文摘
干细胞疗法似乎承诺恢复损坏或不可挽回的肺部组织。然而,建立一个简单的和可再生的协议准备肺部祖人口是困难的,因为肺泡上皮细胞分化的分子基础是不能完全理解。我们调查了一个在体外系统分析alveolus-specific基因表达的调节机制使用人类肺泡上皮II型(ATII)细胞系,A549。克隆后A549亚种群,每个克隆分为五组根据细胞形态和标记基因的表达。两个克隆(B7和H12)进行了进一步的分析。在无血清培养条件下,表面活性剂蛋白质C(程控),一个ATII标记,是调节H12和B7。水通道蛋白5(AQP5),一个ATI标记,是调节在B7 H12并显著诱导。RAS / MAPK通路抑制时,程控和甲状腺转录因子- 1(TTF-1)表达水平提高。与地塞米松(DEX)治疗后,8-bromoadenosine 3′5′环一磷酸(8-Br-cAMP) 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)和角质细胞生长因子(KGF),表面活性剂蛋白B和TTF-1表达水平提高。我们发现A549-derived克隆可塑性在肺泡上皮分化的基因表达标记可能是有用的在研究ATII维护和分化。
1。介绍
肺部疾病如慢性阻塞性肺疾病和特发性肺纤维化可以危及生命。直到现在,肺移植是治疗严重病例的选择(1]。然而,肺移植相关的几个问题,包括与组织相容性和捐助者的短缺问题。因此,使用干细胞再生医学的肺吸引大量的注意力是一个有前途的治疗(2,3]。最近,胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(万能)已经被用来研究肺泡上皮的再生细胞类型(在)(4,5]。分化成细胞的ESCs,则仍然需要通过几个发展阶段,和这个发展过程的规定尚不清楚。因此,它需要建立一个简单的和可再生的模型系统理解的分子基础发散祖种群的分化在人类肺癌和肺进一步发展再生疗法。
肺肺泡,这对呼吸功能是必不可少的,是由两种类型的肺泡上皮细胞,也就是说,I型(ATI)和II型(ATII)。ATI覆盖95%的肺泡细胞扁平细胞,并参与交换氧气和二氧化碳(6,7]。这些细胞表达特定分化标记,比如水通道蛋白5 (AQP5 [8,9]),caveolin-1 [10),和先进的糖化结束产品的受体(11]。ATII细胞立方细胞,产生表面活性剂,由蛋白质表面活性剂等蛋白质,B, C和D (SPA、SPB、程控和SPD),和磷脂。这些表面活性剂主要用于维持肺泡和宿主防御12- - - - - -14]。温泉、SPB和社民党在克拉拉细胞和ATII细胞合成。程控只在ATII细胞合成,因此,是一种特定的标志ATII细胞(15]。细胞类型特异的表达的SPB和SPC在克拉拉和ATII所需细胞肺呼吸功能(16,17]。基因表达式都由甲状腺转录因子1 (TTF-1)在肺发育18- - - - - -20.]。ATII细胞具有干细胞的自我更新、增殖,并分化成ATI细胞损伤后(21- - - - - -26]。因此,它是相当重要的准备一个简单的和可再生的ATII细胞模型系统和建立一个协议来控制细胞分化成ATI。
在这项研究中,我们使用了一个人类非小细胞肺癌cancer-derived细胞系A549,探索这种可能性A549细胞是否适合调查分化的基因表达标记的规定。A549细胞研究和已知k -突变(g12)和表皮生长因子受体(表皮生长因子受体)基因扩增27- - - - - -29日]。ATII细胞A549细胞保留一些属性但不要等基因表达TTF-1(30.- - - - - -32]。然而,A549细胞也被报道形态异质性与各种增生性活动(33)和分化刺激不敏感,例如,胰岛素/地塞米松(DEX)治疗(34]。因此,我们首先隔离A549克隆和研究他们的基因表达模式在回答几个分化刺激。我们发现A549克隆可再生产地回应他们的刺激,出现分化的基因表达标记的可塑性。这些发现表明,A549克隆可以用于一个在体外系统研究在细胞分化的分子基础。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
A549细胞,人类非小细胞肺癌细胞系,在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM Nissui,东京,日本)含10%胎牛血清(Lenexa JRH的边后卫,生物科学,KS,美国)37°C的5%的股份有限公司2孵化器。维护,A549细胞融合,通过在70%和媒介改变了每3天。以后,原来的A549细胞被称为亲代细胞和克隆的细胞被称为“克隆”与单个字母和数字。
2.2。对A549克隆
2.2.1。单细胞克隆
A549 A549细胞的克隆被限制稀释分离。短暂,A549细胞被洗了两次,没有钙和镁磷酸盐(PBS(−))和分离有0.083%胰蛋白酶(Sigma-Aldrich、东京、日本)和0.177毫米乙二胺四乙酸。细胞数量和台盼蓝染色计数。细胞被播种在0.3或1细胞/成两个96孔板。当每个孤立的克隆生长80%融合,这些细胞被顺序转移到24-well盘子,6-well盘子,盘子和6厘米。
2.2.2。A549克隆的形态分析
形态学观察A549细胞克隆的使用光学显微镜(CKX41N 31 php;奥林巴斯公司(日本东京)和图像捕获使用数码显微镜摄像头(DS-Fi2-L3;尼康,日本东京)。分析了细胞的厚度平均灰度值使用ImageJ(美国马里兰州贝塞斯达国家健康研究所)如下:薄,< 5;厚,≥5。细胞集群的边界被平滑细胞集群评价大纲如下:“明确”是顺利绘制集群大纲和“不清楚”是一个很难勾画集群。细胞的细胞密度是评价数字100的框架内μm×100μm以70%的融合和评估如下:高,≥10细胞;低,小于10细胞。观察细胞集群作为集群的数量特性在通过使用高后1天,≥3;低,< 3。
2.2.3。基因表达分析
基因表达的水平是由逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)。简而言之,从细胞中提取总RNA使用三试剂(分子研究中心,辛辛那提,哦,美国)后,制造商的协议。RT是使用RNA PCR工具包lamv版本执行。3.0(豆类、志贺、日本)。使用去合成cDNA用于PCR Taq DNA聚合酶(WI Promega,麦迪逊,美国)。Gene-specific引物PCR条件表中列出1。检测TTF-1表情,PCR是由30周期的初始特征克隆(图1和表2在其他实验)和40个周期。检测程控表情,底漆的时段只有用于克隆(图的描述1和表2),底漆的SPC2集是在其他的实验中使用。
(一)
(b)
(c)
(d)
2.2.4。光密度分析
每个记录的表达水平受到的规范化18 s核糖体核糖核酸(18 srrna)。electropherogram被捕的图像使用ChemiDoc XRS (BIO-RAD、大力神、钙、美国),使用数量和体积分析(BIO-RAD)之一。的相对比率计算时间0 1。没有表达信号的时间0,相对比例计算样品中表达水平最低的是1。
2.3。细胞增殖实验
细胞的增殖活动被计数单元评估数字表示时间点用台盼蓝和Luna-FL双重荧光细胞计数器(标志生物系统公司、Gyunggi-Do、韩国)。
2.4。诱导细胞分化
2.4.1。无血清制度文化
大约4.2×105A549细胞克隆,细胞B7、H12被播种在DMEM 6-well板块包含10%的边后卫。融合后的细胞达到70%,他们用PBS(−),洗两次,没有的边后卫DMEM补充道。细胞数量统计在12、24、48、72、96和120 h。rt - pcr分析,细胞收获每24 h。
2.4.2。刺激表皮生长因子受体(EGFR)信号通路
B7和H12被播种在DMEM 6-well板块包含10%的边后卫。融合后的细胞达到70%,他们洗两次与PBS(−),变成DMEM没有的边后卫,和人类表皮生长因子(10、30、90 ng / mL;Pepro Tec,落基山,新泽西,美国)补充道。rt - pcr分析,细胞收获每24 h。
2.4.3。抑制RAS /增殖作用的蛋白激酶(MAPK)信号通路
B7和H12被播种在DMEM 6-well板块包含10%的边后卫。融合后的细胞达到70%,他们首先接受选择性MEK1/2抑制剂U0126(3、10和30µM;Wako,日本大阪)或MEK1抑制剂PD98059(30、60和90µM;Wako) DMEM包含10%的边后卫。细胞数量统计在12、24、48 h。rt - pcr,细胞治疗U0126(10和30µ米)或PD98059 (90µ米),收获在24和48 h。
2.4.4。结合MEK抑制剂和敏捷——[8-BR-cAMP] -IBMX-KGF (DCIK)治疗
B7和H12被播种在DMEM 6-well板块包含10%的边后卫。融合后的细胞达到70%,他们首先接受U0126 (30µ米)在DMEM包含10%的边后卫。24 h后,他们洗两次与PBS(−)和介质改为DMEM没有的边后卫±敏捷(50 nM;Wako), 8-Br-cAMP(0.1毫米;Sigma-Aldrich)、isobutyl-1-methylxanthine ([IBMX], 0.1毫米;Wako)和角化细胞生长因子(KGF, 50 ng / mL;Wako) 3天。没有DCIK DCIK控制细胞。细胞被洗两次与PBS(−)和在DMEM培养有或没有额外的3天的边后卫。
2.5。统计数据
统计分析是由学生的t以及使用Microsoft Excel软件。的p值小于0.05意味着具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。描述父母A549细胞的克隆
分析父母A549细胞的特性,我们首先观察他们的形态在增长阶段后4天播种。如图1(一),我们发现几个父母A549细胞的形态变化。我们同时研究了14个分化标记基因的表达模式使用成对的实验设置(图1 (b))和总结在表的结果2。我们发现forkhead框的基因,也就是说,FOXJ1和FOXA2,与转换相关的蛋白质63(p63),mucin-5AC(MUC5AC)这是一个杯状细胞标记,程控经常表达类似的整个文化时期的水平。这些基因的特定标记内胚层细胞、基底细胞,纤毛细胞,杯状细胞,分别和ATII细胞。水通道蛋白5(AQP5),ATI细胞的标记,表示只在第一天,kDa 10克拉拉细胞分泌的蛋白质(CC10),克拉拉细胞的标记,略表示在1 - 3天在增长阶段。的表达Prominin-1(CD133),癌症干细胞的标记,是增强与天的文化。获得从父母A549细胞克隆,我们下一个执行限制稀释和46个杨树无性系的孤立。我们分类这些克隆分为12组根据形态差异。平均天数获得汇合的单层每个克隆的是3.7除了细胞克隆八国集团(14天)。其他每个克隆的形态特征,包括细胞厚度、外观的细胞集群边界,细胞密度、集群、观察和如表所示3。我们进一步检查标记基因的表达谱利用每组的代表克隆(图1 (c))。的表情FLK1,SOX17,TTF-1,T1α,雌性生殖道没有检测到所有克隆。相比之下,所有克隆表达p63。克隆G8集团4中独特的表达基因编码血小板源生长因子受体α(PDGFRα),但没有表达FOXA2,MUC5AC,或CD133。FOXJ1没有表达组3、4、5所示。CC10略表示只有在组1和2。AQP5表示只有在组2、5、7、10、11日和程控除了组1中检测出他们所有人。
根据这些数据,我们进一步划分成五类,如表所示4。代表细胞形态学是显示在图1 (d)。H10类1和一个苗条核纺锤形。MUC5AC杯状细胞标记,高度表达,但是程控和AQP5没有在H10发现。八国集团,在2班,增长缓慢,显示堆积成山的增长。程控,p63,PDGFRα表达,但FOXA2,MUC5AC,CD133没有检测到。H12在3班,有一个倾向于集群和集群细胞的轮廓边界是明亮和清晰可见。表达的细胞AQP5和程控ATI的典型标记的细胞和ATII细胞,分别。B7、在课堂上4、多边形形状的细胞密度高,但细胞的轮廓边界是不清楚。B7表示程控,但不AQP5。G9类5与B7但显示invadopodia-like分享相似的基因表达模式的结构。
表中所示的基因表达模式4表明B7 ATII-like特点,H12 ATI-like和ATII-like特征。这些克隆用于进一步的分析潜在的ATII ATI / ATII代表,分别。
3.2。血清损耗B7和H12克隆的影响
增殖和分化是相互地和严格监管35]。因为来自肺腺癌A549细胞,一般认为细胞减少血清依赖性和获得自主增长的增加。因此,我们最初检查血清损耗的影响扩散(图2(一个))。B7和H12增加细胞数量与血清培养基直到72 h。然而,细胞增殖抑制无血清培养基从48 h。72 h后,细胞数量开始减少在两种文化条件。接下来,我们检查血清损耗的基因表达的影响程控,AQP5,也低氧诱导因子- 1α(HIF-1α),调节肿瘤细胞的表型,包括他们进步的扩散36- - - - - -38)(图2 (b)和2 (c))。B7,显著增强程控表达式被观察到从48 h血清损耗与控制(图2 (b))。在120 h,表达水平的调节2.9倍相比,在时间为0。相比之下,AQP5在24小时显著诱导和表达水平保持直到120 h血清损耗。的表达水平HIF-1α没有明显改变。
(一)
(b)
(c)
另一方面,在H12,程控表达增强从24小时血清损耗相比,控制(图2 (c))。观察最大的表达水平在72 h作为时间增长了1.7倍相比,在0。然而,与B7的表达水平开始下降96 h在有或无血清条件。AQP5表达时间的方式增强了血清消耗,最大限度的表达水平是2.8倍在120 h与时间0。HIF-1α表达没有明显改变。这些结果表明,血清反应消耗B7和H12之间是不同的。
3.3。EGF治疗对基因表达的影响在B7和H12克隆
因为血清含有生长因子和A549细胞接受已报告表皮生长因子受体放大(29日),我们假设血清损耗的影响可能是由于缺乏血清EGF。为了证实这种可能性,我们无血清培养系统B7和H12 EGF(10、30和90 ng / mL)。B7、程控从24小时表达增强血清损耗(图3(一个))。10和30 ng / mL的EGF治疗并不影响程控表达式。一个小的抑制程控观察90 ng / mL的EGF治疗。相比之下,AQP5表达式是由血清诱导从24小时损耗。添加EGF的感应AQP5以剂量依赖性的方式被推迟。H12的增强程控和AQP5表达式由血清损耗不受EGF治疗(图3 (b))。这些结果表明,在血清中EGF对alveolus-specific几乎没有影响基因的表达。
(一)
(b)
3.4。MEK抑制剂对基因表达的影响在B7和H12克隆
A549细胞已被证明的k -突变(g12)和显示激活MAPK信号(27,28]。检查血清损耗效应是否可以取代抑制MAPK信号,我们对待B7和H12 U0126和PD98059。我们首先确认对细胞增殖的影响克隆U0126处理(3、10和30μ米)或PD98059(30、60和90μ分别为米)(图4(一))。B7和H12,细胞增殖抑制U0126和PD98059剂量依赖性的方式。最有效剂量是30μM U0126和90μPD98059 M。虽然这些似乎相对较高的浓度比先前的研究中使用的剂量抑制ERK的磷酸化(例如,10μU0126 25米μM PD98059 [39,40]),我们没有观察到越来越多的依赖漂浮细胞培养时间(数据未显示)。当我们收获附加的细胞,形态是一样的健康细胞,收集细胞的生存能力是超过90%(数据没有显示)。因此,我们评估了抑制剂的浓度都是无毒的。细微差别,增长反应观察MEK抑制剂B7和H12之间。B7更敏感比H12抑制剂和早些时候显示比H12抑制细胞增殖。
(一)
(b)
(c)
接下来,我们检查了MEK抑制剂的影响在B7基因表达和H12。B7、程控表达式是暂时性的调节在U0126治疗24小时的1.9倍;然而,这是减少PD98059治疗与控制(图相比4 (b))。虽然TTF-1表达式没有检测到30个周期,它可以检测到40周期。在这个PCR条件下,TTF-1表达调节U0126治疗后1.2倍和1.1倍后24 h PD98059治疗。在48小时,TTF-1表达式是减少在所有条件下血清损耗除外。MEK抑制剂的影响AQP5和SPB表达是不同的。另一方面,在H12,程控表达式是暂时性的调节在24 h U0126治疗后1.7倍,但不是PD98059治疗后(图4 (c))。TTF-1表达式是暂时性的调节U0126治疗后24小时和1.5倍1.4倍PD98059治疗后。表达水平的AQP5和SPB并没有因为U0126而改变,PD98059治疗。
3.5。B7和H12 DCIK治疗克隆的影响
以前的研究报道,TTF-1可以促进程控和SPB表达式[18- - - - - -20.]。虽然程控和TTF-1表达增强U0126治疗后是暂时性的观察到在某些情况下,这并不是可再生的实验。最近,DCIK治疗报道促进分化的祖细胞诱导老鼠的ESCs人类万能ATII细胞(41,42]。此外,tissue-derived ATII细胞可以维持他们的特点在体外DCI治疗(43,44];此外,DCI去除后,他们可以提高ATI的表达式细胞标记(45]。测试A549克隆是否应对DCIK的培养条件,我们下一个检查的影响DCIK ATII细胞标记基因的表达增加,后MEK抑制剂治疗。如图5(a),我们首先培养B7和H12细胞融合与30 70%μM U0126 24 h。之后,我们改变了媒介没有DCIK (DCIK控制)或DCIK无血清培养系统(DCIK)并继续文化72 h(总时间为96小时)文化。DCIK治疗后,我们交换去除DCIK和培养的培养基血清(DCIK +血清)或无血清(DCIK +无血清)72 h。B7的形态明显改变了DCIK治疗(图5(b))。B7的形状变得平坦,spindle-like 48 h后,和细胞边界清晰的轮廓。这些细长的细胞增加时间的方式,但细胞的清晰轮廓是在相似的水平维持在整个文化时期。
我们接下来研究的影响和MEK抑制剂联合治疗DCIK在B7基因表达(图5(c))。与时间相比0,程控表达增强U0126治疗期间直到24小时。DCIK加法后,程控表达式是减少了48 h,然后增加时间的方式直到96 h。然而,这些变化在DCIK观察以同样的方式控制。相比之下,在72 h,AQP5在DCIK隐含的0.5倍,相比与DCIK控制。TTF-1表达显著增加了1.6倍DCIK治疗后相比,DCIK控制。SPB也增强了时间依赖的方式从48 h和达到2.1倍upregulation 96 h。DCIK去除后,程控表达下降了120 h,然后增加血清中有或没有时间的方式。AQP5只在无血清条件下表达。然而,TTF-1和SPB表达水平下降了DCIK删除。
用H12我们也做了相同的实验。形态变化中,并未观察到H12 DCIK治疗后(图5(d)),但细胞48 h后更集中。我们下一个检查的影响结合MEK inhibitor-DCIK治疗基因表达在H12(图5(e))。程控表达增强U0126治疗期间直到24小时。DCIK加法后,程控表达式是减少了48 h,然后增加时间的方式直到96 h。AQP5被压制在DCIK 48 h和72 h后保持在0.7倍。TTF-1表达在48小时调节1.3倍,保持在这一水平直到96 h。SPB表达显著增加了48小时显示,多达4.6倍upregulation 72 h和保持这个水平直到96 h。DCIK去除后,程控表达下降了120 h,然后增加血清中有或没有时间的方式。AQP5提高时间的方式在无血清培养基。TTF-1暂时性的下降在120 h但恢复到原来的表达水平。SPB下降,但程控DCIK切除后增加时间的方式。
4所示。讨论
在这项研究中,我们试图建立一个简单的和可再生的在体外系统可以用来分析肺肺泡上皮细胞分化的分子机制。我们孤立A549克隆,他们通过表型筛选使用形态特征和基因表达的标记(表模式2- - - - - -4)。根据肺泡细胞标记的主要表达模式(30.,46),两个A549克隆,B7和H12进一步分析初步代表ATII和ATI / II细胞。
我们检查了这些克隆是否显示任何反应刺激诱导分化有或无血清培养条件下几个,DCIK和MAPK抑制剂。B7和H12都独特的对刺激产生反应,反映ATII和ATI / II细胞的特点,而这些反应是稳定和可重复观测到120年122年和通道,分别(数据没有显示)。
发现无血清条件下可以诱导肺泡上皮分化的基因表达标记A549克隆是一致的与之前的研究(47]。
因为细胞生长和分化是相互地和严格监管35),我们的增长率和无血清。我们观察到A549细胞高度增殖与血清培养基,但血清损耗降低增长率和相互地分化标记基因的表达增加。此外,SPC和AQP5蛋白质不被免疫印迹分析血清中消耗系统(数据未显示)。因此,细胞可以启动但是没有完全分化的现状,表明可能需要额外的信号或环境条件诱导蛋白质表达。
因为k -变异(g12)和表皮生长因子受体放大检测A549细胞,血清损耗的影响,第一次被认为是与MAPK信号级联也扮演着一个重要的角色在癌症扩散48]。我们发现的扩散能抑制A549克隆MEK抑制剂U0126和显示增强的表达分化标记,程控和TTF-1(图4)。U0126, MEK1/2抑制剂(49),引起的增强程控表达24 h,然后减少或维修造成48 h;然而,这并不影响AQP5表达式。PD98059, MEK1抑制剂(50),并没有影响程控或AQP5表达式。这表明RAS-MAPK信号可能控制之间切换在A549克隆增殖和分化。这些抑制剂的微分效应标记基因表达可能是由于不同的目标分子,但这还有待确定。
第二,血清包含多种因素,包括生长因子如EGF。Lauand等人证明A549细胞表皮生长因子受体磷酸化,放大和EGF刺激可以激活肌动蛋白纤维组织和细胞的能动性,而不是诱导A549细胞增殖(51]。然而,我们发现EGF的表达几乎没有影响分化标记(图3)。因此,它是可能的,其他配体在血清、肿瘤坏死因子等α、amphiregulin heparin-binding EGF-like生长因子(52- - - - - -55)可以激活EGFR-mediated信号。需要进一步分析确定的机制在无血清条件下分化标记基因表达增强。
诱导细胞分化,能量代谢的控制是另一个重要的问题要讨论。A549细胞的能量代谢是由Warburg效应(56]。有氧糖酵解是主导和线粒体氧化磷酸化却降低了。开关从糖酵解能量代谢线粒体氧化磷酸化已经证明在肿瘤细胞诱导分化(57]。这促使我们检查的影响糖酵解和/或丙酮酸脱氢酶激酶-(此后)抑制剂增加碳代谢产物进入三羧酸循环和流动微分信号切换。我们检查了糖酵解的影响在特定的媒介文化(耗尽与谷酰胺、葡萄糖、丙酮酸钠),丙酮酸脱氢酶激酶和乳酸脱氢酶的抑制剂结合U0126分化标记的基因表达水平。然而,我们没有发现任何基因表达的诱导或增强这些治疗的结果(数据未显示),这表明在我们的实验条件,至少在某种程度上,葡萄糖代谢没有A549克隆的主要角色。
最近,一些报告研究了合适的培养条件保持ATII功能和诱导ATI分化(41- - - - - -45]。DCI治疗在体外可以保持和增强ATII自然ATII细胞的特点从人类胎儿和成人肺孤立43,44]。此外,KGF治疗可以增加表面活性剂蛋白质基因表达和减少AQP5表达式[58- - - - - -60]。使用鼠标ESCs和人类万能,它也被报道,KGF结合DCI治疗导致ATII-like细胞的祖细胞的成熟41,42,61年]。因为鼠标外胚层干细胞和人类万能干细胞已被证明有类似于肿瘤细胞能量代谢62年),我们使用U0126和DCIK抑制细胞增殖和细胞形态学检查和肺泡分化的基因表达标记(图5)。这种治疗诱导形态变化在B7(平面和轴形状),分别和H12 cell-clustering增加。程控通过DCIK治疗没有明显增加,但SPB和TTF-1明显增强。AQP5克隆表达,然而,减少。这些发现表明ATII-marker基因的表达被DCIK增强治疗。B7的形态学变化,我们观察到的是有点类似于上皮间充质转变;然而,上皮标记SPB和程控被检测到。进一步分析需要更好地理解DCIK治疗引起的形态变化的意义。此外,ATII-like孤立ATII细胞的细胞可以分化人类胎儿肺,维护在一个DCI-added媒介,为ATI-like细胞,通过DCI的删除45]。在我们的系统中使用A549克隆,DCIK删除并没有影响AQP5或程控表达但下降SPB表达式。这些数据表明,ATI诱导A549克隆需要额外的线索。
为在活的有机体内事件后肺损伤,ATII细胞增殖并扩散,和他们的女儿细胞可以分化成ATI细胞(21- - - - - -24]。一个在体外研究表明,核转化生长因子-β(TGF -β)和重组人骨形态发生蛋白- (rhBMP -) 4可以上调表达ATII标记,而BMP的核受体和rhTGF -β调节ATI标记在老鼠ATII细胞的表达63年]。此外,ATII细胞治疗胰岛素样生长因子(IGF-I)分化成ATI-like细胞的激活Wnt5a鼠ATII细胞(64年]。这些发现表明,细胞因子信号可能发挥关键作用的基因和表观遗传程序在肺癌发展。
最后,我们得到了一个有趣的发现关于B7的遗传背景和H12克隆细胞通过分析验证。B7和H12保持A549签名,除了Y chromosome-loss H12(数据没有显示)。Y染色体的不稳定一直在报道一些人类癌症,并认为Y染色体丢失或获得相关恶性肿瘤的进展(65年]。然而,肿瘤恶化的Y染色体不稳定的生物学意义尚不清楚。有趣的是,Y染色体的引入到人类前列腺癌的细胞系,曲泽,抑制肿瘤形成66年),以及Yp11.2包含的损失TSPY与肿瘤发生在前列腺癌基因显示了很强的关联67年]。和最近的一项研究报告的损失在老年人外周血与Y染色体短癌症生存和癌症发病率的风险更高(68年]。由于肿瘤细胞可塑性和表型异质性69年),Y chromosome-loss可以B7和H12表型差异的原因。进一步详细分析Y chromosome-loss,表观遗传状态和转录组分析H12所需了解的特点,克隆H12和肺泡分化的机制。
综上所述,我们总结我们的研究结果在图6作为一个在体外而A549模型在活的有机体内模型,最近报道(25]。在肺肺泡发展,bipotent祖细胞分化成ATI和ATII细胞。肺泡受伤或损坏在成年时,ATII细胞可以分化成ATI细胞自我更新和维护供应ATII细胞通过保持肺泡内稳态,恢复组织缺陷(21- - - - - -26]。然而,当ATII细胞了k -突变和/或表皮生长因子受体突变,它们可以转化为癌细胞(70年,71年]。
在A549模型,A549已经证明k -变异(g12)和表皮生长因子受体放大(27- - - - - -29日)和失去一些ATII细胞的特点(31日,32]。在我们的研究中,我们发现A549克隆B7 ATII细胞的特点,和H12 ATI和ATII细胞特征基于分化标记基因的表达。我们还观察到ATII-like特征可以增强或恢复,B7和H12、文化条件下与U0126 DCIK治疗紧随其后。需要进一步的分析理解ATI的详细的监管机制和ATII标记基因表达并找出进一步有效的分化系统使用这些克隆。我们的研究结果表明,A549克隆将提供一个简单和容易在体外模型系统的潜在代表bipotent ATI / II和ATII细胞并将阐明分子依据ATII ATII细胞的自我更新和分化成ATI细胞。
5。结论
在这项研究中,我们孤立A549克隆和特征明显的形态学和基因表达模式的特征。其中,我们发现两个A549克隆,B7、H12 ATII细胞- ATI / ATII细胞样的特点,他们对血清枯竭的刺激,表明他们的可塑性肺泡分化的基因表达标记。这些A549克隆可能成为模型系统研究的来源为ATII分化调控的分子基础。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Hiroshi近藤和Keiko三好了同样的工作。
确认
这项工作在一定程度上支持的总统德岛大学的研究预算。作者感谢教授第一并且绕着圆圈圈打转的人类遗传学,德岛大学的细胞身份验证。作者还感谢支持中心先进的医学科学,健康生物科学研究所的德岛大学的研究生院。