3、7、14、21和软骨基质蛋白(图1 (c)),以及增加cartilage-specific基因表达(图1 (b);),而控制细胞。有趣的是,新增的TGF -β3商品一起导致呕吐合成显著增加(图1(一);天7和14在21天),cartilage-specific SOX9基因表达(),(能)和COL2A1 ()(图1 (b)),软骨基质蛋白的分泌(图1 (c)相比),细胞治疗TGF -β3。这些结果表明,h提高TGF -β3-induced chondrogenic hMSCs分化。

3.2。TGF - HS调节表达模式β受体

T没有区别β国际扶轮mRNA和蛋白表达水平的细胞处理海关单独或TGF -β3单独和未经处理的控制文化(图2(一个);)(图2 (b))。然而,TGF -的结合β3 / HS治疗降低Tβ国际扶轮mRNA水平(图2(一个);)和Tβ国际扶轮蛋白表达(图2 (b)相比其他组。HS单独治疗不会增加T的表达βRII基因(图2(一个);)或蛋白表达(图2 (b))比未经处理的控制文化。两个TGF -β单独和联合TGF - 3治疗β3 / HS治疗增强的mRNA水平TβRII基因(图2(一个);)和TβRII表达式(图2 (b)相比)的控制。没有明显的差异TβRII基因水平(图2(一个);)或TβRII表达式(图2 (b)TGF -之间)β单独和联合TGF - 3治疗β3 / HS治疗。T的比率分析βRII Tβ国际扶轮的水平显示,细胞治疗的比率更高的TGF -β3只是治疗和联合TGF -β3 / HS治疗比控制(图2(一个);和、职责)。TβRII / Tβ结合TGF - RI水平急剧增加β3 / HS治疗相比TGF -β3只是治疗(图2(一个);)。对于TβRIII, HS单独或TGF -βTGF - 3单独治疗和组合β3 / HS治疗降低TβRIII mRNA水平(图2 (c);)和TβRIII蛋白表达(图2 (d)相比)的控制。Tβ结合TGF - RIII水平明显下降β3 / HS治疗相比HS单独或TGF -β(图3单独治疗2 (c);)(图2 (d))。

3.3。海关加强了TGF -β3-Mediated Smad2/3的磷酸化

如图3,海关并不影响phospho-Smad2/3的表达。然而,TGF -β3只是治疗和联合TGF -β3 / HS治疗强烈激活Smad2/3的磷酸化。值得注意的是,海关进一步加强phospho-Smad2/3激活诱导TGF -β3所示。

3.4。SB431542块HS-Activated TGF -β3-Mediated Smad2/3的磷酸化

SB431542抑制TGF -β3-activated Smad2/3磷酸化和完全抑制HS-enhanced TGF -β3-activated Smad2/3磷酸化(图4(一))。没有统计学差异phosphor-Smad2/3水平的细胞处理TGF -β3在SB431542 (T +某人)或在那些接受TGF -β3和HS的SB431542 (T + h +某人)(图4 (b);)。

3.5。SB431542抑制HS-Enhanced TGF -β3-Induced Chondrogenic hMSCs分化

rt - pcr分析表明,该组合TGF -β3 / HS治疗显著增加cartilage-specific基因(SOX9,能和COL2A1)表达的细胞相比,对待TGF -β3人(图5(一个);)(图1 (b);)。cartilage-specific基因的表达减少的T +某人和T + h +团体相比,T或T + HS组(图5(一个);)。没有统计上的显著差异表达SOX9的水平,能和COL2A1之间的T +某人组和T + h +组(图5 (b);)。对II型胶原免疫组织化学显示了类似的结果,与胶原蛋白的表达增强的TGF - II型β3完全由SB431542抑制(图5 (b))。

4所示。讨论

micromass HS-stimulated软骨结节形成和发展文化的小鸡肢芽间质已报告(26]。然而,我们的研究结果表明,外生商品本身并没有强烈的msc在体外诱导软骨形成(图1)。不和可能是由于msc更原始细胞相比小鸡肢芽间质。我们的研究结果也证实了其他研究的结果,这表明TGF -β3 chondrogenic诱导msc分化[7]。有趣的是,我们发现商品显著增强TGF -β3-induced chondrogenic分化和cartilage-specific hMSCs的基因表达(图1)。费舍尔等人报道,外生HS增强骨形成蛋白2 (BMP-2)的能力,另一个重要的成员TGF -β总科,促进chondrogenic分化micromass文化中肢体间充质细胞(27]。基于这些研究,perlecan, ECM HSPG,包裹着胶原蛋白II构建仿生材料。由此产生的材料能够绑定BMP-2比II型胶原蛋白支架,导致增强chondrogenic分化(28]。我们的研究结果进一步证明商品的重要作用在调节的chondrogenic活动TGF -β总科。他们还提供实验依据海关或HSPG仿生生物材料或与TGF -药物相互作用β软骨组织工程。

海关可能会调节信号分子反应调节生长因子与其受体之间的相互作用(27]。探索HS的分子机制增强了TGF -β3-induced chondrogenic分化和确定商品是否增加TGF -β信号,我们观察到海关TGF -的影响β3-mediated TβR (I, II, III)表达式和Smad2/3磷酸化。结果表明,h调制TGF -βTGF - 3-induced表达式β受体,减少TβRIII表达式(图2),但增加的比率TβRII TβRI(图2),并增加Smad2/3磷酸化(图3)。结果表明,外源HS调节TGF -之间的交互β3受体,激活下游Smad2/3信号通路。一项研究报道,增加T的比率βRII TβTGF - RIβ受体和配体复杂增强TGF -提供一个积极的信号β全身的细胞反应(10]。海关可能增加的比率TGF -β3结合TβRII和Tβ国际扶轮和激活TGF -β/ Smad2/3信号。有两种可能的机制中,外源性HS调节TGF -之间的交互β3受体。HS TGF -的绑定β3可能会直接促进TGF -之间的交互β与其受体3 (29日]。此外,外生HS抑制内源性HSPGs, TβRIII (betaglycan)表达式(数字2 (c)和2 (d))。据报道,TβRIII HSPGs较大负调节TGF -β全身的细胞反应的比例通过调节TGF -β绑定到TβRII和TβRI (9,10]。这也许可以解释HS-induced促进TGF -β3-induced chondrogenic msc分化。

尽管Smad2/3主要TGF -β启动chondrogenic分化的信号通路、其他途径,如P38通路,也激活了TGF -β在软骨形成(30.]。我们的研究进一步表明,SB431542 TGF -β信号传导抑制剂,不仅完全抑制HS-stimulated TGF -β3-mediated Smad2/3磷酸化(图4),而且完全抑制HS TGF -的影响β3-induced chondrogenic分化(图5)。这些结果表明,TGF -β/ Smad2/3信号独家、独特的途径,由海关强化了TGF -β3-induced chondrogenic msc分化。

5。结论

本研究表明,外生HS增强TGF -β3-induced chondrogenic分化hMSCs TGF -通过促进互动β3受体和进一步激活下游Smad2/3信号。这些发现提供了一个潜在的战略商品的使用或HSPG仿生生物材料或药物配合TGF -β软骨组织工程。需要进一步的研究来探索T的角色βRIII (betaglycan)调制TGF -β全身的软骨形成的msc通过调节TGF -之间的交互β3与TβRII和TβRI。相应的实验正在进行中。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

陈胡安和Yongqian王同样对本文亦有贡献。

确认

这项研究是由国家自然科学基金支持的中国没有。81472039)和基础研究基金为中央大学,中山大学的青年教师基金(13 ykpy23)。

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