toll样受体3和4在干细胞成骨中的作用

摘要

客观的．目的:探讨toll样受体在干细胞成骨中的作用。方法．将骨髓间充质干细胞（BMSCs）分成空白组，TLR-3活化基团和TLR-4活化基团。10天后的促进培养培养后，通过Western印迹测定I型胶原蛋白和骨钙蛋白的表达。成骨细胞（OBS）也分为上述三组。在10天的骨化诱导培养后进行碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色。表达-catenin蛋白Western blot检测。结果．TLR-3和TLR-4活化基团都增加了I型胶原蛋白和骨钙蛋白的表达;TLR-4的效果更强。在TLR-3活化基团中，茜素红和ALP染色的强度最强，TLR-4活化组中最弱。激活TLR-4降低了表达-Catenin，虽然TLR-3的激活并没有影响表达连环蛋白。讨论．该研究表明，TLR-3和-4均促进了BMSCs对OBS的分化。TLR-3对OBS对骨细胞的骨化有诱导效果，而TLR-4的效果是相反的，因为其对WNT信号通路的抑制作用。

1.导言

干细胞作为种子细胞，结合骨组织工程支架，由于其分化为成骨细胞(OBs)的能力，有利于骨愈合，这一观点已被广泛接受。骨化后，OBs转化为骨细胞，骨细胞形成原始骨组织。然而，这并不是骨骼形成的最后阶段。在OBs和破骨细胞(OCs)共同完成骨组织重建后，骨组织的生理功能才得以发展。干细胞向成熟骨组织分化的整个过程被定义为干细胞成骨，它受多种细胞因子的调控，如骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)、成纤维细胞生长因子(FGF) [1那2]．Toll样受体（TLR）是影响干细胞骨发生的细胞因子之一[3.那4.]．

toll样受体(Toll-like receptor, TLRs)是一类重要的模式识别受体，是一类跨膜糖蛋白。它们在大多数人类和其他动物细胞和组织中广泛表达，不仅启动初级免疫反应，而且在一般免疫系统和其他身体功能(包括干细胞增殖)的调节中发挥重要作用[5.]此外，TLR的激活可诱导多种炎症因子的分泌，如白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF）和前列腺素（PG），所有这些都已被证明在炎症早期促进骨愈合[6.那7.]．Raicevic和他的同事已经报道，tlr能够通过炎症过程促进人间充质干细胞的成骨潜能[8.]．推断TLR在干细胞的骨质发生过程中起重要作用。TLR-3和TLR-4在人骨髓间充质干细胞（BMSCs）的表面上表示[9.]对炎症的调节有不同的作用[10.]．虽然TLR-3促进白细胞介素-10-10（IL-10）的分泌，吲哚胺2,3-二恶氧酶（IDO）和前列腺素E-2（PGE-2）并诱导急性炎症，TLR-4促进了IL的分泌-6，IL-8和TNF-并诱导慢性炎症。因此，提出合理的是，TLR-3和TLR-4的效果在干细胞的骨质发生中也很可能不同。

Wnt信号通路通过在基因转录水平上调控OB功能，可能是干细胞成骨过程中的重要机制[11.那12.]．WNT信号传导途径的激活能够增强骨毛细胞发生[13.]促进骨形成[14.]．-catenin是Wnt通路的下游信号分子。胞质-Catenin作为活化Wnt信号通路的激活而累积，然后转移到细胞核中。核-Catenin能够通过与T细胞因子/淋巴增强剂因子（TCF / LEF）相结合来上调Rux-2的表达，这在干细胞的骨内发生至关重要。

本研究旨在确定TLR-3和TLR-4在骨髓间充质干细胞向OBs分化和OBs向骨细胞骨化过程中的不同作用。另一个目的是研究Wnt信号通路在干细胞成骨过程中的作用。

2.材料和方法

从大鼠分离后描述(15.]，流式细胞术鉴定BMSCs。将第3代BMSCs分为3组:TLR-3激活组(wells），TLR-4激活组(Wells)，空白组(井）。用TLR-3激动剂，聚氨基蛋白 - 多环酸[聚（I：C）]（Sigma，USA，L2630-10mg），10ng / ml处理TLR-3激活基团中的细胞。TLR-4活化基团中的细胞用脂多糖（LPS）（Sigma，USA，L2630-10mg），10ng / ml，TLR-4的活化剂处理。不治疗空白组中的细胞。所有治疗组在骨纤维植物促进的差异培养基中培养[10⁻⁸10 mmol/L地塞米松- 甘油磷酸盐，50mg / L维生素C和H-DMEM，具有10％胎牛血清（FBS）]。在细胞培养的第10天，如前所述，通过Western印迹检测I型胶原蛋白和细胞骨钙蛋白的蛋白质表达[16.，以证明TLR-3和TLR-4在骨髓间充质干细胞向OBs分化中的作用。并进行了定量分析。

为了证明不同TLR亚型在OBs对骨细胞骨化中的作用，我们按以下方法进行碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色。前10天，用上述成骨促进分化培养基诱导大鼠骨髓间充质干细胞形成OBs。骨髓间充质干细胞诱导的OBs分为TLR-3激活组(wells），TLR-4激活组(富国银行)和银行集团(水井)，然后用上述相同的方法处理。然后用3 mmol/L Na诱导细胞成骨_3.宝_4.，50毫克/升维生素C，H-DMEM，10％FBS）另外10天。之后，然后对这些基团中的细胞进行AlP染色和茜素红染色。

TLR-3激活组、TLR-4激活组和空白组的OBs分别培养10 d，总蛋白表达量分别为-连环蛋白与核蛋白-Catenin被蛋白质印迹检测到。

3.结果

流式细胞术结果显示BMSCs的表面标记物呈阳性（图1）。将从大鼠分离的细胞鉴定为BMSCs，并在用这些细胞进行后续实验。在本研究中，Western印迹分析（图2）显示I型胶原蛋白的表达在TLR-3活化基团中较高（那）和TLR-4活化组（那与TLR－4活化组相比，TLR－4活化组细胞的I型胶原水平高于TLR-3激活组。那)类似地，TLR-3激活组的骨钙素表达较高(那）和TLR-4活化组（那）而不是空白组。TLR-4活化组和TLR-3活性组之间，前一种骨质蛋白的表达较高（那）。Western Blot图像的定量分析数据在表中1．

茜素红染色的强度（图3.)，空白组强于TLR-4激活组(那)TLR-3激活组更弱(那).ALP染色结果（图4.)，免疫细胞化学(IHC)方法相似。TLR-3激活组的ALP染色强度较空白组强(那)，而空白组的ALP强度较TLR-4激活组强(那)定量分析数据见表12．

当表达总和核-catenin被提到(图5.）与TLR-3活化组相比，TLR-4活化组显着降低，（那;那）和空白组（那;那）。但是，没有差异表达-catenin在TLR-3激活组和空白组之间的差异(那;那)定量分析数据见表11．

4.讨论

本研究明确表明TLR-3和TLR-4均影响BMSCs成骨。然而，这两种TLR亚型在BMSCs成骨的不同阶段发挥着不同的作用。TLR-3和TLR-4的激活促进了骨髓间充质干细胞向OBs的分化。通过检测I型胶原和骨钙素来阐明TLR-3和TLR-4的作用。I型胶原是骨基质和骨钙素的主要成分，由OBs分泌。I型胶原的分泌在第10天和第14天达到高峰，在为骨细胞骨化做准备的OBs形成之后[10.]．在骨化的最后一个时期，I型胶原蛋白的水平减少[17.]．OBSERCALCIN分泌的骨钙素涉及骨化阴性反馈机制，由此骨钙素的分泌抑制过度渗透[18.那19.]I型胶原的蛋白表达和骨钙素的蛋白表达是OBs生存能力的指标。目前的研究结果表明，TLR-3和TLR-4都能促进BMSCs向OBs的分化。此外，TLR-4的激活比TLR-3的激活更有效。TLR-3和TLR-4在干细胞成骨中的不同作用可能归因于不同TLR亚型诱导的不同炎症环境。在TLR-3过度表达诱导的急性炎症环境中，分泌包括IDO、PEG-2和IL-10在内的抗炎因子，而在TLR-4过度表达诱导的慢性炎症环境中，分泌促炎因子，如TNF-，IL-6和IL-8分泌[10.].据报道，促炎因子可促进前成骨细胞的分化[20.]．事实上，玻璃等人的研究。表明tnf-，典型的促炎因子增强干细胞的招募和分化，结果促进了骨愈合[6.]此外，IL-6和TNF的骨折修复延迟-敲除小鼠与野生类型相比[21.那22.]．因此，可以参与TLR-4的激活促进与BMSCs对OBS的分化相关的促炎因子。

在骨化阶段，TLR-3和TLR-4的激活效果相反。采用ALP和茜素红染色阐明骨化作用。成熟的OBs释放大量的基质囊泡，每个囊泡都含有大量的钙，有助于矿化[23.那24.]．茜素红染色这些钙储存橙色，然后这些钙储存可以显微镜下分析。有报道称ALP在成熟OBs释放的基质囊泡膜中表达。因此，ALP被认为是OB骨化的主要调节因子之一[25.]．在OBS与组织非特异性碱性磷酸酶阴性（TNAP - / - ）中，不能观察到骨结节和骨化的形成;然而，TNAP +/-可以形成骨骼结节的OB，而骨化延迟[25.]．茜素红染色和ALP染色是最直接、最有效的观察OBs骨化的方法。结果表明，虽然TLR-3增强了OBs对骨细胞的骨化，但TLR-4的激活抑制了OBs对骨细胞的骨化。

考虑到TLR-3和TLR-4的激活对干细胞向OBs分化的促进作用是相同的，有趣的是观察到TLR-3和TLR-4对OBs向骨细胞骨化的影响是不同的。很明显，有必要研究TLR-3和TLR-4的下游机制，因为这些下游机制的改变可能有助于了解TLR-3和TLR-4在干细胞成骨中的不同作用。Wnt信号通路促进骨形成，抑制骨吸收，是骨代谢最重要的信号通路之一[26.]．结构稳定、可溶的存在-细胞质中的连环蛋白是Wnt信号通路的下游信号分子，对Wnt信号通路的完整转导至关重要[27.]．缺乏-连环蛋白导致骨代谢异常和骨功能障碍[26.]．据报道，TLR-4抑制新出生小鼠的肠上皮细胞中的WNT信号通路[28.]．因此，TLR-4也有可能抑制大鼠OBs中的Wnt信号通路。为了研究这种可能性，表达在TLR-4激活组和TLR-3激活组的OBs中检测-catenin。本研究结果支持TLR-4在Wnt信号通路中的抑制作用，从而可能解释了本研究观察到的TLR-4在OBs向骨细胞骨化中的抑制作用。而TLR-3的激活并不影响其表达-catenin和Wnt信号通路。因此，TLR-3在OBs骨化中的作用与TLR-4不同。

利益冲突

没有作者都没有利益冲突。

致谢

本研究由江苏大学资助。感谢张志坚博士对实验的指导。感谢曹新斌博士在数据分析方面的帮助。

参考

1. Z.陈，C.Wu，W.Gu，T.Klein，R.Crawford和Y. Xiao，“骨髓MSC的成骨分化β-磷酸三钙通过BMP2信号通路刺激巨噬细胞生物材料，卷。35，不。5，pp。1507-1518,2014。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
2. R. Budiraharjo, K. G. Neoh和e . t。康，“通过共价固定BMP-2或FGF-2来增强壳聚糖膜的成骨和伤口愈合的生物活性”，生物材料科学杂志，卷。24，不。6，pp。645-662,2013。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
3. J.-E.Huh和S.Y.Lee，“IL-6由脂肪来源的基质细胞产生并促进成骨，”生物化学与生物物理学报-分子细胞研究，卷。1833年，没有。12，pp。2608-2616，2013。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
4. R.Song，Q.Zeng，L.Ao等人，“Biglycan通过toll样受体-2诱导人主动脉瓣间质细胞中成骨因子的表达，”动脉硬化，血栓形成和血管生物学，卷。32，不。11，pp。2711-2720,2012。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
5. M.Pevsner Fischer，V.Morad，M.Cohen Sfady等人，“Toll样受体及其配体控制间充质干细胞功能，”血液，第109卷，第2期。4，pp。1422-1432,2007。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
6. G.E.格拉斯，J.K.陈，A.Freidin，M.Feldmann，N.J.霍伍德和J.Nanchhaal，“TNF-α通过增加肌源性基质细胞的募集和分化，促进骨折修复。”美国国家科学院学报，第108卷，第108号4, pp. 1585-1590, 2011。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
7. Mountziaris和A.G.Mikos，“炎症反应的调节促进骨组织再生，”组织工程第二部分：综述第14卷第2期2，页179 - 186,2008。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
8. G.RaIEDVIC，M.Najar，K.Pieters等，“炎症和收费的受体结扎差异地影响人间充质基质细胞的成骨潜力，这取决于其组织来源，”组织工程部分a第18卷第2期13-14, pp. 1410-1418, 2012。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
9. R. S. Waterman，S.L. Tomchuck，S.L.Henkle和A.M. Betancourt，“一种新的间充质干细胞（MSC）范式：偏振成促炎MSC1或免疫抑制MSC2表型”普罗斯一体，第5卷，第4期，文章编号e10088，2010年。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
10. G. S. Stein，J.B.L.L.Stein，A. J.Van Wijnen，A.J.Van Wijnen和M. Montecino，“对成骨细胞生长和分化的转录控制”生理上的评论，第76卷，第76期2，第593-629页，1996。浏览：谷歌学术搜索
11. V. Krishnan，H. U.Bryant和O. A.Macdougald，“通过WNT信号传导的骨质调节”，“临床研究杂志，第116卷，第116期5，第1202-1209页，2006。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
12. A.Lipton和C. Goesl，“抗校准治疗和预防骨转移的临床开发”，骨，卷。48，不。1，pp。96-99，2011。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
13. J. E. Huh，J. Y.Choi，Y.Hain等，“精氨酸增强了骨细胞发生，并通过在人间充质干细胞中调节WNT和NFATC信号传导来抑制脂肪生成，”国际分子科学杂志，第15卷，第5期。7，pp。13010-13029,2014。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
14. Chen，X.Tu，E.Esen等人，“WNT7B部分通过mTORC1促进骨形成，”遗传学，第10卷，第5期。1、文章编号e1004145, 2014。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
15. A.Smajilagić，M.Aljičević，A.Redžić，S.Filipović和A.C.Lagumdžija，“大鼠骨髓干细胞分离和培养为骨形成的实验系统”波斯尼亚基础医学科学杂志，第13卷，第2期1, pp. 27-30, 2013。浏览：谷歌学术搜索
16. W. Wang，Z. Pan，X. Hu，Z.Li，Y. Zhao，A.-X.Yu，“真空辅助闭合增加了ICAM-1，MIF，VEGF和胶原蛋白在伤口治疗中表达，”实验性和治疗药物，第7卷，第5期5, pp. 1221-1226, 2014。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
17. L.Passi Even、D.Gazit和I.Bab，“骨髓细胞扩散室培养中成骨分化过程中超微结构特征的个体发生，”骨与矿物研究杂志，第8卷，第2期5，第589-595页，1993。浏览：谷歌学术搜索
18. C. Chenu, S. Colucci, M. Grano等，“骨钙素诱导人破骨细胞样细胞趋化、基质蛋白分泌和钙介导的细胞内信号”，细胞生物学杂志，卷。127，没有。4，pp。1149-1158,1994。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
19. J. Glowacki, C. Rey, M. J. Glimcher, K. A. Cox，和J. Lian，“骨钙素在破骨细胞分化中的作用”，细胞生物化学杂志第45卷第5期3，页292-302,1991。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
20. D. Nam，E.Mau，Y. Wang等，“T淋巴细胞通过IL-17F在裂缝修复的早期阶段使成骨细胞成熟，”普罗斯一体，第7卷，第5期6，物品ID E40044,2012。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
21. L. C. Gerstenfeld, t - j。Cho, T. Kon等，“TNF-缺失时骨折愈合受损α信号通路:TNF-的作用α软骨内软骨吸收骨与矿物研究杂志第18卷第2期9，PP。1584-1592，2003。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
22. X. Yang，B.F.Ricciardi，A. Hernandez-oria，Y.Shi，N.Pleshko Camacho和M.P.G. Bostrom，Callus矿化和成熟在白细胞介素-6敲除小鼠中骨折愈合期间延迟，“骨号，第41卷。6，页928-936,2007。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
23. S.Boonrungsiman，E.Gentlent，R.Carzaniga等人，“细胞内磷酸钙在成骨细胞介导的骨磷灰石形成中的作用，”美国国家科学院学报，第109卷，第2期。35, pp. 14170-14175, 2012。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
24. R. Buchet，S. Pikula，D. Magne和S. Mebarek，“矩阵囊泡的隔离和特征”分子生物学方法，卷。1053，pp。115-124,2013。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
25. C.Wennberg，L.Hessle，P.Lundberg等人，“碱性磷酸酶基因敲除小鼠成骨细胞和破骨细胞的功能特征，”骨与矿物研究杂志，第15卷，第5期。10，页1879-1888,2000。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
26. D.A.Glass II和G.Karsenty，“骨中Wnt信号的体内分析，”内分泌学第一四八卷第一百四十八期6, pp. 2630-2634, 2007。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
27. S.L.Holmen，C.R.Zylstra，A.Mukherjee等人，“教育的基本作用”β- 在产后骨收集中，“生物化学杂志第280卷22，页21162 - 21168,2005。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索
28. H. Yi，A.K.Patel，C.P.Sodhi，D.J.Hackam和A. S. Hackam，在WNT信号通路和感光体细胞凋亡的调节中，对先天免疫受体Toll样受体4（TLR4）的新颖作用“普罗斯一体，第7卷，第5期5，物品ID E36560,2012。浏览：出版商的网站|谷歌学术搜索

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