文摘

神经干细胞(nsc)港口可能分化成神经元,星形胶质细胞,少突胶质细胞在正常情况下和/或组织损伤。nsc打开一个新的方式来治疗受伤的中枢神经系统和神经退行性疾病。到目前为止,很少有药物开发控制NSC功能。在这里,齐墩果酸的作用以及机制(OA)、五环三萜,NSC函数进行了研究。我们发现OA显著抑制neurosphere剂量依赖性的方式形成10 nM,取得最大的效果。OA也减少5-ethynyl-2′脱氧尿苷(EdU)纳入国家安全委员会,这是表明抑制NSC增殖。免疫印迹分析发现特异性神经元标记微管蛋白的蛋白质含量β三世(TuJ1)和Mash1增加而astrocyte-specific标记神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)下降。免疫荧光分析显示OA TuJ1-positive细胞的百分比显著升高和降低GFAP-positive细胞。使用DNA微阵列分析,183个基因由OA有差异。通过转录因子结合位点分析这些基因的上游调控序列,87个基因预测nkx分享一个共同的主题——2.5绑定。最后,小核RNA)方法被用来沉默nkx 2.5 - 2.5表达式,发现沉默nkx单独并没有改变的表达TuJ-1 TuJ-1-positive细胞的百分比。但在OA的组合治疗和沉默nkx - 2.5,最影响的OA nsc被废除。这些结果表明,OA nsc的有效诱导分化成神经元至少部分由nkx - 2.5 -依赖的机制。

1。介绍

齐墩果酸(OA)是一种五环三萜广泛见于多种植物和草药等齐墩果欧洲公司,槲寄生专辑l,和Ligustrum清明的(1]。原来的工厂Ligustrum清明的已被用来治疗多种疾病与特定症状资料在中药几千多年2]。作为一个主要的有效组成部分Ligustrum清明的OA是归因于拥有广泛的活动,包括抗癌(3- - - - - -5,抗炎6],王亚南[7,8],nephroprotective [9),和抗糖尿病的10,11]属性,从而显示有前途的临床应用。多个分子靶点或信号通路参与OA行动的机制。据报道,OA抑制核转录因子k B (NFκB)和核易位激活,导致抑制肿瘤坏死的factor-alpha-induced炎症反应(12]。办公自动化是一种糖原磷酸化酶抑制剂(13,14],它催化的关键一步生成葡萄糖的糖原。研究还表明,OA可能通过farnesoid x受体(FXR)选择性地调节FXR的目标基因,因此调解一些有利影响(15]。核因子红色的两个相关因素(Nrf2),一种转录因子,引发各种抗氧化剂和cytoprotective基因,与OA的王亚南效应(7,16]。据报道最近,衍生品和同系物的OA显著改善空间记忆保留和血小板减少的负担在阿尔茨海默病小鼠模型17]。自nsc老年痴呆症的发病机制中发挥重要作用,伟大的承诺为其治疗,在目前的研究中,我们调查了OA在nsc的影响。

神经干细胞(nsc)是一种干细胞位于中枢神经系统和脊髓。他们有可能分化成神经元,星形胶质细胞,少突胶质细胞在正常情况下和/或组织损伤。nsc代表小说的方法治疗受伤的中枢神经系统以及神经退行性疾病(18]。nsc的因素维持自我更新能力被广泛研究。诺信号通路中起着关键作用在维护国家安全委员会池(19]。(骨形成蛋白(bmp)20.)和抑制性基本螺旋循环螺旋(bHLH)转录因子21)也有助于nsc的调节自我更新。生成家庭因素是重要的诱发NSC分化(22]。其他因素包括声波刺猬(嘘)[23),维甲酸(RA) (24],neuropathiazol [25)也显著增加神经元分化的国家安全委员会在体外。因素驱动nsc成星形胶质细胞的分化包括白血病抑制因子(生活)和neuropoietin (NP),睫状神经营养因子(据),血管内皮生长因子(EGF)和骨形态发生蛋白家族成员26- - - - - -29日]。虽然取得了很大的进步在揭示NSC函数的分子基础,很少有药物开发控制NSC的命运。

在目前的研究中,我们测试了OA的影响在NSC自我更新和multidifferentiative NSC的潜力。我们所知,我们是第一个表明OA诱发nsc的分化神经元nkx - 2.5 -依赖的机制。

2。材料和方法

2.1。动物

昆明怀孕的雌性老鼠在动物设施维护复旦大学公共卫生学院的中心。所有演出在小鼠经复旦大学动物保健和使用委员会许可数量SCXK(胡)2010 - 0016,并按照指南动物使用美国国立卫生研究院。

2.2。nsc准备和文化

如前所述(执行Neurosphere文化30.)做了一些调整。在胚胎小鼠胚胎第14天(E14灯头)收集timed-pregnant昆明小鼠和放置在D-PBS(表达载体、钙、美国)。前脑神经上皮被撤下剩余的胚胎解剖显微镜。合组织机械分离成单个细胞悬液用小口径fire-polished巴斯德吸管。这些细胞被无菌尼龙网过滤和水洗两次DMEM / F12培养基(表达载体、钙、美国)含100单位/毫升青霉素和100年μ克/毫升链霉素。可行的细胞的数量是由锥虫蓝染色。Neurosphere文化是由种子细胞的密度来可行的细胞/毫升基础培养基补充20 ng / mL重组人成纤维细胞生长因子2(美国hrFGF2表达载体,CA), 20 ng / mL重组人血管内皮生长因子(hrEGF,表达载体、钙、美国),和Stempro NSC补充(表达载体、钙、美国)。

2.3。Neurosphere形成分析

细胞克隆条件下镀在5 /μL 96年(0.1毫升/)在无血清DMEM / F12培养基含有20 ng / mL hrFGF-2(表达载体、钙、美国),Stempro NSC补充(表达载体、钙、美国),和青霉素100单位/毫升和100年μ克/毫升链霉素。第二天,各种浓度的OA(生物技术。中国上海;纯度99%以上的高效液相色谱法)被添加到每个96孔板。球体形成的总数在每个8 d后计算。只有殖民地> 40μ米直径都算作neurospheres。Neurosphere大小决定通过测量单个neurospheres的直径在光学显微镜下,表示为一个卷(假设一个球形)。连续第二、第三或第四个段落被用来验证neurosphere形成。

2.4。细胞增殖实验

细胞增殖是化验的基础上整合EdU及其后续检测通过荧光叠氮化铜(I)催化[3 + 2]环加成反应(“点击“化学)如前所述31日]。总之,单一NSC种植的96孔板在DMEM / F12培养基含有20 ng / mL hrFGF-2和hrEGF(表达载体、钙、美国),Stempro NSC补充(表达载体、钙、美国),和青霉素100单位/毫升和100年μ克/毫升链霉素。EdU被加入到培养基的最终浓度10μ米3 h。细胞被固定0.5%甲醛固定和permeabilized Triton x - 100。细胞被染色的孵化与100毫米三30分钟,0.5毫米CuSO₄,10μAlexa 594 -叠氮化,抗坏血酸和50毫米。细胞复染色4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。这些细胞被洗,荧光显微镜成像。

2.5。分化分析

单一nsc在5000个细胞密度/镀到10μg / mL PDL-coated 96孔文化菜(美国纽约康宁)和孵化3 d的分化培养基组成含1%胎牛血清的DMEM / F12(表达载体、钙、美国),Stempro NSC补充(表达载体、钙、美国),和青霉素100单位/毫升和100年μ克/毫升链霉素。三天后,细胞免疫印迹和免疫细胞化学分析的收获。

2.6。免疫印迹分析

细胞在分化培养基上培养的收获和细胞溶解在一个缓冲区包含50 mM HEPES-NaOH (pH值7.5),100毫米氯化钾,特里同x - 100 1%, 1%钠脱氧胆酸盐,0.1%十二烷基硫酸钠,EGTA 1毫米,1毫米二硫苏糖醇,1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,0.5%蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich,密苏里州,美国),1毫米Na₃签证官₄,氟化钠10毫米,和20毫米β甘油磷酸盐。结果提取离心机在14000克15分钟在4°C获得透明细胞溶解产物。蛋白质浓度测定使用Biyotime分析工具包(Beyotime、上海、中国)与BSA作为标准。相当于35μg蛋白被加载在每个跟踪和蛋白质被十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和转移到硝化纤维素膜(美国Amersham生物科学)。5%的膜被封锁(wt /卷)脱脂牛奶在磷酸缓冲盐含有0.1%渐变20与微管蛋白的抗体——涂抹β三世(TuJ1) (1: 200;美国Chemicon)、Mash1 (1: 200;美国Chemicon)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP) (1: 500;美国Chemicon),其次是孵化与适当的二次HRP-conjugated山羊anti-mouse或兔抗体(1:5000;美国杰克逊ImmunoResearch)。免疫反应性的乐队是可视化ECL试剂(Biyotime、上海、中国)。

2.7。免疫细胞化学

细胞在分化培养基上培养20分钟用4%多聚甲醛固定,阻止了1% BSA和0.1% Triton x - 100,洗PBS,孵化为30分钟0.3% H₂O₂抑制内源性氧化物酶,然后阻塞1 h使用3% BSA在PBS / Triton x - 100年的0.1%。以下主要抗体被用来和孵化2小时在室温:单克隆鼠标anti-TuJ1(稀释1:200;美国Chemicon)、兔anti-GFAP (1: 500;美国Chemicon)和兔anti-nestin (1: 1000;美国Chemicon)。二次Alexa共轭594 F (ab)′2只山羊anti-rabbit抗体和488年Alexa共轭山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L) (1: 1000;表达载体,添加了美国)为1.5 h在PBS 1% BSA和特里同x - 100年的0.1%。然后用DAPI细胞复染色。免疫反应性的细胞的数量在每个计算使用荧光显微镜。

2.8。微阵列和数据分析

细胞在分化培养基培养试剂盒的3天是收获和细胞溶解试剂(美国表达载体)。总RNA分离使用试剂盒RNeasy工具包(试剂盒),根据制造商的协议。孤立的RNA受到质量控制测试。从每个样本用于cDNA合成RNA与Cy3标签的cDNA紧随其后。标签cDNA样品提交给罗氏,杂化老鼠基因表达K数组(罗氏罗氏,05543797001),代表44170个老鼠基因。单一颜色罗氏数组与GenePix 4000 b基因芯片扫描仪扫描。从扫描图片提取的数据使用NimbleScan v2.5软件。表达数据通过分位数正常化和规范化的多片平均(RMA)算法是包含在NimbleScan软件。调查水平(* _norm_RMA.pair)文件和基因水平(* _RMA.calls)归一化后生成的文件。所有基因水平的文件导入到安捷伦GeneSpring GX软件(版本11.5.1)进行进一步分析。差异表达基因,层次聚类,路径分析和基因本体论(去)进行了分析。分析差异表达基因的转录因子结合位点,在线工具负鼠(http://www.cisreg.ca/oPOSSUM/)使用32]。所有的数据都是MIAME兼容和原始数据以及处理数据存入GEO数据库,加入GSE38394数量。

2.9。定量实时聚合酶链反应

从细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体)。一微克总RNA的反向转录使用优势RT-for-PCR工具包(试剂盒,瓦伦西亚,CA)。新转录cDNA用于定量实时PCR使用SYBR绿色(Bio-Rad大力神,CA)。每个基因的引物设计的在线工具Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/补充表1中列出)在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/672312。RotorGene实时DNA进行PCR扩增系统(Corbett研究,悉尼,澳大利亚)如我们之前所述研究[33]。

2.10。RNA干扰

nkx - 2.5 siRNA工器老鼠细胞应用获得圣克鲁斯生物技术(目录。sc - 36076)。详细的核协议遵循制造商的指导方针。简单地说,细胞每200年被播种μL不分化中含1%胎牛血清的DMEM / F12(表达载体、钙、美国),Stempro NSC补充(表达载体、钙、美国)96孔细胞培养板。两天后,6μL的siRNA双稀释到100年μ小干扰rna转染L介质(目录。sc - 36868,圣克鲁斯生物技术);然后5μL小干扰rna转染试剂的稀释(目录。sc - 29528圣克鲁斯生物技术)到100年μL siRNA-containing转染介质混合,然后添加到细胞中。这些细胞被孵化在37°C 6 h有限公司₂孵化器。然后中被删除,取而代之的是不分化培养基(见部分2。5)。进一步48 h后潜伏期,细胞收获和用于执行免疫细胞化学和免疫印迹分析。一个非特异性核(目录。sc - 37007,圣克鲁斯生物技术)转染作为一个消极的控制。

2.11。统计分析

结果表示为平均数±标准差计算和统计意义使用一个学生以及由R或方差分析软件。被定义为的重要性水平。复制实验的数量显示在图结果或传说。

3所示。结果

3.1。OA抑制Neurospheres的形成

Neurosphere nsc的形成反映了自我更新能力当单nsc镀在很低的细胞密度。在我们的成长培养条件,nsc neurospheres形成不同大小的直径从20μ超过100μm(图1(一))。这些neurospheres巢蛋白呈阳性,一个著名的NSC标记(图1 (b)),提供的证据NSC和/或神经祖的身份。接下来,neurosphere形成的频率计算有或没有添加OA。对照组形成()从500年最初neurospheres种子细胞,导致频率约为3.15%。车辆溶剂DMSO的频率没有显著改变neurosphere形成(,)。添加办公自动化后,neurosphere频率低(1纳米),中间(10 nM)和高(50 nM)浓度的OA,,(),分别。与控制相比,10到50 nM OA显著降低neurosphere nsc的形成()。OA的最大抑制作用的浓度达到10 nM(图1 (c))。

3.2。OA抑制nsc的扩散

减少neurosphere形成(图1 (c))可能是由于妥协NSC细胞增殖。NSC增殖研究后添加使用EdU公司OA,允许指数在S期的细胞细胞周期的确定。在控制,EdU-positive细胞占总细胞的比例% ()(图2(一个))。在OA在10纳米,把EdU到nsc显著降低(%,;与控制)(数据2 (b)和2 (c))。

3.3。OA nsc的诱导分化神经元

当单个细胞培养在一个表面的单层PDL-coated菜肴在血清生长因子48 h,免疫化学的结果表明,在对照组中,% ()细胞GFAP-positive(图3(一个)),% ()细胞TuJ1-positive(图3 (b)),这表明nsc是多功能的。治疗后与OA GFAP-positive细胞的比例没有变化与控制)(图3 (c)),但TuJ1-positive细胞显著增加的百分比% (;与控制)(数据3 (d)和3 (e))。免疫印迹分析总细胞溶解产物OA-treated或未经处理的细胞显示TuJ1表达增加,特异性神经元标记和Mash1和特异性神经元转录因子治疗OA(图3 (f))。GFAP蛋白表达,astrocyte-specific标记,显示(图略有增加3 (f))。结果表明OA作为nsc的分化诱导神经元。

3.4。通过办公自动化识别差异表达基因的诱导

nsc在分化培养基培养,四个独立的生物复制的基因表达分析对每个小组进行实验。与OA治疗后,有80个基因调节和103个基因表达下调,1.5倍以上值< 0.05。这些基因被浓缩在几个途径包括T细胞受体信号通路,肠道免疫网络IgA生产、同种异体移植物排斥反应,和自身免疫性甲状腺疾病(补充表2)。基因本体论(去)浓缩不同监管基因还发现了一些潜在的途径(补充表3)。因为转录因子的重要作用在干细胞自我更新和分化,我们预测转录因子结合的可能的上游网站183个差异表达基因。我们指出,转录因子nkx - 2.5是预测控制87目标基因的表达(补充表4)。这些87个基因,聚类分析成功分类样本分为两组,其中对照组的变化和OA相关治疗组(图4(一))。其中87个基因上游调控序列共同预测主题nkx - 2.5绑定。这个主题是显示的频率矩阵。TTAATTG是最常见的模式(图4 (b))。一个基因的上游调控区可能功能多为给定的转录因子结合位点;我们确定了最高的基因数量可能nkx - 2.5结合位点。Elav14,他们包括FoxP1 Zfp536、Erc2和Runx1(图4 (c))。我们注意到这些目标基因与多个结合位点nkx - 2.5被报道参与NSC函数。我们确认mRNA表达变化FoxP1 Elav14 Zfp536 Erc2, Runx1定量实时PCR。分析显示高度一致的结果与DNA微阵列测量(图4 (d))。

3.5。nkx - 2.5介导OA在nsc的影响

为了检测是否nkx - 2.5 OA的影响是一个重要的调停人,nkx - 2.5与核沉默。核后,nkx - 2.5蛋白表达明显下降,而控制核改变不了nkx - 2.5蛋白表达(图5(一个))。siRNA nkx - 2.5没有显著变化的特异性神经元标记TuJ1蛋白质表达和TuJ1-positive细胞的百分比。这个结果表明nkx - 2.5可能没有宪法对nsc分化的影响,与以前的报告中一致nkx - 2.5主要充当一个重要的转录因子在心肌细胞谱系规范(34]。而10 nM OA治疗导致显著增加TuJ1蛋白质表达和TuJ1-positive细胞的百分比%),然而大多数OA的影响已经被废止核nkx - 2.5 (;与OA 10 nM集团)(数据5 (b)和5 (c))。siRNA nkx - 2.5和/或治疗OA影响不显著GFAP蛋白的表达和GFAP-positive细胞,可能暗示的作用特异性OA的神经祖细胞或高方差实验人群。我们的研究结果表明,nkx - 2.5,至少部分中介效应的OA在促进nsc向神经元分化。

4所示。讨论

单个细胞的解剖神经组织,当镀在适当的条件下,形成浮球的细胞称为neurospheres [35]。这些高度异构结构包含正确的nsc但更受限制的祖细胞甚至分化后代。干细胞的存在可以证实这些neurospheres分离成单个细胞,金属焊补。更受限制的祖细胞和分化后代扩散能力有限。他们要么不改革neurospheres或只有改革neurospheres很小。相比之下,真正的国家安全委员会有很强的自我更新能力和改革neurospheres尽管不断使。明确测试细胞的自我更新潜能在neurosphere文化,克隆分析是必需的。镀在单个细胞在中等到高细胞密度、细胞或小neurospheres可以坚持相互结合形成大neurospheres [36,37]。通常这些密度用于药物筛选化验,没有必要,每个neurosphere来源于一个干细胞或祖细胞。许多报道采用镀低细胞密度5000细胞/毫升或1000 /毫升测量神经干细胞的自我更新(38,39]。在我们的研究中,我们镀单一细胞的密度5000细胞/毫升。大约5%的镀改革neurospheres的单个细胞,与先前的研究一致(39]。OA显著抑制neurosphere 10海里形成和取得最大效果。这种减少neurosphere形成的OA可能来自受损nsc增殖。为了验证这个假设,我们测量扩散后的OA使用一个EdU公司化验。OA显著降低EdU公司。上述结果表明,OA可以抑制nsc的自我更新,可能通过抑制nsc的扩散。

当nsc区分,他们逐渐退出细胞周期。研究表明,神经祖细胞周期的长度直接耦合细胞命运的选择,因为缩短细胞周期抑制细胞分化分裂的因素,而那些延长细胞周期促进细胞分化分裂(40]。基于这样的观察:OA nsc增殖能力的抑制,OA nsc的分化的影响。免疫细胞化学分析显示,OA TuJ1-positive细胞的百分比增加和减少的百分比GFAP-positive细胞。免疫印迹显示OA增加TuJ1蛋白质表达和减少GFAP的表达。促进神经发生[Mash1是一个重要的转录因子41,42]。为进一步证实我们的发现,我们决定OA Mash1蛋白质表达的影响,显示他们被OA也升高。我们也观察到,即使在经济增长中包含hrFGF和hrEGF OA除了导致坚持一些neurospheres显示neuron-like增长(数据未显示)。这些结果表明,OA nsc能够有效诱导分化为神经元。

微阵列分析被用来筛选差异表达基因引起的OA。有80个基因调节OA超过1.5倍,而103个基因表达下调。转录因子在NSC维护和分化起着关键作用。我们推测许多差异表达的基因可能是目标的主调控转录因子。我们确定了潜在的转录因子结合位点上游序列的差异表达基因。在OA的183个基因差异表达,87被预测转录因子结合位点的nkx - 2.5蛋白质。聚类分析的87个基因表达的变化可以分为两组,对应控制和治疗OA。nkx - 2.5对心肌细胞谱系至关重要的规范和发展心脏传导系统(34,43,44]。nkx - 2.5也可能发挥重要作用在其他器官或细胞系统。最近,nkx - 2.5在成肌细胞的过度所导致的表达神经元标记表明这个基因在神经发生的作用45]。在87个基因预测nkx - 2.5的控制下,有几个包含多个潜在nkx - 2.5结合位点包括FoxP1 Elav14, Zfp536 Erc2, Runx1。FoxP1建立柱状身份和脊髓运动神经元连接在鼠标开发(46,47),促进中脑多巴胺神经元的分化和/或维护(48]。Elavl4是住房和城市发展部的基因编码,哺乳动物的一员ELAV胡/蛋白质,rna结合蛋白。住房和城市发展部表达仅限于神经元。在神经系统内,胡蛋白质的第一个标记神经元分化的49]。胡ELAV /蛋白质也很重要在突触可塑性50]。Zfp536,最近确定了锌指蛋白,是最丰富的大脑中,表示在发展中中枢神经系统和背根神经节,和在大脑皮层局部,海马和下丘脑区域。功能分析提供证据表明Zfp536是神经元分化的负调节(51]。在这项研究中,由OA Zfp536 mRNA表达明显下调,进一步支持OA在神经元分化的影响。Runx1可能nkx - 2.5的另一个重要目标。Runx1中扮演着重要的角色在不同细胞类型的分化52- - - - - -54和参与神经细胞神经支配55]。总之,基于生物信息学分析和文献之回顾,我们假设nkx - 2.5可能调解OA的影响。

为了证实我们的假设关于nkx - 2.5的作用,我们用siRNA技术在nsc沉默nkx - 2.5表达式。免疫印迹显示成功推倒的大部分nkx - 2.5表达式。沉默的nkx - 2.5没有增加或减少特异性神经元标记TuJ1蛋白质表达和TuJ1-positive细胞的百分比。这表明nkx - 2.5可能没有宪法对nsc分化的影响。但我们发现,在治疗OA,沉默的nkx - 2.5显著表达,不完全,废除了OA在nsc分化的影响。根据我们的结果,我们不能排除其他因素扮演了一个角色在OA的影响。与此同时,关系,甚至网络nkx - 2.5之间的关系和其他转录因子,如FoxP1 Elav14, Zfp536, Erc2, Runx1,将我们的研究集中在不久的将来。即便如此,我们的研究结果表明nkx - 2.5,至少部分中介效应的OA在促进nsc向神经元分化。

神经干细胞(nsc)可以提供基本的engraftable神经细胞来源毁灭性的疾病,如阿尔茨海默病(56),帕金森病(57),和脊髓损伤58]。nsc的分化的主要挑战之一是增加的比例nsc分化成神经元与神经胶质细胞。OA,源自与历史悠久的传统中药的临床应用,可能是一个潜在的药物改善神经元分化和用于相关疾病。

5。结论

这些结果表明,OA nsc的有效诱导分化成神经元至少部分由nkx - 2.5 -依赖的机制。

信息披露

你宁和黄Jianhua第一作者。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

你宁和黄Jianhua贡献同样这项工作。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。81202745,没有。31171129,没有。81460748)和中国国家基础研究项目(没有。2010 cb530402)。

补充材料