Bcl-xL基因改造提高了治疗效果的间充质干细胞移植治疗心脏梗塞

文摘

目标。间充质干细胞(msc)成活率低,严重限制了细胞疗法的治疗效果治疗心肌梗死(MI)。Bcl-xL转基因可能增强MSC移植后生存。方法。成年大鼠骨髓msc与人类Bcl-xL基因被修改(hBcl-xL-MSCs)或空向量(vector-MSCs)。MSC细胞凋亡和旁分泌分泌物特征使用流式细胞仪,TUNEL和ELISA在体外。在活的有机体内与MI收到随机成年老鼠心肌注射的三个试剂:hBcl-xL-MSCs, vector-MSCs或培养基。组织化学、TUNEL和超声心动图进行评估细胞移植,细胞凋亡,血管生成,疤痕形成,心脏功能恢复。结果。在体外,细胞凋亡减少43%,血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)和plate-derived生长因子(PDGF)增加1.5,0.7,和1.2倍,分别在hBcl-xL-MSCs与野生型和vector-MSCs。在活的有机体内、细胞凋亡减少40%和26% hBcl-xL-MSC组与中、vector-MSC组,分别。也观察到类似的结果细胞移植、血管生成、疤痕形成,和心脏功能恢复。结论。基因改造的msc hBcl-xL基因可能是一个有趣的策略来改善细胞疗法的治疗效果治疗心脏梗塞。

1。介绍

细胞移植已成为一种很有前途的治疗方法对心肌梗死后心脏功能的恢复。骨髓间充质干细胞(msc)是自我更新,多功能的前身nonhematopoietic基质组织。在适当的条件下,可以诱导msc分化成多个细胞系,包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞1],骨骼肌细胞[2),心肌细胞(3),肝细胞(4),和神经细胞5]。msc被证明能够促进血管生成和缺血性心肌细胞通过旁分泌的生存生产各种细胞因子(6,7]。此外,结果表明,msc免疫抑制有利于抑制炎症反应和受伤的心脏组织未来的纤维化(8,9]。msc可以很容易地从骨髓和脂肪组织分离和扩展在体外基于能力坚持文化的菜肴。因此,msc似乎是一个吸引人的细胞移植治疗心肌梗死的源头。

然而,移植后几天内,msc的低存活率从有害的微环境发生缺血、炎症反应和proapoptotic因素严重抑制心肌细胞修复的治疗效果(3,10]。因此,有必要加强msc改善细胞疗法的疗效。证据表明,转基因msc与生存的11]或凋亡[12)基因可以提高移植msc的可行性和结果在一个更好的归航的msc缺血性微环境,从而提高急性心肌梗死后的心脏功能恢复。

Bcl-xL和bcl - 2细胞凋亡有重要的调控作用,两者都属于bcl - 2蛋白家族。这是证明人类Bcl-xL adenoviral介导表达(hBcl-xL)可以抑制基因的老鼠心脏缺血性心肌梗死后心肌细胞凋亡和冷保存时间可延长心脏移植(13,14]。同时,据报道,bcl - 2过表达基因可以保护msc对细胞凋亡在缺氧条件下在体外和在活的有机体内和bcl - 2基因工程的移植msc可以改善急性心肌梗死后心脏功能恢复(12]。因此,它是合理的推测,在msc Bcl-xL基因的超表达也可能改善移植msc的可行性,并帮助恢复心肌梗死后心脏功能。

在这项研究中,我们过表达hBcl-xL基因在成年大鼠骨髓msc为了提高他们的生存与颓废的缺血性心肌梗死后微环境。我们提出,基因改造的msc hBcl-xL基因可以帮助改善的可行性msc移植后到缺血性心脏,从而导致一个更好的治疗对急性心肌梗死的影响。

2。材料和方法

2.1。重组慢病毒结构

构建慢病毒表达载体pLenti6.3-IRES2 -EGFP,内部核糖体进入站点的编码序列(IRES -)增强型绿色荧光蛋白(EGFP)插入Xho我网站下游pLenti6.3 multiclonal网站(MCS)地区的巨细胞病毒/ V5桌子(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。生成表达载体pLenti6.3 -hBcl-xL-IRES2 -EGFP,703个基点PCR产品hBcl-xL cDNA侧面的Asc我和一个中外职业我限制网站在5′和3′端,分别是在帧插入同样切向量pLenti6.3-IRES2 -EGFP的控制下人类巨细胞病毒(CMV)启动子。科扎共识翻译起始位点立即开始之前添加了密码子hBcl-xL编码序列的真核细胞进一步提高翻译效率。在这个向量,IRES的编码区可能会导致个人的表达EGFP的表达一起hBcl-xL转导细胞。

2.2。细胞转导

Sprague-Dawley (SD)大鼠骨髓msc (Cyagen生物科技、广州、中国)被播种到6-well盘子和低葡萄糖杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM-LG)(美国纽约Gibco,格兰德岛)补充10%胎牛血清(Gibco, Mulgrave,维克,澳大利亚),100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升。细胞汇合的50%时,重组慢病毒建设pLenti6.3 -hBcl-xL-IRES2 -EGFP和空向量pLenti6.3-IRES2 -EGFP分别添加到培养基莫伊= 50。转导进行24 h在37°C;然后中吸气,“(分泌物)颗粒细胞培养的新媒介。通过添加1稳定转导细胞被选中μg / mL杀稻瘟菌素(美国马Calbiochem, Billerica)到培养基中。

2.3。细胞成像

5×10⁵从每个群野生型细胞msc、vector-MSC, hBcl-xL-MSC被播种到6-well板在37°C和培养24小时。细胞检查下IX81倒置显微镜(奥林巴斯、东京、日本)和照片都被使用DP73 CCD数码相机(奥林巴斯、东京、日本)。

2.4。免疫印迹分析

细胞治疗里帕裂解缓冲(50毫米Tris-HCl (pH值7.4),150毫米氯化钠,特里同x - 100 1%, 1%钠脱氧胆酸盐,0.1%十二烷基硫酸钠,2毫米焦磷酸钠,25毫米β甘油磷酸酯1毫米EDTA 1毫米Na₃签证官₄和0.5μg / mL亮抑酶肽)。样品的蛋白质含量是决定使用皮尔斯BCA蛋白质分析工具包(美国热科学,罗克福德,IL)。蛋白质是解决了10 - 13%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和转移到0.22μm聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)(美国马EMD微孔,Billerica)和探测与第一抗体在4°C过夜,然后清洗和孵化与辣根过氧化物酶共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)在室温下1小时。反应乐队被SuperSignal Pico西部开发和增强化学发光检测试剂根据制造商的指示(美国热科学,罗克福德,IL)。第一抗体使用兔子anti-Bcl-xL多克隆抗体(美国细胞信号技术,波士顿,MA),多克隆兔anti-cleaved caspase-3抗体(美国细胞信号技术,波士顿,MA),多克隆兔anti-GAPDH抗体(Bioworld科技,圣路易斯公园、锰、美国)(加载控制)和兔多克隆抗β肌动蛋白抗体(Bioworld科技、圣路易斯公园、锰、美国)(加载控制)。

2.5。Immunophenotypic表征

细胞与PBS冲洗两次,使胰蛋白酶化,在200×g离心5分钟然后在500毫升resuspended PBS。大约5×10⁵细胞每100毫升标有主要鼠抗体鼠CD29, CD90、CD44、CD34、CD45在4°C 30分钟,洗净。分析了标记细胞与BD FASAria细胞分选仪(美国加利福尼亚州圣何塞Beckton迪金森,)。在这个实验中使用的抗体CD29-FITC, CD90-FITC, CD44-FITC, CD34-FITC, CD45-FITC(美国加利福尼亚州圣何塞Beckton迪金森,)。鼠标IgG1-FITC(美国加利福尼亚州圣何塞Beckton迪金森,)是用作控制同形像。

2.6。膜联蛋白V / Propidium碘(π)流式细胞术分析

1×10⁶从每个群野生型细胞msc、vector-MSC, hBcl-xL-MSC被播种到T25烧瓶,与200年在培养基培养μM PERDROGEN (H₂O₂)(σ,圣克拉拉、钙、美国)4小时37°C。H后₂O₂治疗,膜联蛋白V /π细胞凋亡测定了用膜联蛋白V-FITC凋亡检测装备我(美国加利福尼亚州圣何塞Beckton迪金森,)。短暂,细胞被收集和清洗在磷酸缓冲盐(PBS)然后resuspended两倍于500年μL绑定缓冲。resuspended细胞被孵化的膜联蛋白V-FITC和π为15分钟,检查BD FASAria细胞分选仪(美国加利福尼亚州圣何塞Beckton迪金森,)。

2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)

msc在常氧条件下培养的95%的空气和5%的二氧化碳或缺氧条件95%的氮气和5%氧气在37°C 24小时。评估的分泌血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)和plate-derived生长因子(PDGF)的条件培养基收集野生型msc、vector-MSCs, hBcl-xL-MSCs,分别使用VEGF和ELISA进行鼠酶联免疫试剂盒(Abcam,剑桥,剑桥郡swavesey村庄,英国),PDGF-AA鼠酶联免疫试剂盒(Abcam,剑桥,剑桥郡swavesey村庄,英国),和igf - 1鼠酶联免疫试剂盒(Abnova、台北、台湾)根据制造商的协议。每个样品的光学密度(OD)值是读取一个elx - 800吸光度标仪(美国Biotek Winooski, VT)与三甲空的控制和调整。每个样本的浓度是根据标准曲线计算。

2.8。心肌梗死和MSC移植

所有的动物治疗根据指南发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生研究院(NIH出版物编号为85 - 23,1996年修订)和所有动物协议的动物保健和使用委员会批准沈阳军区总医院,沈阳、中国。雄性SD大鼠体重280克到300克被分为三组(vector-MSC集团中等组和hBcl-xL-MSC集团)。老鼠麻醉通过腹腔内注射戊巴比妥(50毫克/公斤),插管通过气管插管,机械通风。左侧开胸。小伙子的近端部分动脉的结扎了6 - 0缝线(美国新泽西州Ethicon,萨默维尔市)缝合。结扎后不久,一个苍白的区域在左心室(LV)的前壁指示成功的梗塞。结扎后,动物收到六subepicardial注射vector-MSCs hBcl-xL-MSCs梗死周围地区。对于每一个注,1×10⁶细胞悬浮在50μL培养基,注入到1.0毫米宽边界区域周围的心肌梗死(认为是边界区)31-gauge针(美国加利福尼亚州圣何塞Beckton迪金森,)。媒介组注射培养基为同一地区。的假针灸组没有小伙子结扎左侧开胸。肌肉注射青霉素G苄星青霉素(100000 U /公斤)是用来防止感染。

2.9。测定细胞移植

一个或MSC移植后4周,动物被牺牲和心脏解剖。从每个心,五个冻结部分准备穿越的中层梗塞的面积。部分都是固定在PBS冰冷的丙酮和清洗。心部分在移植后1周直接安装与延长黄金不变色试剂4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI)(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和后期的心脏部分沾多克隆兔anti-Troponin T (TnT)抗体(美国细胞信号技术,波士顿,MA)和Cy3共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX),然后安装与DAPI延长黄金不变色试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。所有部分FV1000S-SIM / IX81共焦显微镜下观察(奥林巴斯、东京、日本)。对于每个部分,10大功率领域(高通滤波器400 x)边界区内随机选择和数字拍照。定量分析的细胞移植与cellSens条目执行软件(奥林巴斯、东京、日本)。积分光密度(IOD) EGFP信号和总细胞数在每个微观领域提出了计算和细胞移植IOD和总细胞数的比率。一名调查员盲治疗进行分析。

2.10。在活的有机体内TUNEL分析

MSC移植后4周,动物被牺牲和心脏解剖。冻结部分准备从每个心穿越中层梗塞的地区。TUNEL分析进行如上所述和细胞核被苏木精复染色。对于每个幻灯片,彩色图像的10个随机选择大功率领域(高通滤波器200 x)边界区内被捕和数字化BX53显微镜下DP73 CCD数码相机(奥林巴斯、东京、日本)。图像分析的侦探被蒙蔽的MSC治疗。TUNEL-positive核标记细胞被定义为有明确的棕色。在每个图像,棕色细胞核的面积(面积_布朗)和总细胞核的面积(面积_总)计算。凋亡指数表示为面积的比值_布朗和区域_总。

2.11。评价毛细血管密度

量化的毛细血管密度,MSC移植后4周,冰冻切片是由心如前所述解剖和沾多克隆兔anti-von血友病因子(vWF)抗体(美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)和辣根过氧化物酶共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(美国德克萨斯州圣克鲁斯生物技术、达拉斯)。细胞核被苏木精复染色。BX53显微镜下微观照片被抓获,DP73 CCD数码相机(奥林巴斯、东京、日本)。毛细血管密度分析了一个侦探被蒙蔽对MSC治疗。正面彩色随机选择大功率的10个领域里的毛细血管被数(高通滤波器400 x)边界区内5部分/动物。和毛细血管密度提出了船舶的平均数量/大功率领域。

2.12。评价梗死大小

MSC移植后4周,动物牺牲,心被移除。冻结部分准备如上所述,沾Trichrome-Masson方法。在这种方法中,胶原纤维染色在蓝色,而心肌纤维被证明是红色和细胞核是穿着蓝黑色。疤痕形成胶原纤维沉积由定量分析评估。图像采集与DP73 BX53显微镜下进行CCD数码相机(奥林巴斯、东京、日本)。三个连续的横截面在中央层面选择每个心中的伤疤和胶原沉积使用cellSens条目量化软件(奥林巴斯、东京、日本)。疤痕大小的比例提出了胶原蛋白沉积区整个左心室的部分区域。一名调查员盲治疗进行分析。

2.13。超声心动图

MSC移植后4周,经胸廓的超声心动图研究进行麻醉的动物。左心室尺寸和功能评估使用12 MHz高频线性相控阵换能器(美国飞利浦SONOS 5500十分,WA)盲调查员。左心室舒张期结束维度(LVDd)和收缩维度(LVDs)来自两个维目标M-mode轮廓得到沿胸骨旁的极震区的左心室乳头肌水平。左心室射血分数(LVEF)、左心室部分缩短(LVFS)计算。所有测量和平均连续心脏周期执行。

2.14。统计分析

数据分析使用SPSS 12.0版Windows(美国SPSS,芝加哥,IL)。所有值都作为平均值±标准偏差(SD)。单向方差分析与图基的事后测试是用来比较数字数据在三个实验小组。数据集组成的两组学生的比较测试。一定程度的被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。EGFP和hBcl-xL表达转基因大鼠msc

对于转基因msc的跟踪,我们构建的表达载体pLenti6.3-IRES2 -EGFP和pLenti6.3 -hBcl-xL-IRES2 -EGFP(图1(一)),个人的表达EGFP作为跟踪标记为修改后的msc。评估EGFP的表达,野生型msc、vector-MSCs, hBcl-xL-MSCs被播种在6-well板和培养24小时。强信号检测到了EGFP vector-MSCs hBcl-xL-MSCs而没有信号中检测出野生型msc(数字1 (b)- - - - - -1 (g))。免疫印迹分析表明,在hBcl-xL-MSCs hBcl-xL的表达水平显著高于vector-MSCs和野生型msc(图1 (h)),这表明低水平的内源表达hBcl-xL msc。我们的研究结果表明,hBcl-xL-MSCs和vector-MSCs成功与EGFP标记,并与hBcl-xL hBcl-xL-MSCs被成功修改。

3.2。Immunophenotypic特性的转基因大鼠msc

表面标记表达式的转基因骨髓msc被FCM分析确定。结果表明:CD29、CD90和CD44 msc(图中高度表达2 (b)- - - - - -2 (d)),造血干细胞的标记,CD34(图2 (e))和CD45(图2 (f)),没有表达。这些表面标记物的表达模式是类似的主要培养的msc(见补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/176409)。这表明本研究没有改变细胞遗传操纵修改后的骨髓间充质干细胞的命运。

3.3。Bcl-xL修改msc对细胞凋亡的保护在体外

检查的凋亡能力hBcl-xL修改msc在体外野生型msc, vector-MSCs, hBcl-xL-MSCs处理200μM H₂O₂4小时。膜联蛋白V-FITC /(碘化propidium)πapoptosisassay进行评估细胞凋亡(数字3(一个)和3 (b))。结果表明,hBcl-xL-MSCs的凋亡率明显低于野生型msc和vector-MSCs(10%±0.82%和21%±0.37%和21%±0.13%,分别地。,)。这些结果表明,hBcl-xL修改可以保护msc在缺氧条件下对细胞凋亡。我们预计hBcl-xL修改也可以防止msc移植后细胞凋亡心肌梗塞。

3.4。Bcl-xL修改调节血管生成细胞因子在msc

血管生成是一个潜在的机制负责MSC移植的治疗效果。我们检查了MSC旁分泌血管生成细胞因子的分泌VEGF, igf - 1和PDGF。野生型msc、vector-MSCs hBcl-xL-MSCs常氧或缺氧条件下培养24小时。考察了细胞因子分泌酶联免疫吸附试验(ELISA)。结果表明,在常氧条件下,VEGF的分泌,igf - 1, PDGF hBcl-xL-MSCs都显著增加与野生型相比msc和vector-MSCs (VEGF增加:1.5 - -1.9倍,igf - 1、0.7 - -0.8倍和1.2 PDGF的-1.3倍,,)(数据4(一)- - - - - -4 (c)常氧)。为了应对缺氧,血管生成细胞因子分泌调节在所有三组。hBcl-xL-MSCs的低氧诱导细胞因子分泌远高于野生型msc和vector-MSCs (VEGF增加:0.6 - -0.7倍,0.5倍的igf - 1,为PDGF和1.1 -1.3倍,,)(数据4(一)- - - - - -4 (c)低氧)。这些结果表明,hBcl-xL基因改造可以大大提高MSC的血管生成能力,这可能提高MSC移植后缺血心肌血管生成。

3.5。Bcl-xL修改增加了msc移植到缺血心肌

评估的移植msc移植后缺血性心肌,左冠状动脉前降大鼠结扎模型建立。结扎后,对于每一个动物,完全,6×10⁶vector-MSCs或hBcl-xL-MSCs在培养基注入心肌梗塞的边境地带。媒介组注射培养基为同一地区。MSC移植的评价是进行细胞移植后1周、4周。冻结部分是由解剖心穿越的中层梗塞的面积。数据5(一个)- - - - - -5 (n)显示代表图像的移植msc的老鼠牺牲1周(数字5(一个)- - - - - -5 (f))或4周(数字5 (g)- - - - - -5 (n))以下vector-MSCs(数据5(一个)- - - - - -5 (c)和5 (g)- - - - - -5 (j))或hBcl-xL-MSCs(数字5 (d)- - - - - -5 (f)和5 (k)- - - - - -5 (n))移植。细胞核与DAPI染色(数字5(一个),5 (d),5 (g),5 (k))。移植msc EGFP探测到信号(数字5 (b),5 (e),5 (h),5(左))。因为EGFP的胞质分布,出现不规则的补丁,传播或与DAPI信号(平方地区数据5 (c),5 (f),5 (j),5 (n))。的心肌移植msc、心脏部分准备4周细胞注射后也沾anti-Troponin T (TnT)抗体,心肌细胞的标记(数字5(我)和5(米))。在每个微观领域,积分光密度(IOD) EGFP信号计算。MSC移植被表示为IOD和总细胞数的比值(图5 (o))。结果表明,1周和细胞移植4周后,移植msc hBcl-xL-MSC组的数量显著增加与vector-MSC组(1周增加:21.3%,13.2%在4周,,)(图5 (o))。这些结果表明,hBcl-xL基因改造可以显著增加msc移植后的移植。

3.6。Bcl-xL修改msc对细胞凋亡的保护在活的有机体内

MSC移植到缺血心肌的增加表明hBcl-xL修改MSC的凋亡效应在活的有机体内。评估的细胞保护作用hBcl-xL修改msc、细胞移植4周后,动物被牺牲和心脏冰冻切片准备如上所述。TUNEL分析进行,结果表明,在边境地带的心肌梗塞,hBcl-xL-MSC组的凋亡率显著低于中等组和vector-MSC组(31%±1.4%和52%±1.8%和42%±2.2%,分别地。,)(图6)。这些结果表明hBcl-xL修改可以防止msc移植后细胞凋亡在心肌梗塞。肯定和幸存的msc可以保护周围的心肌梗塞免受进一步的破坏,有利于心脏功能的恢复。

3.7。Bcl-xL修改msc促进血管生成和防止疤痕形成的梗塞的心

上面的在体外数据表明,低氧诱导细胞因子分泌物hBcl-xL-MSCs远高于野生型msc和vector-MSCs。因此,我们预计hBcl-xL基因改造的MSC可以改善MSC移植后缺血心肌血管生成。评估的血管生成能力hBcl-xL修改MSC、MSC移植后4周,毛细血管密度确定的边界区域的心肌梗塞的血管性血友病因子(vWF)染色(数字7(一)- - - - - -7 (c))。结果表明,毛细血管密度vector-MSC和hBcl-xL-MSC组明显高于在中组(和与13±1.1,船舶/高通滤波器,,)(图7 (g))。同时,毛细血管密度hBcl-xL-MSC组是31%高于vector-MSC集团(,)。这些结果表明,hBcl-xL改性可以显著提高msc的血管生成能力在活的有机体内从而有效地促进缺血心肌的血管再生。

疤痕形成,导致从透壁的心肌梗死动物模型的结果的一致性小伙子结扎。丰富的胶原蛋白沉积是疤痕形成的基础。在我们的动物模型,MSC移植后4周,心脏部分沾Trichrome-Masson方法评估疤痕形成(数字7 (d)- - - - - -7 (f))。在这种方法中,胶原纤维染色在蓝色,而心肌纤维染成红色,细胞核是穿着蓝黑色。分析了疤痕形成胶原蛋白沉积(图的定量评估7 (h))。与媒介集团(21.1%±1.1%)相比,vector-MSC和hBcl-xL-MSC组表现出较小的疤痕大小(15.1%±1.42%和11.07%±1.05%,分别地。,)。同时,胶原沉积hBcl-xL-MSC组是26.7%低于vector-MSC集团()。结果表明,hBcl-xL修改msc可以有效地防止疤痕形成梗塞的心肌。

3.8。Bcl-xL修改msc促进功能恢复的梗塞的心

评估心脏功能恢复的程度,MSC移植4周后,经胸廓的超声心动图研究进行麻醉动物(表1)。与假组相比,收缩功能受损后,其他三组心脏梗塞。vector-MSCs和hBcl-xL-MSCs的移植到心肌梗塞能改善左心室功能。然而,hBcl-xL-MSC组心脏功能恢复的程度远远高于vector-MSC组。

4所示。讨论

来自成人骨髓msc已成为一种很有前途的细胞来源的细胞治疗心肌梗塞。然而,嫁接成活率低的msc严重抑制细胞移植的治疗效果针对心肌细胞修复。在这项研究中,我们证明了hBcl-xL基因改造可以提高生存和msc的生物功能在体外和在活的有机体内。在缺氧条件下,hBcl-xL修改可以保护msc对细胞凋亡和促进VEGF的分泌,igf - 1和PDGF。在小伙子结扎动物模型中,hBcl-xL修改显著增加存活率和msc移植后的移植。和移植hBcl-xL-MSCs有效阻止疤痕形成和改善心肌梗死后心脏功能的恢复。这些观察结果与此前公布的数据,在协议的表达hBcl-xL在大鼠心脏可以抑制缺血性心肌梗死后心肌细胞的凋亡,可以延长冷保存时间对心脏移植13,14]。目前的研究显示,基因改造的msc hBcl-xL基因可能是一个有趣的策略来改善msc移植后缺血性心脏的可行性,从而导致更好的治疗心肌梗死的治疗结果。

hBcl-xL-MSCs的精确的潜在机制介导的功能恢复心脏梗塞的尚不清楚。这是显示原位植入细胞的存活率密切相关的治疗疗效msc (12]。先前的研究表明,msc移植后的存活率低梗塞的心是由多种因素造成的,包括缺乏氧气,营养,和生存因素、炎症反应、宿主的免疫排斥,proapoptotic和细胞毒性因子的存在,和缺血再灌注(I / R)损伤导致重复缺血(3,10,15,16]。最近,据报道,Fas-Fas配体(FasL)宿主缺血性心肌细胞之间的相互作用和移植msc负责激活细胞死亡信号在移植msc (17]。这种交互的抑制可能下调proapoptotic蛋白质的表达包括caspase-8 caspase-3,伯灵顿,细胞色素c和提高细胞存活率和恢复心脏功能(17]。这些观察表明,Fas-dependent和mitochondria-dependent凋亡通路参与移植msc在梗塞的心中的死亡。这是证明凋亡Bcl-xL扮演重要角色在外部和内部细胞凋亡通路。与伯灵顿Bcl-xL可以绑定,防止从线粒体细胞色素c的释放,然后还存在防止下游激活(18]。Fas和肿瘤坏死因子受体诱导细胞凋亡可能是抑制过度的Bcl-xL [19,20.]。Bcl-xL修改这些数据支持一个模型促进功能恢复梗塞的心通过增加移植的存活率msc通过抑制Fas和mitochondria-dependent凋亡通路。需要进行进一步的研究来解决这个假设。

是一种多功能干细胞,可以诱导msc分化成各种细胞系包括心肌细胞(3和内皮细胞12,21]。然而,一些证据表明,代替MSC分化转化成心肌细胞或内皮细胞生存的旁分泌和血管生成因素MSC扮演了主要角色在治疗心脏梗塞的MSC移植(12,16,22]。据报道,移植msc可以分泌多种生长因子,细胞因子,趋化因子,VEGF、IGF, PDGF,肝细胞生长因子(HGF),基质细胞衍生因子- 1 (SDF-1),基本成纤维细胞生长因子(bFGF), interleukine-1 (il - 1)12,23- - - - - -25]。这些因素已经显示功能的改进作出贡献的梗塞的心通过促进血管生成和细胞生存和防止心肌重构(23,25- - - - - -28]。在我们的研究中,超表达的hBcl-xL显著增加VEGF的分泌,igf - 1, PDGF在缺氧条件下大鼠骨髓msc。这一发现与先前报道的数据整合中bcl - 2基因可以在植入msc移植VEGF的分泌,改善急性心肌梗死后心脏功能恢复(12]。这些数据表明hBcl-xL-MSCs的心血管效应可能至少部分归因于高水平的旁分泌因子表达式。

hBcl-xL背后的机制介导的细胞因子分泌upregulation msc还不清楚。我们的研究和之前的数据25证实,作为主要病理条件缺血性心、缺氧可能提高VEGF的表达和其他细胞因子在msc。据报道,bcl - 2超表达可以有效提高低氧诱导VEGF mRNA的稳定性(29日]。和治疗黑色素瘤细胞与bcl - 2 / Bcl-xL双特异性反义寡核苷酸导致低氧诱导VEGF分泌的减少30.]。这些数据表明,bcl - 2和Bcl-xL在低氧诱导细胞因子分泌的调节中扮演角色。

低氧诱导细胞因子分泌被证明是由heterodimeric基本helix-loop-helix转录因子,低氧诱导因子(HIF) (31日]。缺氧可以诱导低氧诱导因子表达通过抑制其[泛素化和降解32]。缺血低氧诱导因子在反应中起着关键作用。HIF-1可以移植血管生成细胞因子的表达通过磷脂酰肌醇3-kinase (PI3K) /促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路33]。此外,HIF-1可以反向诱导细胞凋亡是移植bcl - 2表达(31日]。和HIF-1直接监管Bcl-xL转录通过绑定hypoxia-responsive元素()一定是Bcl-xL启动子(34]。相反,bcl - 2表达的蛋白质含量和VEGF-promoter绑定活动增加HIF-1 [29日]。在这里,我们推测Bcl-xL协同作用形成一个正反馈循环与低氧诱导因子的细胞对缺氧的反应。还需要进一步的研究来阐明这一假设。

综上所述,我们的研究证实,Bcl-xL基因改造可以提高生存和低氧诱导细胞因子分泌道msc,从而促进心脏梗塞的功能恢复。Bcl-xL工程msc移植可能提供一个有效的方法治疗心脏梗塞。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

小东雪和Yu刘同样对本文亦有贡献。

确认

这项研究是由中国国家自然科学基金(批准号81071267,北京,中国)。作者感谢燕沈,Zhejun张,淮河宏鑫Wang Lan技术援助。

补充材料

引用

1. m . f . Pittenger a . m .麦凯s c·贝克et al .,“Multilineage成年人类间充质干细胞的潜力。”科学,卷284,不。5411年,第147 - 143页,1999年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. g·法拉利,g . Cusella-De旧金山,m . colletta et al .,“肌肉再生骨骨髓来源肌原性的祖细胞,”科学,卷279,不。5356年,第1530 - 1528页,1998年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. c·托马·m·f·Pittenger k . s .卡希尔,b·j·伯恩和p·d·凯斯勒,“人类间充质干细胞分化为心肌细胞表型在成年小鼠的心脏,”循环,卷105,不。1,第98 - 93页,2002。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. a . Piryaei m . r . Valojerdi m . Shahsavani和h . Baharvand“骨骨髓来源间充质干细胞的分化成hepatocyte-like细胞对纳米纤维及其移植到碳tetrachloride-induced肝纤维化模型,”干细胞的评论和报道,7卷,不。1,第118 - 103页,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. m . y . j . Chen Li l . Wang, x,和m . Chopp“颅内移植的治疗中获益的脑缺血大鼠骨髓基质细胞后,“神经科学杂志》上,卷189,不。1 - 2,49-57,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. 贝博·m·a·j·m·索雷尔,ai Caplan,“成人间充质干细胞在体外的影响血管的形成,”组织工程部分,15卷,不。7,1751 - 1761年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. c . Pontikoglou f . Deschaseaux l . Sensebe, h·a·Papadaki“骨髓间充质干细胞:生物属性和他们的角色在造血和造血干细胞移植,”干细胞的评论和报道,7卷,不。3、569 - 589年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. f . Djouad p . Plence c .骨et al .,“间充质干细胞的免疫抑制效应有利于肿瘤生长在异种动物,”血,卷102,不。10日,3837 - 3844年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. k·勒布朗,c . Tammik k . Rosendahl e . Zetterberg和o . Ringden”HLA表达和分化和未分化的间充质干细胞的免疫特性,”实验血液学没有,卷。31日。10日,890 - 896年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. m, d·玛索诉大伯,y Fujio, k·沃尔什和c·e·默里,“心脏的心肌细胞移植修复:移植细胞死亡和anti-death策略,”分子和细胞心脏病学杂志》上,33卷,不。5,907 - 921年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. l .迷林c, s .卓et al .,”移植与survivin-engineered间充质干细胞在更好的预后结果大鼠心肌梗死模型,”欧洲心脏病杂志》上,11卷,不。11日,第1030 - 1023页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. w·李:妈,l·l·昂et al .,“bcl - 2工程msc抑制细胞凋亡,改善心脏功能,“干细胞,25卷,不。8,2118 - 2127年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. 黄j . y .伊藤m . Morikawa et al .,“Bcl-xL基因转移保护心脏免受缺血/再灌注损伤,”生物化学和生物物理研究通信,卷311,不。1,第70 - 64页,2003。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. 黄j . k .中村y Ito et al .,“Bcl-xL基因转移抑制伯灵顿易位,延长心脏冷保存时间在老鼠,”循环,卷112,不。1,第83 - 76页,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. Y.-J。耿:“心血管干细胞凋亡的分子机制和增长的心与动脉粥样硬化冠状动脉疾病和缺血性心力衰竭,”纽约科学院上卷,1010年,第697 - 687页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. y l . Tang y, y . c .张钱k, l .沈和菲利普斯,“改善移植间充质干细胞生存与受缺氧缺血性心脏血红素oxygenase-1向量,”美国心脏病学会杂志》上,46卷,不。7,1339 - 1350年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. 和b . w . o .火腿,s . y . Lee的歌,“调制Fas-Fas配体相互作用恢复低氧诱导细胞凋亡的间充质干细胞在脑缺血心肌,”细胞移植。在出版社。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. j·c·里德“bcl - 2家族蛋白”,致癌基因,17卷,不。25日,第3236 - 3225页,1998年。视图:谷歌学术搜索
19. h·巴姨,k . Chen y。高et al .,”Bcl-xL提高单细胞生存和扩张的人类胚胎干细胞而不影响自我更新,“干细胞研究,8卷,不。1,26-37,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. f·a·斯里尼瓦桑,a . Wong et al .,“Bcl-x (L)函数的下游caspase-8抑制Fas和肿瘤坏死因子受体1-induced乳腺癌MCF7细胞的凋亡细胞,”《生物化学》杂志上,卷273,不。8,4523 - 4529年,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. b . c . j . Liu Liu太阳et al .,”兔子骨骼间充质干细胞的分化成内皮细胞在体外和体内促进有缺陷的骨再生,”细胞生物化学和生物物理学,卷68,不。3、479 - 487年,2014页。视图:谷歌学术搜索
22. m . Gnecchi h .他梁o . d . et al .,“旁分泌作用占显著保护缺血性心Akt-modified间充质干细胞,”自然医学,11卷,不。4、367 - 368年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. x y l .唐问:赵,秦et al .,“旁分泌作用增强的影响自体间充质干细胞移植对心肌梗死大鼠模型血管再生,”胸外科的史册,卷80,不。1,第237 - 229页,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. y s Yoon老爷车,l . Heyd et al .,“无性繁殖系地扩大小说从人类骨髓多能干细胞再生心肌梗死后心肌,”临床研究杂志,卷115,不。2、326 - 338年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. m .高桥,t·s·艾。李,r·铃木等。“骨髓细胞产生的细胞因子可以促进功能改善梗塞的心脏缺血性损伤的保护心肌细胞,”美国生理学杂志》:心脏和循环系统的生理机能,卷291,不。2,H886-H893, 2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. b . m . s . Tang Redfors, m . Lindbom et al .,“循环igf - 1对正常心脏形态学的重要性、功能和梗死后重建,”生长激素和IGF研究,22卷,不。6,206 - 211年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. 人类。唐,J.-N。王,l . Zhang et al。”VEGF / SDF-1促进心脏干细胞动员和心脏梗塞的心肌修复,”心血管研究,卷91,不。3、402 - 411年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. x y . Tang甘,r . Cheheltani et al .,”目标的血管内皮生长因子提高干细胞疗法在大鼠心肌梗死模型中,“纳米医学:纳米技术、生物学和医学,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. a . Iervolino d . Trisciuoglio d Ribatti et al .,“bcl - 2超表达通过VEGF mRNA在人黑色素瘤细胞增加血管生成稳定和HIF-1-mediated转录活动,“美国实验生物学学会联合会杂志,16卷,不。11日,第1455 - 1453页,2002年。视图:谷歌学术搜索
30. d . del Bufalo d . Trisciuoglio m . Scarsella Zangemeister-Wittke,和g . Zupi”治疗黑色素瘤细胞与bcl - 2 / bcl-xL反义寡核苷酸诱导抗血管新生活动,“致癌基因,22卷,不。52岁,8441 - 8447年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. 杨,k .他f .郑et al .,”表达的低氧诱导因子- 1α在体外保护心脏成纤维细胞的低氧诱导细胞凋亡,”心血管医学杂志》,15卷,不。7,579 - 586年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. r .福田k .大臣f .粉丝,y·d·荣格,l·m·埃利斯和g . l .西门“胰岛素样生长因子1诱发低氧诱导因子1-mediated血管内皮生长因子表达,这是依赖于MAP激酶和磷脂酰肌醇3-kinase信号在结肠癌细胞中,“生物化学杂志,卷277,不。41岁,38205 - 38211年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. h·d·斯金纳j . z郑j .方f . Agani, B.-H。江”,血管内皮生长因子转录激活是由低氧诱导因子1α、HDM2 p70S6K1针对磷脂酰肌醇3-kinase / AKT信号,”《生物化学》杂志上,卷279,不。44岁,45643 - 45651年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. n .陈,陈x,黄r . et al .,“BCL-xL是在低氧诱导因子- 1基因调控目标α”,《生物化学》杂志上,卷284,不。15日,第10012 - 10004页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2015小东雪等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。