1。介绍
细胞移植已成为一种很有前途的治疗方法对心肌梗死后心脏功能的恢复。骨髓间充质干细胞(msc)是自我更新,多功能的前身nonhematopoietic基质组织。在适当的条件下,可以诱导msc分化成多个细胞系,包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞
1 ],骨骼肌细胞[
2 ),心肌细胞(
3 ),肝细胞(
4 ),和神经细胞
5 ]。msc被证明能够促进血管生成和缺血性心肌细胞通过旁分泌的生存生产各种细胞因子(
6 ,
7 ]。此外,结果表明,msc免疫抑制有利于抑制炎症反应和受伤的心脏组织未来的纤维化(
8 ,
9 ]。msc可以很容易地从骨髓和脂肪组织分离和扩展
在体外 基于能力坚持文化的菜肴。因此,msc似乎是一个吸引人的细胞移植治疗心肌梗死的源头。
然而,移植后几天内,msc的低存活率从有害的微环境发生缺血、炎症反应和proapoptotic因素严重抑制心肌细胞修复的治疗效果(
3 ,
10 ]。因此,有必要加强msc改善细胞疗法的疗效。证据表明,转基因msc与生存的
11 ]或凋亡[
12 )基因可以提高移植msc的可行性和结果在一个更好的归航的msc缺血性微环境,从而提高急性心肌梗死后的心脏功能恢复。
Bcl-xL和bcl - 2细胞凋亡有重要的调控作用,两者都属于bcl - 2蛋白家族。这是证明人类Bcl-xL adenoviral介导表达(hBcl-xL)可以抑制基因的老鼠心脏缺血性心肌梗死后心肌细胞凋亡和冷保存时间可延长心脏移植(
13 ,
14 ]。同时,据报道,bcl - 2过表达基因可以保护msc对细胞凋亡在缺氧条件下
在体外 和
在活的有机体内 和bcl - 2基因工程的移植msc可以改善急性心肌梗死后心脏功能恢复(
12 ]。因此,它是合理的推测,在msc Bcl-xL基因的超表达也可能改善移植msc的可行性,并帮助恢复心肌梗死后心脏功能。
在这项研究中,我们过表达hBcl-xL基因在成年大鼠骨髓msc为了提高他们的生存与颓废的缺血性心肌梗死后微环境。我们提出,基因改造的msc hBcl-xL基因可以帮助改善的可行性msc移植后到缺血性心脏,从而导致一个更好的治疗对急性心肌梗死的影响。
2。材料和方法
2.1。重组慢病毒结构
构建慢病毒表达载体pLenti6.3-IRES2 -
EGFP ,内部核糖体进入站点的编码序列(IRES -)增强型绿色荧光蛋白(EGFP)插入
Xho 我网站下游pLenti6.3 multiclonal网站(MCS)地区的巨细胞病毒/ V5桌子(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。生成表达载体pLenti6.3 -
hBcl-xL -IRES2 -
EGFP ,703个基点PCR产品hBcl-xL cDNA侧面的
Asc 我和一个
中外职业 我限制网站在5′和3′端,分别是在帧插入同样切向量pLenti6.3-IRES2 -
EGFP 的控制下人类巨细胞病毒(CMV)启动子。科扎共识翻译起始位点立即开始之前添加了密码子hBcl-xL编码序列的真核细胞进一步提高翻译效率。在这个向量,IRES的编码区可能会导致个人的表达EGFP的表达一起hBcl-xL转导细胞。
2.2。细胞转导
Sprague-Dawley (SD)大鼠骨髓msc (Cyagen生物科技、广州、中国)被播种到6-well盘子和低葡萄糖杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM-LG)(美国纽约Gibco,格兰德岛)补充10%胎牛血清(Gibco, Mulgrave,维克,澳大利亚),100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升。细胞汇合的50%时,重组慢病毒建设pLenti6.3 -
hBcl-xL -IRES2 -
EGFP 和空向量pLenti6.3-IRES2 -
EGFP 分别添加到培养基莫伊= 50。转导进行24 h在37°C;然后中吸气,“(分泌物)颗粒细胞培养的新媒介。通过添加1稳定转导细胞被选中
μ g / mL杀稻瘟菌素(美国马Calbiochem, Billerica)到培养基中。
2.3。细胞成像
5×105 从每个群野生型细胞msc、vector-MSC, hBcl-xL-MSC被播种到6-well板在37°C和培养24小时。细胞检查下IX81倒置显微镜(奥林巴斯、东京、日本)和照片都被使用DP73 CCD数码相机(奥林巴斯、东京、日本)。
2.4。免疫印迹分析
细胞治疗里帕裂解缓冲(50毫米Tris-HCl (pH值7.4),150毫米氯化钠,特里同x - 100 1%, 1%钠脱氧胆酸盐,0.1%十二烷基硫酸钠,2毫米焦磷酸钠,25毫米
β 甘油磷酸酯1毫米EDTA 1毫米Na3 签证官4 和0.5
μ g / mL亮抑酶肽)。样品的蛋白质含量是决定使用皮尔斯BCA蛋白质分析工具包(美国热科学,罗克福德,IL)。蛋白质是解决了10 - 13%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和转移到0.22
μ m聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)(美国马EMD微孔,Billerica)和探测与第一抗体在4°C过夜,然后清洗和孵化与辣根过氧化物酶共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)在室温下1小时。反应乐队被SuperSignal Pico西部开发和增强化学发光检测试剂根据制造商的指示(美国热科学,罗克福德,IL)。第一抗体使用兔子anti-Bcl-xL多克隆抗体(美国细胞信号技术,波士顿,MA),多克隆兔anti-cleaved caspase-3抗体(美国细胞信号技术,波士顿,MA),多克隆兔anti-GAPDH抗体(Bioworld科技,圣路易斯公园、锰、美国)(加载控制)和兔多克隆抗
β 肌动蛋白抗体(Bioworld科技、圣路易斯公园、锰、美国)(加载控制)。
2.5。Immunophenotypic表征
细胞与PBS冲洗两次,使胰蛋白酶化,在200×g离心5分钟然后在500毫升resuspended PBS。大约5×105 细胞每100毫升标有主要鼠抗体鼠CD29, CD90、CD44、CD34、CD45在4°C 30分钟,洗净。分析了标记细胞与BD FASAria细胞分选仪(美国加利福尼亚州圣何塞Beckton迪金森,)。在这个实验中使用的抗体CD29-FITC, CD90-FITC, CD44-FITC, CD34-FITC, CD45-FITC(美国加利福尼亚州圣何塞Beckton迪金森,)。鼠标IgG1-FITC(美国加利福尼亚州圣何塞Beckton迪金森,)是用作控制同形像。
2.6。膜联蛋白V / Propidium碘(π)流式细胞术分析
1×106 从每个群野生型细胞msc、vector-MSC, hBcl-xL-MSC被播种到T25烧瓶,与200年在培养基培养
μ M PERDROGEN (H2 O2 )(σ,圣克拉拉、钙、美国)4小时37°C。H后2 O2 治疗,膜联蛋白V /π细胞凋亡测定了用膜联蛋白V-FITC凋亡检测装备我(美国加利福尼亚州圣何塞Beckton迪金森,)。短暂,细胞被收集和清洗在磷酸缓冲盐(PBS)然后resuspended两倍于500年
μ L绑定缓冲。resuspended细胞被孵化的膜联蛋白V-FITC和π为15分钟,检查BD FASAria细胞分选仪(美国加利福尼亚州圣何塞Beckton迪金森,)。
2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)
msc在常氧条件下培养的95%的空气和5%的二氧化碳或缺氧条件95%的氮气和5%氧气在37°C 24小时。评估的分泌血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)和plate-derived生长因子(PDGF)的条件培养基收集野生型msc、vector-MSCs, hBcl-xL-MSCs,分别使用VEGF和ELISA进行鼠酶联免疫试剂盒(Abcam,剑桥,剑桥郡swavesey村庄,英国),PDGF-AA鼠酶联免疫试剂盒(Abcam,剑桥,剑桥郡swavesey村庄,英国),和igf - 1鼠酶联免疫试剂盒(Abnova、台北、台湾)根据制造商的协议。每个样品的光学密度(OD)值是读取一个elx - 800吸光度标仪(美国Biotek Winooski, VT)与三甲空的控制和调整。每个样本的浓度是根据标准曲线计算。
2.8。心肌梗死和MSC移植
所有的动物治疗根据指南发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生研究院(NIH出版物编号为85 - 23,1996年修订)和所有动物协议的动物保健和使用委员会批准沈阳军区总医院,沈阳、中国。雄性SD大鼠体重280克到300克被分为三组(vector-MSC集团中等组和hBcl-xL-MSC集团)。老鼠麻醉通过腹腔内注射戊巴比妥(50毫克/公斤),插管通过气管插管,机械通风。左侧开胸。小伙子的近端部分动脉的结扎了6 - 0缝线(美国新泽西州Ethicon,萨默维尔市)缝合。结扎后不久,一个苍白的区域在左心室(LV)的前壁指示成功的梗塞。结扎后,动物收到六subepicardial注射vector-MSCs hBcl-xL-MSCs梗死周围地区。对于每一个注,1×106 细胞悬浮在50
μ L培养基,注入到1.0毫米宽边界区域周围的心肌梗死(认为是边界区)31-gauge针(美国加利福尼亚州圣何塞Beckton迪金森,)。媒介组注射培养基为同一地区。的假针灸组没有小伙子结扎左侧开胸。肌肉注射青霉素G苄星青霉素(100000 U /公斤)是用来防止感染。
2.9。测定细胞移植
一个或MSC移植后4周,动物被牺牲和心脏解剖。从每个心,五个冻结部分准备穿越的中层梗塞的面积。部分都是固定在PBS冰冷的丙酮和清洗。心部分在移植后1周直接安装与延长黄金不变色试剂4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI)(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和后期的心脏部分沾多克隆兔anti-Troponin T (TnT)抗体(美国细胞信号技术,波士顿,MA)和Cy3共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX),然后安装与DAPI延长黄金不变色试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。所有部分FV1000S-SIM / IX81共焦显微镜下观察(奥林巴斯、东京、日本)。对于每个部分,10大功率领域(高通滤波器400 x)边界区内随机选择和数字拍照。定量分析的细胞移植与cellSens条目执行软件(奥林巴斯、东京、日本)。积分光密度(IOD) EGFP信号和总细胞数在每个微观领域提出了计算和细胞移植IOD和总细胞数的比率。一名调查员盲治疗进行分析。
2.10。体内<斜体> < /斜体> TUNEL检测
MSC移植后4周,动物被牺牲和心脏解剖。冻结部分准备从每个心穿越中层梗塞的地区。TUNEL分析进行如上所述和细胞核被苏木精复染色。对于每个幻灯片,彩色图像的10个随机选择大功率领域(高通滤波器200 x)边界区内被捕和数字化BX53显微镜下DP73 CCD数码相机(奥林巴斯、东京、日本)。图像分析的侦探被蒙蔽的MSC治疗。TUNEL-positive核标记细胞被定义为有明确的棕色。在每个图像,棕色细胞核的面积(面积布朗 )和总细胞核的面积(面积总 )计算。凋亡指数表示为面积的比值布朗 和区域总 。
2.11。评价毛细血管密度
量化的毛细血管密度,MSC移植后4周,冰冻切片是由心如前所述解剖和沾多克隆兔anti-von血友病因子(vWF)抗体(美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)和辣根过氧化物酶共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(美国德克萨斯州圣克鲁斯生物技术、达拉斯)。细胞核被苏木精复染色。BX53显微镜下微观照片被抓获,DP73 CCD数码相机(奥林巴斯、东京、日本)。毛细血管密度分析了一个侦探被蒙蔽对MSC治疗。正面彩色随机选择大功率的10个领域里的毛细血管被数(高通滤波器400 x)边界区内5部分/动物。和毛细血管密度提出了船舶的平均数量/大功率领域。
2.12。评价梗死大小
MSC移植后4周,动物牺牲,心被移除。冻结部分准备如上所述,沾Trichrome-Masson方法。在这种方法中,胶原纤维染色在蓝色,而心肌纤维被证明是红色和细胞核是穿着蓝黑色。疤痕形成胶原纤维沉积由定量分析评估。图像采集与DP73 BX53显微镜下进行CCD数码相机(奥林巴斯、东京、日本)。三个连续的横截面在中央层面选择每个心中的伤疤和胶原沉积使用cellSens条目量化软件(奥林巴斯、东京、日本)。疤痕大小的比例提出了胶原蛋白沉积区整个左心室的部分区域。一名调查员盲治疗进行分析。
2.13。超声心动图
MSC移植后4周,经胸廓的超声心动图研究进行麻醉的动物。左心室尺寸和功能评估使用12 MHz高频线性相控阵换能器(美国飞利浦SONOS 5500十分,WA)盲调查员。左心室舒张期结束维度(LVDd)和收缩维度(LVDs)来自两个维目标M-mode轮廓得到沿胸骨旁的极震区的左心室乳头肌水平。左心室射血分数(LVEF)、左心室部分缩短(LVFS)计算。所有测量和平均连续心脏周期执行。
2.14。统计分析
数据分析使用SPSS 12.0版Windows(美国SPSS,芝加哥,IL)。所有值都作为平均值±标准偏差(SD)。单向方差分析与图基的事后测试是用来比较数字数据在三个实验小组。数据集组成的两组学生的比较
t
测试。一定程度的
P
<
0
。
05年
被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。EGFP和hBcl-xL表达转基因大鼠msc
对于转基因msc的跟踪,我们构建的表达载体pLenti6.3-IRES2 -
EGFP 和pLenti6.3 -
hBcl-xL -IRES2 -
EGFP (图
1(一) ),个人的表达EGFP作为跟踪标记为修改后的msc。评估EGFP的表达,野生型msc、vector-MSCs, hBcl-xL-MSCs被播种在6-well板和培养24小时。强信号检测到了EGFP vector-MSCs hBcl-xL-MSCs而没有信号中检测出野生型msc(数字
1 (b) - - - - - -
1 (g) )。免疫印迹分析表明,在hBcl-xL-MSCs hBcl-xL的表达水平显著高于vector-MSCs和野生型msc(图
1 (h) ),这表明低水平的内源表达hBcl-xL msc。我们的研究结果表明,hBcl-xL-MSCs和vector-MSCs成功与EGFP标记,并与hBcl-xL hBcl-xL-MSCs被成功修改。
图1
EGFP的表达和hBcl-xL鼠骨髓msc。(a)的示意图表示编码区域的病毒载体pLenti6.3-IRES-EGFP pLenti6.3-hBcl-xL-IRES-EGFP。在向量pLenti6.3-hBcl-xL-IRES-EGFP, IRES的插入可能导致个人的表达EGFP的表达一起hBcl-xL转导细胞。所有的表情都由CMV启动子驱动的。((b) - (g))的表达EGFP在野生型msc ((b)和(c)), vector-MSCs ((d)和(e)),和hBcl-xL-MSCs ((f)和(g))。(h)的免疫印迹分析表达式的hBcl-xL msc、vector-MSCs, hBcl-xL-MSCs。数据是代表三个独立的实验。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
(g)
![]()
(h)
![]()
3.2。Immunophenotypic特性的转基因大鼠msc
表面标记表达式的转基因骨髓msc被FCM分析确定。结果表明:CD29、CD90和CD44 msc(图中高度表达
2 (b) - - - - - -
2 (d) ),造血干细胞的标记,CD34(图
2 (e) )和CD45(图
2 (f) ),没有表达。这些表面标记物的表达模式是类似的主要培养的msc(见补充图1在网上补充材料
http://dx.doi.org/10.1155/2015/176409 )。这表明本研究没有改变细胞遗传操纵修改后的骨髓间充质干细胞的命运。
图2
表面标记的表达转基因大鼠msc。选定的表达式的表面标记修改msc被流式细胞术分析。老鼠IgG1作为同形像控制(a);在转基因msc、CD29, CD90和CD44高度表达((b) - (d)),造血干细胞的标记,CD34、CD45并不表示((e)和(f))。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
3.3。Bcl-xL修改保护msc在体外对细胞凋亡<斜体> < /斜体>
检查的凋亡能力hBcl-xL修改msc
在体外 野生型msc, vector-MSCs, hBcl-xL-MSCs处理200
μ M H2 O2 4小时。膜联蛋白V-FITC /(碘化propidium)πapoptosisassay进行评估细胞凋亡(数字
3(一个) 和
3 (b) )。结果表明,hBcl-xL-MSCs的凋亡率明显低于野生型msc和vector-MSCs(10%±0.82%和21%±0.37%和21%±0.13%,分别地。
n
=
3
,
P
<
0.05
)。这些结果表明,hBcl-xL修改可以保护msc在缺氧条件下对细胞凋亡。我们预计hBcl-xL修改也可以防止msc移植后细胞凋亡心肌梗塞。
图3
凋亡的影响hBcl-xL-MSCs
在体外 。(一)膜联蛋白V-FITC /πapoptosisassay野生型的msc、vector-MSCs, hBcl-xL-MSCs。细胞被播种到T25烧瓶,与200年在培养基培养
μ M H2 O2 在37°C为4个小时。resuspended细胞被孵化的膜联蛋白V-FITC和π为15分钟,检查BD FASAria细胞分选仪。(b)凋亡率提出了平均数±标准差(
n
=
3
,
∗
P
<
0.0
5
)。PI: propidium碘。
(一)
![]()
(b)
![]()
3.4。Bcl-xL修改调节血管生成细胞因子在msc
血管生成是一个潜在的机制负责MSC移植的治疗效果。我们检查了MSC旁分泌血管生成细胞因子的分泌VEGF, igf - 1和PDGF。野生型msc、vector-MSCs hBcl-xL-MSCs常氧或缺氧条件下培养24小时。考察了细胞因子分泌酶联免疫吸附试验(ELISA)。结果表明,在常氧条件下,VEGF的分泌,igf - 1, PDGF hBcl-xL-MSCs都显著增加与野生型相比msc和vector-MSCs (VEGF增加:1.5 - -1.9倍,igf - 1、0.7 - -0.8倍和1.2 PDGF的-1.3倍,
n
=
3
,
P
<
0.05
)(数据
4(一) - - - - - -
4 (c) 常氧)。为了应对缺氧,血管生成细胞因子分泌调节在所有三组。hBcl-xL-MSCs的低氧诱导细胞因子分泌远高于野生型msc和vector-MSCs (VEGF增加:0.6 - -0.7倍,0.5倍的igf - 1,为PDGF和1.1 -1.3倍,
n
=
3
,
P
<
0.05
)(数据
4(一) - - - - - -
4 (c) 低氧)。这些结果表明,hBcl-xL基因改造可以大大提高MSC的血管生成能力,这可能提高MSC移植后缺血心肌血管生成。
图4
Upregulation hBcl-xL-MSCs的血管生成因子。((一)- (c))评估旁分泌VEGF的分泌(a), igf - 1 (b),和PDGF (c)野生型msc(浅灰色栏),vector-MSCs(深灰色栏)和hBcl-xL-MSCs(黑条)。细胞培养在常氧或缺氧条件下24小时的条件培养基收集ELISA。集中值均值±SD (
n
=
3
,
∗
P
<
0.001
)。VEGF:血管内皮生长因子;igf - 1:胰岛素样生长因子- 1;PDGF: plate-derived生长因子。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
3.5。Bcl-xL修改增加了msc移植到缺血心肌
评估的移植msc移植后缺血性心肌,左冠状动脉前降大鼠结扎模型建立。结扎后,对于每一个动物,完全,6×106 vector-MSCs或hBcl-xL-MSCs在培养基注入心肌梗塞的边境地带。媒介组注射培养基为同一地区。MSC移植的评价是进行细胞移植后1周、4周。冻结部分是由解剖心穿越的中层梗塞的面积。数据
5(一个) - - - - - -
5 (n) 显示代表图像的移植msc的老鼠牺牲1周(数字
5(一个) - - - - - -
5 (f) )或4周(数字
5 (g) - - - - - -
5 (n) )以下vector-MSCs(数据
5(一个) - - - - - -
5 (c) 和
5 (g) - - - - - -
5 (j) )或hBcl-xL-MSCs(数字
5 (d) - - - - - -
5 (f) 和
5 (k) - - - - - -
5 (n) )移植。细胞核与DAPI染色(数字
5(一个) ,
5 (d) ,
5 (g) ,
5 (k) )。移植msc EGFP探测到信号(数字
5 (b) ,
5 (e) ,
5 (h) ,
5(左) )。因为EGFP的胞质分布,出现不规则的补丁,传播或与DAPI信号(平方地区数据
5 (c) ,
5 (f) ,
5 (j) ,
5 (n) )。的心肌移植msc、心脏部分准备4周细胞注射后也沾anti-Troponin T (TnT)抗体,心肌细胞的标记(数字
5(我) 和
5(米) )。在每个微观领域,积分光密度(IOD) EGFP信号计算。MSC移植被表示为IOD和总细胞数的比值(图
5 (o) )。结果表明,1周和细胞移植4周后,移植msc hBcl-xL-MSC组的数量显著增加与vector-MSC组(1周增加:21.3%,13.2%在4周,
n
=
6
,
P
<
0.01
)(图
5 (o) )。这些结果表明,hBcl-xL基因改造可以显著增加msc移植后的移植。
图5
移植msc移植到心肌梗塞。((一)- (n))评价MSC移植到缺血心肌在1周((一)——(f))和4周后((g) - (n)) vector-MSCs ((a) - (c)和(g) - (j))或hBcl-xL-MSCs ((d) - (f)和(k) - (n))移植。细胞核与DAPI染色((a)、(d) (g)和(k))。移植msc EGFP探测到信号((b)、(e)、(h)和(l))也出现不规则的补丁将EGFP的胞质分布。扩大的平方(c)地区,(f), (j)和(n)表明EGFP的MSC移植来说信号与DAPI。显示了心肌肌钙蛋白T染色细胞注射后4周((i)和(m))。(o)在vector-MSC MSC移植组(深灰色栏)和hBcl-xL-MSC组(黑条)提出了IOD和总细胞数的比例/高通滤波器。值意味着±SD (
n
=
6
,
∗
P
<
0.01
)。EGFP:增强型绿色荧光蛋白;DAPI: 4, 6-diamino-2-phenyl吲哚;IOD:积分光密度;高通滤波器:大功率领域。比例尺代表50
μ m (c)和30
μ 分别(j)。
(一)
![]()
(b)
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(c)
![]()
(d)
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(e)
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(f)
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(g)
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(h)
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(我)
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(j)
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(k)
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(左)
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(m)
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(n)
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(o)
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3.6。Bcl-xL修改保护msc对体内细胞凋亡<斜体> < /斜体>
MSC移植到缺血心肌的增加表明hBcl-xL修改MSC的凋亡效应
在活的有机体内 。评估的细胞保护作用hBcl-xL修改msc、细胞移植4周后,动物被牺牲和心脏冰冻切片准备如上所述。TUNEL分析进行,结果表明,在边境地带的心肌梗塞,hBcl-xL-MSC组的凋亡率显著低于中等组和vector-MSC组(31%±1.4%和52%±1.8%和42%±2.2%,分别地。
n
=
6
,
P
<
0.001
)(图
6 )。这些结果表明hBcl-xL修改可以防止msc移植后细胞凋亡在心肌梗塞。肯定和幸存的msc可以保护周围的心肌梗塞免受进一步的破坏,有利于心脏功能的恢复。
图6
凋亡的影响hBcl-xL-MSCs
在活的有机体内 。((a) - (c)) TUNEL分析在移植后4周进行中(a), vector-MSCs (b),或hBcl-xL-MSCs (c), TUNEL-positive细胞被定义为细胞明显的棕色核标记。(d)凋亡率作为TUNEL-positive细胞核的面积的比例和总细胞核的面积。值意味着±SD (
n
=
6
,
∗
P
<
0.001
)。TUNEL:终端原位dUTP结束标签。比例尺代表50
μ m。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
3.7。Bcl-xL修改msc促进血管生成和防止疤痕形成的梗塞的心
上面的
在体外 数据表明,低氧诱导细胞因子分泌物hBcl-xL-MSCs远高于野生型msc和vector-MSCs。因此,我们预计hBcl-xL基因改造的MSC可以改善MSC移植后缺血心肌血管生成。评估的血管生成能力hBcl-xL修改MSC、MSC移植后4周,毛细血管密度确定的边界区域的心肌梗塞的血管性血友病因子(vWF)染色(数字
7(一) - - - - - -
7 (c) )。结果表明,毛细血管密度vector-MSC和hBcl-xL-MSC组明显高于在中组(
23.7
±
1。5
和
31日
±
1。0
与13±1.1,船舶/高通滤波器,
n
=
6
,
P
<
0.001
)(图
7 (g) )。同时,毛细血管密度hBcl-xL-MSC组是31%高于vector-MSC集团(
n
=
6
,
P
<
0.01
)。这些结果表明,hBcl-xL改性可以显著提高msc的血管生成能力
在活的有机体内 从而有效地促进缺血心肌的血管再生。
图7
hBcl-xL-MSCs促进血管生成和防止疤痕形成的梗塞的心。((一)- (c))的毛细血管密度评价血管性血友病因子染色介质在移植后4周(a), vector-MSCs (b),或hBcl-xL-MSCs (c)。((d) - (f))评估的疤痕形成Trichrome-Masson染色介质(d)在4周后,vector-MSCs (e),或hBcl-xL-MSCs (f)移植。(g)毛细血管密度提出了船只的数量每大功率领域。(h)提出了疤痕的大小的百分比胶原沉积区整个左心室的部分区域。值意味着±SD (
n
=
6
,
∗
P
<
0.01
,
∗
∗
P
<
0.001
)。比例尺代表50
μ m (c)和1毫米(f),分别。
(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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(e)
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(f)
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(g)
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(h)
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疤痕形成,导致从透壁的心肌梗死动物模型的结果的一致性小伙子结扎。丰富的胶原蛋白沉积是疤痕形成的基础。在我们的动物模型,MSC移植后4周,心脏部分沾Trichrome-Masson方法评估疤痕形成(数字
7 (d) - - - - - -
7 (f) )。在这种方法中,胶原纤维染色在蓝色,而心肌纤维染成红色,细胞核是穿着蓝黑色。分析了疤痕形成胶原蛋白沉积(图的定量评估
7 (h) )。与媒介集团(21.1%±1.1%)相比,vector-MSC和hBcl-xL-MSC组表现出较小的疤痕大小(15.1%±1.42%和11.07%±1.05%,分别地。
n
=
6
,
P
<
0.01
)。同时,胶原沉积hBcl-xL-MSC组是26.7%低于vector-MSC集团(
P
<
0.05
)。结果表明,hBcl-xL修改msc可以有效地防止疤痕形成梗塞的心肌。
3.8。Bcl-xL修改msc促进功能恢复的梗塞的心
评估心脏功能恢复的程度,MSC移植4周后,经胸廓的超声心动图研究进行麻醉动物(表
1 )。与假组相比,收缩功能受损后,其他三组心脏梗塞。vector-MSCs和hBcl-xL-MSCs的移植到心肌梗塞能改善左心室功能。然而,hBcl-xL-MSC组心脏功能恢复的程度远远高于vector-MSC组。
表1
超声心动图在MSC移植后4周。
集团
LVDd(毫米)
LVDs(毫米)
LVEF (%)
LVFS (%)
虚假的
4.57±0.03
2.34±0.04
82.95±0.95
48.80±0.10
媒介
6.87±0.03
5.06±0.07
44.79±0.25
26.35±0.35
Vector-MSC
6.66±0.04
∗
4.81±0.03
∗
47.22±0.09
∗
27.78±0.39
∗
hBcl-xL-MSC
5.99±0.01
∗
Δ
3.89±0.04
∗
Δ
59.60±0.30
∗
Δ
35.06±0.11
∗
Δ
∗
差异统计学意义与媒介集团的
n
= 6,
P
<
0.01
。
Δ
差异统计学意义与vector-MSC集团
n
= 6,
P
<
0.01
。
4所示。讨论
来自成人骨髓msc已成为一种很有前途的细胞来源的细胞治疗心肌梗塞。然而,嫁接成活率低的msc严重抑制细胞移植的治疗效果针对心肌细胞修复。在这项研究中,我们证明了hBcl-xL基因改造可以提高生存和msc的生物功能
在体外 和
在活的有机体内 。在缺氧条件下,hBcl-xL修改可以保护msc对细胞凋亡和促进VEGF的分泌,igf - 1和PDGF。在小伙子结扎动物模型中,hBcl-xL修改显著增加存活率和msc移植后的移植。和移植hBcl-xL-MSCs有效阻止疤痕形成和改善心肌梗死后心脏功能的恢复。这些观察结果与此前公布的数据,在协议的表达hBcl-xL在大鼠心脏可以抑制缺血性心肌梗死后心肌细胞的凋亡,可以延长冷保存时间对心脏移植
13 ,
14 ]。目前的研究显示,基因改造的msc hBcl-xL基因可能是一个有趣的策略来改善msc移植后缺血性心脏的可行性,从而导致更好的治疗心肌梗死的治疗结果。
hBcl-xL-MSCs的精确的潜在机制介导的功能恢复心脏梗塞的尚不清楚。这是显示
原位 植入细胞的存活率密切相关的治疗疗效msc (
12 ]。先前的研究表明,msc移植后的存活率低梗塞的心是由多种因素造成的,包括缺乏氧气,营养,和生存因素、炎症反应、宿主的免疫排斥,proapoptotic和细胞毒性因子的存在,和缺血再灌注(I / R)损伤导致重复缺血(
3 ,
10 ,
15 ,
16 ]。最近,据报道,Fas-Fas配体(FasL)宿主缺血性心肌细胞之间的相互作用和移植msc负责激活细胞死亡信号在移植msc (
17 ]。这种交互的抑制可能下调proapoptotic蛋白质的表达包括caspase-8 caspase-3,伯灵顿,细胞色素c和提高细胞存活率和恢复心脏功能(
17 ]。这些观察表明,Fas-dependent和mitochondria-dependent凋亡通路参与移植msc在梗塞的心中的死亡。这是证明凋亡Bcl-xL扮演重要角色在外部和内部细胞凋亡通路。与伯灵顿Bcl-xL可以绑定,防止从线粒体细胞色素c的释放,然后还存在防止下游激活(
18 ]。Fas和肿瘤坏死因子受体诱导细胞凋亡可能是抑制过度的Bcl-xL [
19 ,
20. ]。Bcl-xL修改这些数据支持一个模型促进功能恢复梗塞的心通过增加移植的存活率msc通过抑制Fas和mitochondria-dependent凋亡通路。需要进行进一步的研究来解决这个假设。
是一种多功能干细胞,可以诱导msc分化成各种细胞系包括心肌细胞(
3 和内皮细胞
12 ,
21 ]。然而,一些证据表明,代替MSC分化转化成心肌细胞或内皮细胞生存的旁分泌和血管生成因素MSC扮演了主要角色在治疗心脏梗塞的MSC移植(
12 ,
16 ,
22 ]。据报道,移植msc可以分泌多种生长因子,细胞因子,趋化因子,VEGF、IGF, PDGF,肝细胞生长因子(HGF),基质细胞衍生因子- 1 (SDF-1),基本成纤维细胞生长因子(bFGF), interleukine-1 (il - 1)
12 ,
23 - - - - - -
25 ]。这些因素已经显示功能的改进作出贡献的梗塞的心通过促进血管生成和细胞生存和防止心肌重构(
23 ,
25 - - - - - -
28 ]。在我们的研究中,超表达的hBcl-xL显著增加VEGF的分泌,igf - 1, PDGF在缺氧条件下大鼠骨髓msc。这一发现与先前报道的数据整合中bcl - 2基因可以在植入msc移植VEGF的分泌,改善急性心肌梗死后心脏功能恢复(
12 ]。这些数据表明hBcl-xL-MSCs的心血管效应可能至少部分归因于高水平的旁分泌因子表达式。
hBcl-xL背后的机制介导的细胞因子分泌upregulation msc还不清楚。我们的研究和之前的数据
25 证实,作为主要病理条件缺血性心、缺氧可能提高VEGF的表达和其他细胞因子在msc。据报道,bcl - 2超表达可以有效提高低氧诱导VEGF mRNA的稳定性(
29日 ]。和治疗黑色素瘤细胞与bcl - 2 / Bcl-xL双特异性反义寡核苷酸导致低氧诱导VEGF分泌的减少
30. ]。这些数据表明,bcl - 2和Bcl-xL在低氧诱导细胞因子分泌的调节中扮演角色。
低氧诱导细胞因子分泌被证明是由heterodimeric基本helix-loop-helix转录因子,低氧诱导因子(HIF) (
31日 ]。缺氧可以诱导低氧诱导因子表达通过抑制其[泛素化和降解
32 ]。缺血低氧诱导因子在反应中起着关键作用。HIF-1可以移植血管生成细胞因子的表达通过磷脂酰肌醇3-kinase (PI3K) /促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路
33 ]。此外,HIF-1可以反向诱导细胞凋亡是移植bcl - 2表达(
31日 ]。和HIF-1直接监管Bcl-xL转录通过绑定hypoxia-responsive元素()一定是Bcl-xL启动子(
34 ]。相反,bcl - 2表达的蛋白质含量和VEGF-promoter绑定活动增加HIF-1 [
29日 ]。在这里,我们推测Bcl-xL协同作用形成一个正反馈循环与低氧诱导因子的细胞对缺氧的反应。还需要进一步的研究来阐明这一假设。
综上所述,我们的研究证实,Bcl-xL基因改造可以提高生存和低氧诱导细胞因子分泌道msc,从而促进心脏梗塞的功能恢复。Bcl-xL工程msc移植可能提供一个有效的方法治疗心脏梗塞。