文摘

我们以前演示了质量管理的重要性,人类骨髓基质细胞的处理程序(hBMSCs)和存在的证据提供成骨的bmsc抑制剂分子。一个候选人抑制剂ephrin a类受体5 (EphA5),表示在hBMSCs和调节在长期的文化。在这项研究中,被迫表达EphA5降低成骨细胞表型标记的表达。Downregulation地塞米松治疗促进成骨细胞的内源性EphA5标记表达式。EphA5可能参与bmsc的正常生长调节和可能是一个潜在的复制衰老的标志。虽然弗转发信号刺激ephrin-B-Fc提升高山mRNA的表达在bmsc,外源添加EphA5-Fc并不影响高山水平。月初EphA5文化的沉默背后的机制仍不清楚。EphA5子几乎没有甲基化在hBMSCs组蛋白脱乙酰作用可能部分抑制EphA5表达early-passage文化。在多次通过文化中,甲基化的upregulation EphA5独立的可能竞争性抑制成骨的信号转导途径如EphB信号。说明潜在的抑制功能的EphA5 hBMSCs可以提供另一种方法在细胞谱系分化和再生医学治疗策略。

1。介绍

人类骨髓基质细胞(hBMSCs)是一个有吸引力的来源为骨组织工程应用程序由于其增殖能力和multipotency [1,2]。然而,它们的分化可能恶化在多个细胞分裂(3- - - - - -5),因此很难获得足够数量的有效的临床应用通过体外细胞扩张。因此,bmsc的临床应用需要一个更完整的理解的机制,导致这些细胞的衰老。

我们先前的研究显示,长期通过bmsc能够形成骨但也可以抑制骨形成。特别是,我们证明了质量管理的重要性hBMSCs和提供证据的处理程序存在的成骨的bmsc抑制剂分子。一个候选人抑制剂ephrin a类受体5 (EphA5),这是表示在低水平的早期文章hBMSC主要文化和调节在长期文化(5]。EphA5属于ephrin受体酪氨酸激酶亚科可以绑定ephrins A1, A2, A3、A4和A5。ephrin受体分为两组基于细胞外域序列的相似性和绑定ephrin-A和ephrin-B配体的亲和力。ephrin受体能够诱导两个正向和反向(双向)信号相邻细胞进行交互。最近,据报道ephrins及其受体参与骨代谢。赵等人证明了细胞外域之间的信号ephrin-B2表示对破骨细胞和成骨细胞中EphB4抑制破骨细胞分化和刺激成骨分化6]。除了osteoclast-osteoblast交互,osteoblast-osteoblast交互通过ephrin A2和EphA2或EphA4也被证明发生(7,8]。的差别,我们发现对这些内生EphA5使用特定siRNAs或地塞米松(DEX)治疗促进成骨细胞标记表达式,表明EphA5骨形成的是一个潜在的抑制剂5]。然而,没有报告EphA5在骨代谢的作用,并抑制作用的机制EphA5 bmsc的成骨分化尚不清楚。

bmsc异构和含有亚种群的osteoprogenitors和未分化的细胞,和很难评估每一批的整体表达谱的细胞在临床设置(9]。敏捷,被用来区分bmsc成脂肪形成的(1],chondrogenic [10- - - - - -12),和成骨的血统10,13),不仅影响扩散速率也bmsc的族群组成。然而,敏捷如何诱导分化的确切机制尚不清楚。以前,我们假设敏捷并不直接诱导bmsc成特定细胞系而增加的响应性伴其他分化试剂应用与敏捷。我们报道了敏捷诱导选择性较高的细胞增殖分化能力不仅在最初扩散文化也在随后的成骨诱导(14),细胞BMP刺激响应性越高选择性扩散下连续敏捷治疗(15]。此外,敏捷治疗选择性地抑制EphA5表达式(5]。因此,EphA5可能是一个潜在的负面的预后指标的响应性bmsc分化试剂,它可能参与bmsc的衰老或降低分化能力。

我们研究的目标是确定EphA5 BMSC质量的影响并明确分化的抑制机制参与减少潜在的多次细胞分裂。这里,我们证明了抑制hBMSCs EphA5对成骨分化的影响,研究其功能和作用机理,结合EphA5和敏捷治疗之间的关系。我们的研究表明,EphA5可能是一个新的治疗目标和质量控制hBMSCs成骨分化能力的标志。

2。材料和方法

所有的实验研究中特别审查委员会批准东京医疗和牙科大学进行符合赫尔辛基宣言和大学人体的保健和使用指南。参与者提供了他们的书面知情同意参与这项研究。

2.1。主要的文化hBMSCs

获得知情同意后,伴着从骨髓培养送气的34个病人接受髋关节手术在东京医疗和牙科大学的机构审查委员会批准的协议。捐赠者年龄从30到87年。大约2毫升的骨髓吸入了髓腔的每个病人使用的股骨骨髓活检针(卡地纳健康、都柏林、哦,美国)。吸入被添加到20毫升的生长培养基(杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM) Sigma-Aldrich有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)含10%胎牛血清(美国生命科技有限公司,卡尔斯巴德,CA)和1% antibiotic-antimycotic (10000 U /毫升青霉素G钠,10000μg / mL硫酸链霉素,25岁μg / mL两性霉素B;生命技术)含有200 IU的肝素钠(Mochida制药有限公司、东京、日本),然后离心去除脂肪层。骨髓细胞被resuspended在生长介质,和细胞悬浮液的整除数有核细胞溶血后。随后,1×10⁸骨髓有核细胞被镀成两个225厘米²水瓶(Becton, Dickinson和公司,富兰克林湖,新泽西,美国)。然后在每个培养基培养细胞在37°C在湿润的气氛中包含95%的空气和5%的公司₂,媒介是每三天更换一次。当主文化成为近汇合的,包含1毫米的细胞分离与0.25%胰蛋白酶EDTA(生命技术),随后每个测定山肩。细胞密度2×10通道³细胞/厘米²,hBMSCs通道1 (P1), P5, P10储存在液氮直到进一步使用。收集到的hBMSCs单独培养或保存;独立个人捐赠者的细胞化验,以防止交叉污染的hBMSCs不同的捐赠者。

2.2。成骨分化

bmsc山肩在2×10³细胞/厘米²six-well培养板。当文化板块成为80%汇合的,每组的培养基包含10毫米改为成骨的媒体β甘油磷酸盐(βgp, Sigma-Aldrich有限公司)和50μg / mL抗坏血酸磷酸(和光,AA, kouichi日本大阪)13)有或没有100海里地塞米松(敏捷,生活技术)和/或BMP-2。零和成骨的文化的七天之后,在每一个试验使用的细胞。

2.3。RNA隔离,实时rt - pcr

总RNA是孤立的文化菜肴使用RNeasy迷你包(试剂盒、GmbH是一家现代化的、希尔登,德国),和第一链cDNA准备使用PrimeScript RT试剂盒和gDNA橡皮擦(豆类生物有限公司、志贺、日本)根据制造商的指示。基因表达被实时聚合酶链反应(PCR)量化使用Mx3000P QPCR系统(安捷伦科技有限公司,圣克拉拉,CA,美国)和GoTaq QPCR大师混合(美国WI Promega有限公司菲奇堡)。引物组预先设计和从豆类购买生物公司(表1)。标准来自一个特定的样本,每一个PCR反应在这项研究中运行一个标准曲线定量相对Ct值的样本。β肌动蛋白用于标准化的模板量出现在每个样本。

2.4。慢病毒生产和转导

慢病毒生产都使用了GeneCopoeia HIV-Based慢病毒表达系统(GeneCopoeia, Inc .,医学博士,美国):1.3×10⁶GeneCopoeia 293 ta慢病毒包装细胞被镀在10厘米细胞培养皿(他一一Bio-One Frickenhausen,德国,猫。数量664 - 960)在10毫升heat-inactivated 10%胎牛血清的DMEM补充和孵化37°C公司为5%₂转染前24小时。

在无菌聚丙烯管,我们2.5稀释μg(慢病毒子表达载体质粒(GeneCopoeia)(图1(一)),1.25μ克包装质粒,pCAG-HIVgp(三好博士的礼物,这里)和1.25μ克VSV-G、质粒牧师和pCMV-VSV-G-RSV-Rev(三好博士的礼物,这里)到200年μL Opti-MEM L(表达载体)。在一个单独的管,我们稀释15μL FuGENE高清的转染试剂(美国WI Promega) Opti-MEM L。我们添加稀释FuGENE一滴一滴地DNA溶液和孵化的混合物在室温下15分钟。我们添加了DNA-FuGENE复杂直接每道菜和细胞孵化有限公司₂孵化器在一夜之间37°C。隔夜培养基被新的取代DMEM培养基补充heat-inactivated 4%胎牛血清,penicillin-streptomycin, 1/500的体积TiterBoost试剂(GeneCopoeia)。上层清液收集转染48 h后,过滤通过0.45μm polyethersulfone (PES) low-protein-binding过滤器(美国新泽西州绘画纸),并集中40倍Lenti-X集中器(Clontech)根据制造商的协议。包含慢病毒颗粒的集中上层清液是直接用来确定效价和体外转导目标细胞。慢病毒股整除和存储在−80°C。每一批的慢病毒载体的效价是评估使用Lenti-X存在滴定工具包(Clontech)。

我们镀2×10⁴目标每在P1 hBMSCs 24-well板病毒感染前24小时。对于每个好,0.5毫升的病毒悬液稀释在决赛与聚凝胺生长介质的浓度4μ克/毫升。我们感染bmsc代替对细胞的生长培养基稀释的病毒上清液(感染复数:250 (MOI = 250)]和孵化的细胞在4°C 2 h,紧随其后的是转移到37°C孵化器有限公司为5%₂一夜之间,孵化。病毒上清液中被移除和慢病毒——(LV)转导bmsc山肩的密度80细胞/厘米²(克隆密度)或2×10³细胞/厘米²到6-well板,用于进一步分析。

2.5。附着力化验

文化板块附着力检测被涂上一层7μg / mL胶原蛋白我在37°C 1 h,然后用1% BSA在DMEM阻塞。LV-transduced bmsc山肩在2×10的密度³细胞/厘米²到6-well板预镀与胶原蛋白我孵化24小时37°C。转导在2天后,不依从细胞被广泛切除,激进的洗涤与PBS。剩下的贴壁细胞然后使胰蛋白酶化计算血细胞计数器。参与细胞被用作控制。计算相对细胞连接,连接细胞的数量是规范化控制细胞连接的数量。

2.6。CFU化验

对于克隆分析,克隆形成单位(CFU)进行了分析。bmsc镀在800细胞/在6-well文化在每个盘子和维护媒介形成单一细胞衍生的殖民地,7天。然后,媒介改变了成骨的介质(CFU-ALP和CFU-OB)。

2.7。CFU-ALP

菜被染色高山成骨诱导的7天。菜肴与10%中性缓冲福尔马林固定用PBS洗净,然后孵化的混合物过滤磷酸萘酚AS-MX(0.1毫克/毫升,Sigma-Aldrich有限公司),N, N-dimethylformamide(和光)0.5%,kouichi MgCl₂(2毫米),坚牢蓝BB盐(0.6毫克/毫升,Sigma-Aldrich) 0.1米Tris-Cl (pH值8.5)在室温下为30分钟。

2.8。CFU-OB

矿化殖民地被冯Kossa染色和指定群集型unit-osteoblasts (CFU-OB)。在14天的成骨诱导,细胞被洗两次与相当的平衡盐溶液,10%福尔马林固定,与0.1 mol / L卡可缓冲冲洗,覆盖着1.0毫升的5%硝酸银和光)(kouichi。然后细胞暴露于紫外线1 h。最后,盘子和蒸馏水清洗和风干。

积极的殖民地计算在每一个试验之后,菜肴与结晶紫染色想象所有殖民地上盘子,和菌落总数的决心。菌落直径< 2毫米和微弱的彩色殖民地都被忽略了。

2.9。冯Kossa染色钙沉积

细胞用10%福尔马林固定10分钟在4°C和三次用水洗,之后,这些细胞被孵化与3%硝酸银60 min和曝光40 W灯。用水冲洗后,细胞用5%硫代硫酸钠孵化2分钟之后,用水洗。

2.10。免疫印迹分析

从hBMSCs蛋白质提取。细胞总蛋白质是由溶解细胞里帕缓冲在不同的时间点。的蛋白质浓度测定使用BCA试剂盒(皮尔斯,罗克福德,IL)。的一个主要抗体EphA5 (AP7610d ABGENT)和α微管蛋白(11 h10)兔马伯(# 2125年代,细胞信号技术,Inc .,东京,日本)。蛋白质(15μg)由10% sds - page分离,然后转移到一个聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。与PVDF阻塞后阻塞试剂可以得到信号(TOYOBO生命科学、东京、日本),与主杂化膜抗体在一夜之间在4°C,然后用HRP-linked杂化anti-rabbit免疫球蛋白G二级抗体(# 7074,细胞信号技术,Inc .,东京,日本)在室温下1 h。然后添加Lumigen TMA-6(美国Lumigen Inc .)、位于MI)膜上,让它代表2分钟。使用一个增强化学发光方法检测的信号在一个ImageQuant LAS4000系列系统(英国英国通用电气医疗集团有限公司)。

2.11。微阵列分析

总RNA从subconfluent参与bmsc, bmsc敏捷6 h在P5孤立对待,然后接受DNase1微阵列分析。总RNA (1μg)放大并贴上Cy3或使用Ambion Cy5氨基烯丙基MessageAmp II aRNA放大工具包(生活技术,猫。1753号)根据制造商的指示。一个安捷伦整个人类基因组芯片4×44 K (G4110F)杂化825 ng放大RNA在65°C 16 h和洗用流体站450系统(Affymetrix, Inc .,圣克拉拉,CA,美国)。微阵列的幻灯片是使用从轴突GenePix 4000 b扫描器扫描仪器(美国联盟的城市,CA),每个微阵列图像首先分析使用GenePix Pro 6.1图像分析软件(分子器件、LLC桑尼维尔,美国)确定Cy3和Cy5荧光强度和背景噪音点的数组。微阵列数据归一化值,中值和日志₂比率计算与参与组的值相应的捐赠样本()。基因上涨或下调逾三倍相对于所有捐赠者的中值样本进一步分类根据其蛋白质类型使用SOSUI程序(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/)。

2.12。流式细胞术分析

bmsc培养在100毫米培养皿有或没有敏捷治疗(100 nM, 14天)被胰蛋白酶化收获。识别ALP-positive细胞,收集细胞培养30分钟在4°C小鼠单克隆抗体反高山(研发系统,Inc .,明尼阿波利斯,美国),洗和孵化FITC-conjugated二级抗体(鼠anti-mouse IgG1单克隆抗体;Becton, Dickinson和公司)在4°C 30分钟。流仪使用流式细胞仪分析石中剑系统。

2.13。Ephrin-Fc EphA5-Fc治疗

Subconfluent 6-well板层的细胞孵化了0,0.4,或4μg / mL Fc (6 - 001 a,研发系统,Inc .)、锰、美国),ephrin-Fc (SMPK3、研发系统,Inc .),或重组鼠EphA5-Fc嵌合体(541 - a5,研发系统,Inc .)在含10%胎牛血清的DMEM, 50μg / mL抗坏血酸(Sigma-Aldrich有限公司)和10毫米β和光)甘油磷酸酯(kouichi表示时间。高山的信使rna表达水平在第七天以P1和P5细胞()。

2.14。5-Azacytidine VPA治疗

丙戊酸(VPA P4543,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)是溶解在H₂O浓度为1 M和添加到培养基的最终浓度1毫米。bmsc培养在媒体补充10μM 5-azacytidine (A2385σ)或5-aza-2′脱氧胞苷(A3656σ)4天或1毫米丙戊酸24 h。

2.15。DNA基因组DNA提取和硫酸氢钠修改

基因组DNA分离细胞和组织使用DNeasy工具包(试剂盒)和存储在−在使用前20°C。基因组DNA (1μ从P1细胞或P5细胞g)亚硫酸氢钠处理根据制造商的建议(EZ DNA Methylation-Gold工具包,Zymo研究,橙色,CA)。酶甲基化DNA(普遍的人类DNA甲基化标准,Zymo研究)是作为一个积极的控制。

2.16。MSRE消化

每个反应混合物OneStep qMethyl过程优化了20 ng输入DNA根据制造商的建议(OneStep qMethyl装备,Zymo研究,橙色,CA)。设计引物的5′-AGGAGGCTCGGAGAAGATGC-3′(向前)和5′-CATCTCCCTACCTTCGTTGCTG-3′(反向),放大DNA位点(地区),包含两个methylation-sensitive限制性内切酶(MSRE)网站。热循环条件下使用时37°C 2 h MSRE消化;1 95°C的循环10分钟;35周期为30秒95°C, 63°C为30秒,30秒和72°C;在72°C和最后一个扩展7分钟。放大位点的甲基化水平(地区)确定使用以下方程。甲基化率=,ΔCt平均Ct值从测试反应-反应的平均Ct值的引用。

2.17。统计分析

的值被表示为算术平均值±标准平均误差(SEM)和分析使用单向方差分析(方差分析)。然后,学生的以及用于群体间的比较。后值是使用Bonferroni调整修正,确定统计学意义。统计学意义是表示“”图。

3所示。结果

3.1。强迫的表达在hBMSCs EphA5抑制成骨分化

过度表现EphA5 bmsc和确定EphA5在成骨分化的作用,hBMSCs与慢病毒载体转导编码EphA5和GFP(数字1(一)和1 (b))。LV-EphA5-transduced细胞显示绿色荧光蛋白表达增加,增加EphA5 mRNA水平(图7天的成骨的文化1 (c))。EphA5超表达在hBMSCs减少高山mRNA, Runx2 mRNA, ITGA5 mRNA表达水平(数字1 (d),1 (e),1 (f)),不影响EphA2和EphA4信使rna表达水平(S1图,在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/1301608)。LV-EphA5-transduced bmsc证明降低粘附6-well盘子而LV-Luc-transduced bmsc或控制未经处理的bmsc在播种后1天。没有明显的细胞形态差异LV-Luc, LV-EphA5-transduced bmc(图1 (g))。

符合这种效果,LV-EphA5转导在hBMSCs hBMSCs的成骨能力下降的负面高山染色和选择性地抑制他们的集落形成。bmsc与慢病毒载体转导通道1镀在克隆生长介质的密度和培养7天的集落形成时期。每个在成骨培养基培养一个额外的7到14天。殖民地染色和ALP-positive OB-positive殖民地。总菌落数和高山的比率,OB-positive殖民地LV-EphA5-treated井中低于LV-Luc-treated井(数字1 (h)- - - - - -1 (j))。这些结果说明EphA5被迫表达不仅能充分降低成骨细胞标记物的表达基本hBMSCs还细胞和成骨的能力附件文化井。

3.2。年末EphA5是调节在成骨的感应与敏捷文化和表达下调

我们分析了所有已知的表达ephrin和弗家庭成员hBMSC文化与敏捷和成骨诱导后BMP-2(图2(一个))。敏捷的治疗持续了72 h时,ephrin-B1的mRNA表达,EphA2, EphA5, EphB1, EphB2,和EphB3 ephrin受体酪氨酸激酶亚科是减少,而ephrin-B2 EphB6也增加。相比之下,BMP-2治疗ephrin-A4的表达增加,ephrin-A5, EphA2, EphA3 EphA4, EphA5。ephrins和弗受体的表达模式在成骨诱导成骨诱导期间使用BMP-2因此不同于使用敏捷。协同作用的敏捷和BMP-2观察,证明了高山mRNA表达增加。在ephrin和弗家庭,EphA5的表达模式是密切相关的EphA2 hBMSCs处理时敏捷和/或BMP。例如,EphA5和EphA2水平的下降由敏捷治疗匹配上涨EphA3和EphA4水平在大多数样品。

我们调查的影响连续敏捷治疗在bmsc的扩散阶段通过比较DEX-treated细胞与未经处理的细胞分化能力。敏捷治疗整个文化时期导致了戏剧性的变化在细胞形态(图2 (b))。大ALP-positive亚种群连续敏捷治疗后观察,这表明成骨细胞群的选择发生(图2 (b))。此外,我们评估的影响细胞间接触的成骨的能力在不同的诱导bmsc协议(图2 (c))。高山mRNA表达的增强敏捷观察感应无论细胞密度,而DEX-excluded成骨诱导产生更强的效果在一个较高的细胞密度比低细胞密度(图2 (d)),这可能是因为成骨的因素的影响,要求信息接触,如成骨细胞表达的结合,或成骨的体液因素释放bmsc高密度。相比之下,EphA5 mRNA表达被细胞密度的影响最小,当细胞受到DEX-excluded成骨的归纳(图2 (e)S2图A和图B)。

调查DEX-mediated骨生成,bmsc P5刺激了10⁻⁷敏捷为各种时间。虽然减少EphA5 mRNA水平显示两相的变化,敏捷治疗抑制EphA5 mRNA表达长达6个小时在大多数样本,其次是高山的表达增加(图2 (f))。另一方面,BMP-2治疗显示EphA5 mRNA水平的增加,导致不同的结果相比,敏捷治疗(S2图C)。

阐明敏捷的机制促进hBMSC成骨、差异基因表达的DEX-untreated BMSC与综合处理分析了敏捷6 h在P5 Affymetrix GeneChip技术9独立BMSC的准备工作。微阵列分析显示,敏捷治疗调节ITGA5(表2)及其下游目标PIK3R1,除了FKBP5, Src激酶家族(SGEF SHC4, SLA和DIRAS3), FoxO1, BMP-6。正如所料,这种治疗不仅EphA5也使之抑制下游的目标EphA如ρ/ RAS-related基因(如RASD1 ARHGAP, RGNEF)。值得注意的是,敏捷治疗改变了表达各种白细胞介素、肿瘤坏死因子和趋化因子受体(表2和3)。这些戏剧性的变化引起的敏捷感应可能理解成骨分化的机制的关键。ITGA5 upregulation引起敏捷hBMSCs据报道促进成骨细胞分化[16),在目前的研究中,rt - pcr还透露,成骨诱导使用敏捷提升ITGA5表达式在7天(S3图)。因此EphA5和ITGA5可能参与这个DEX-mediated成骨的途径。

3.3。hBMSCs EphA5-Fc处理和未经处理的hBMSCs运通高山mRNA在相似的水平

在许多细胞类型,弗正向信号和ephrin反向信号调解相反的效果。因此重要的是要确定哪些信号有助于hBMSCs的分化功能的恶化。澄清的相反效应弗正向信号和ephrin反向信号hBMSCs的分化能力,我们第一次使用各种ephrin-Fc构造信号刺激弗前进。ephrin-A-Fc治疗,主要信号通路激活各种EphA向前,不影响高山mRNA水平,而治疗ephrin-B-Fc显著增加高山mRNA表达(图3(一个))。

我们执行q-PCR化验的细胞培养在存在的可溶性形式EphA5细胞外域融合Fc (EphA5-Fc),基于假设EphA5-Fc可溶性受体,在绑定ephrin配体,将激活ephrin反向信号和抑制弗转发信号通过与内生EphA5受体竞争结合hBMSCs ephrin配体。然而,我们发现,外源添加可溶性EphA5-Fc并不影响高山mRNA表达水平在P1细胞或P5细胞(图3 (b))。

3.4。沉默的EphA5 Early-Passage hBMSCs不是与异常的启动子甲基化有关

EphA5是显著的调节在hBMSC增殖。这种机制可能与活性抑制较低的通道数。进一步阐明机制EphA5的沉默early-passage P1细胞,我们分析了EphA5基因的5′监管区域。特别是,我们分析了406个基点的CpG岛包括TSS(转录起始点)(−103 + 303个基点;TSS, + 1),其中包含38 CpG二核苷酸;这段跨越核心启动子外显子和内含子1的一部分。EphA5启动子的甲基化水平,其中包含两个methylation-sensitive限制性内切酶(MSRE)网站,决心。EphA5启动子的甲基化水平在hBMSCs P1或P5是类似于人类nonmethylated DNA作为一个消极的控制。EphA5启动子在P1和P5细胞几乎没有甲基化,即使在敏捷治疗(图4(一))。

治疗与DNA甲基化抑制剂5-azacytidine hBMSCs 5-aza-2′脱氧胞苷并没有改变EphA5 mRNA表达,表明缺乏敏感性EphA5表达基因组DNA甲基化状态。然而,治疗组蛋白脱乙酰酶1 (HDAC1)抑制剂丙戊酸(VPA) 24小时显著增加EphA5 mRNA表达在P1和P5细胞(图4 (b))。然后我们评估passage-dependent组蛋白脱乙酰作用的变化是否影响EphA5表达式与VPA治疗伴在每个通道。VPA治疗1毫米仅略有增加EphA表达late-passage细胞(图4 (c)),这表明组蛋白脱乙酰作用抑制EphA5表达early-passage文化和染色质重塑通过组蛋白脱乙酰作用是一个潜在的EphA5基因沉默的机制。

4所示。讨论

弗和Eph-related受体参与发展活动,特别是在神经系统(17- - - - - -22]。弗受体的作用,ephrin配体在细胞粘附和迁移23- - - - - -25),形成组织间边界(26- - - - - -28),和监管各肿瘤细胞增殖的29日- - - - - -35]也记载;然而,他们的潜在作用在骨生物学现在才开始出现。在ephrin hBMSCs弗家庭成员表示,只有EphA5调节late-passage文化中(5]。在这项研究中,我们关注的影响EphA5 BMSC成骨分化和提供数据表明EphA5 hBMSCs的重要调控成骨分化能力。功能研究表明,EphA5降低成骨细胞表型标记物的表达。Downregulation特定siRNAs或敏捷的内生EphA5治疗促进成骨细胞标记表达式和成骨分化(5]。因此,考虑到长期文化时期减少hBMSCs的成骨分化潜能和EphA5逐渐调节在长期文化(5图B)] (S2, EphA5可能参与bmsc的休眠过程和正常生长调节和可能是一个潜在的候选人复制衰老的标志。先前的报道表明,EphA5参与调控肿瘤休眠的36,37]。此外,先前一些研究表明细胞伴随老化对人类染色体4基因是本地化的,正常的人类染色体4引入三不朽的细胞系导致的损失扩散和逆转的不朽的表型(4,38]。EphA2相比,位于染色体1;EphA3、EphB1 EphB2, EphB3 3号染色体上;EphA4 2号染色体上;和EphB4 EphB6 7号染色体上EphA5位于染色体4问题,这可能会进一步支持其参与衰老。

在许多细胞类型,弗正向信号和ephrin反向信号调解相反的影响(39- - - - - -41]。新出现的证据表明,细胞coexpressing弗受体和ephrins存在于许多组织和coexpression EphAs ephrin-A结果反式-(相邻细胞之间)或顺式(在同一细胞)相互作用[42,43]。Coclustering EphA和EphB受体之间也发生,导致激活的受体类型,不需要两个配体的存在,结果取决于相对受体表达(44]。我们之前发现各种内源性EphA和EphB受体表达在肿瘤细胞等hBMSC [5]。我们现在提出,coexpression弗受体和ephrins调节hBMSCs的成骨分化。在早期hBMSC主文化的通道,EphA5表达在低水平,独立于甲基化。在正常情况下,EphA5和ephrin-As / ephrin-Bs正确表达和与对方。引发的信号抵消EphA激活生长因子信号通过促进Ras / ERK的活化和PI3K / Akt (45),从而有助于维持细胞内稳态。重复使导致选择性upregulation EphA5但不是ephrins [5)从而导致过度的nonligated EphA5。

在目前的研究中,虽然弗提出信号刺激ephrin-B-Fc提升高山mRNA的表达在bmsc之前报道(6,46,47)(图3(一个)),治疗ephrin-A-Fc没有显著影响体外成骨分化。特别是,外源添加EphA5-Fc,激活ephrin反向信号或抑制EphA5转发信号通过竞争绑定,不影响高山表达水平。此外,尽管EphA5的表达在细胞密度低,没有bmsc中细胞间接触的可能性,几乎是相同的,观察到高细胞密度与信息接触,高山mRNA水平在低细胞密度低。等信息接触osteoclast-osteoblast [6],osteoblast-osteoblast [7,8],BMSCs-BMSCs通常应该是必不可少的成骨分化。如果没有信息接触,成骨分化的基本信号可能不是传播,导致高山水平的下降。越来越清楚的是,至少有一些弗激酶可以不配体参与(48]。EphA5可以表达的增加有竞争力的防止各种ephrins绑定到其他弗受体,从而抑制成骨的信号转导途径如EphB信号。除了这种机制,有可能大量过剩nonligated EphA5在长期文化,在生理异常的情况下,可能有一些微不足道的影响保持未分化状态的bmsc,独立于配体的绑定(图5(a))。另一个可能性是规范化EphA5正向信号刺激ephrins或ephrin反向信号刺激EphA5本身并不传输成骨的信号。相反,EphA5可能功能减弱的信号coclustered催化地无能受体如EphA10 EphB6,这可能调解kinase-independent转发信号类似于其他弗受体激酶变体形式的(49- - - - - -51]。目前的结果是很难解释的复杂性和缺乏特异性ephrin /弗绑定;例如,每个ephrin可以绑定多个弗受体,反之亦然,甚至类之间的A和b .此外,ephrin /弗信号双向传输。一般来说,Fc-clustered配体能够激活受体在体外。尽管许多作者使用ephrin-Fc作为配体可以激活弗提出信号(6,23,47,48,52),目前也不清楚实际上ephrin-Fc诱导受体激活;这些配体通常作为抑制剂或阻塞试剂而不是活化剂交联后如果不添加。EphA5的下游信号是不应该只有一个信号但多重和复杂。EphA5可能调解下文提及各种不同的路径和可能导致影响下游信号促进高山的表达式,同时抑制,虽然EphA5抑制高山的过度表达。替代EphA或EphB信号参与成骨的感应,而不只是单独EphA5信号,可能参与这个过程。鉴于hBMSCs弗表达的变化,目前的结果本身不能完全代表EphA5信号的具体机制。需要更多的全球方法定义的确切作用EphA5超出这个限制。

弗受体也通过各种不同的途径和信号分子,包括小gtpaseρ和Ras的家人,粘着斑激酶(FAK), Jak / Stat通路,PI3K通路。在目前的研究中,敏捷治疗不仅EphA5也使之抑制下游的目标EphA如ρ/ RAS-related基因(如RASD1 ARHGAP, RGNEF);这是重大的发现。激活这些蛋白在不同细胞系和癌细胞调节通过调制和信息交互活动整合素和细胞的生存途径(52- - - - - -54),这表明他们可能在hBMSCs执行类似的功能。调节整合素活动已被证明是一个关键机制支撑ephrin的影响和弗系统cell-matrix粘附和迁移。例如,ephrin-A激活整合素信号通路,从而增加细胞粘附或改变细胞形态和能动性55- - - - - -57]。EphA-ephrin-A绑定也诱发细胞隔离在开发过程中整合素聚类(58]。因此,敏捷可能会引起差别EphA5对这些ITGA5 upregulation [16增加成骨细胞分化和骨体外。在目前的研究中,EphA5超表达在hBMSCs不仅ITGA5 mRNA水平也降低细胞对胶原蛋白i这个胶效果不清楚机制应充分探索;然而,它可能是部分参与ITGA5级别,这应该是与细胞粘附和细胞凋亡相关根据以前的报告(16]。我们之前确认population-selective敏捷增强bmsc的分化的影响14]。然而,我们没有描述选择的细胞或详细的机制如何选择。值得注意的是,我们也证实了敏捷的成骨分化影响使用人类永生的bmsc,这被认为是一个single-cell-derived和同质人口,因为他们已经通过无数次(数据没有公布)。研究使用同质细胞群可以描述一个过程不同于我们提议选择通过竞争扩散机制的细胞群。

替代程序的选择,我们也观察到,敏捷的响应性增强hBMSCs成骨的刺激BMP的先前的研究。特别是,敏捷治疗迅速增强BMP-induced磷酸化SMAD1/5/8 24 h内只有很少影响细胞亚群分布在同一时期15]。敏捷的治疗也抑制EphA5 mRNA表达6小时,这是与目前的研究水平的提高高山。这种快速减少EphA5水平表明,敏捷介导从衰老表型转换的快速增长hBMSCs通过针对dormancy-associated标记EphA5,除了先前观察到的分组人口再分配效应。EphA5水平的下降可能导致改进的细胞衰老和更高的细胞响应differentiation-inducing因素。考虑到不仅重复段落,而且BMP-2治疗诱导EphA5表达式在某种程度上,这一结果似乎表明,EphA5也是一个分化标记而不是伴随老化标志。但首先,还有时候BMP-2治疗不会增加高山表情hBMSCs在一定条件下,如在低密度(图2 (d))或在一些样品由于个人响应能力。其次,我们已经表明,治疗可以促进成骨的BMP-2求同存异hBMSCs以不同的方式,维护或促进ephrins的整体表达谱和弗受体而敏捷的治疗可以有选择性的影响在hBMSCs ephrin /弗亚科。我们推测,BMP可能移植其他ephrin /弗亚科或加速信号的其他方式可能比EphA5均有较强的影响,导致成骨分化尽管EphA5水平增加。由于这些强大的和全球的影响与整体upregulation BMP-2许多分子,我们认为EphA5不应被视为一个分化标记即使增加了BMP-2。我们不仅观察到敏捷治疗选择性地抑制mRNA的表达EphA5 EphA2,也被称为一个成骨的抑制剂(7,23),而敏捷增加成骨的刺激器的水平,如ephrin-B2 [6]和EphA4 [8]。除的效果良好的成骨诱导试剂之一,BMP-2,我们专注于不清楚敏捷可以抑制成骨的抑制剂的选择性的影响。进一步的实验必须需要调查BMP信号之间的关系和ephrin /弗亚科,和敏捷和BMP-2协同作用的机制。

几项研究已经证明,EphA5经常在各种癌症细胞系和肿瘤组织表达下调通过异常的启动子甲基化(32,34]。然而,刺激的性质,移植在重复使EphA5 bmsc仍不清楚。我们表明,组蛋白脱乙酰作用可能与观察upregulation EphA5相关联。限制我们的研究之一,VPA实验是一个全球性的刺激和影响不能分配给EphA5。组蛋白H3 Lys9乙酰化和Lys14 (H3K9K14ac)或trimethylation Lys9和Lys27 (H3K9me3和H3K27me3)一般与开放或封闭的染色质状态(59,60]。我们需要调查转译后的修改组蛋白H3绑定到EphA5发起人使用染色质免疫沉淀反应(芯片)。最近,据报道,miR-34a负面调节软骨形成针对EphA5小鸡腿间充质细胞(61年),而反血管增生和dormancy-promoting分子包括EphA5据报道被dormancy-associated mir - 580的表达调节,mir - 588, mir - 190 (37]。因此需要进一步的研究来确定特定的刺激导致upregulation EphA5的重复使,包括microrna的潜在作用。

在反复总结,通过文化的upregulation dormancy-associated EphA5独立于甲基化可以抑制信号由其他EphA或EphB家庭成员通过直接交互,虽然还可能出现竞争配体结合。EphA5和配体表达之间的不平衡可能会损害弗ligand-dependent分化过程(图5),可能在hBMSCs调解ligand-independent流程。说明潜在的抑制功能EphA5 hBMSCs可以提供另一种方法表达操纵的命运hBMSCs和谱系分化的细胞治疗策略和再生医学。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感激地感谢Tetsuya Jinno博士和Daisuke甲贺,医学博士期间收集骨髓送气的操作程序;Ryuta佐博士求助与慢病毒生产;和Yusuke Hirabayashi博士,有价值的建议。这项工作是由来自日本的科研补助金支持促进社会科学。

补充材料