SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 10.1155 / 2014/917168 917168年 研究文章 toll样受体3和4的影响骨生成的干细胞 气 陈 现任 徐 晓光 王 艾森伯格 伦纳德·M。 整形外科学系 江苏大学附属医院 438解放路,镇江,江苏212000 中国 ujs.edu.cn 2014年 24 12 2014年 2014年 09年 08年 2014年 16 11 2014年 01 12 2014年 25 12 2014年 2014年 版权©2014陈玘et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

客观的。调查toll样受体在干细胞成骨的影响。 方法。骨髓间充质干细胞(bmsc)分为空白组、TLR-3激活集团,集团地激活。经过10天的osteogenic-promoting文化、I型胶原和骨钙素的表达是由蛋白质印迹。成骨细胞(突发)也分为上述三组。碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色后进行10天的ossification-inducing文化。的表达 β 调查了连环蛋白免疫印迹。 结果。TLR-3和地激活组增加了I型胶原和骨钙素的表达;地更大的影响。茜素红的强度和高山染色TLR-3激活组最强和最弱地激活。激活地减少的表达 β 连环蛋白,同时激活TLR-3并不影响的表达 β 连环蛋白。 讨论。本研究建议TLR-3和4促进分化的bmsc的观察。TLR-3骨化的诱导影响观察骨细胞,同时地的影响是相反的,因为它在Wnt信号通路的抑制作用。

 1。介绍

人们普遍认为干细胞作为种子细胞,结合骨组织工程支架,有利于骨折愈合是由于分化为成骨细胞的能力(观察)。骨化后,观察骨细胞转化,从而形成骨组织。然而,这不是骨形成的最后阶段。骨组织的生理功能不开发,直到重建骨组织完成突发和破骨细胞(OCs)。干细胞的分化的整个过程成熟骨组织被定义为骨生成的干细胞,是由各种细胞因子,如骨形成protein-2 (BMP-2)和纤维母细胞生长因子(FGF) [ 1, 2]。toll样受体(通常)是其中一个影响干细胞的成骨细胞因素( 3, 4]。

toll样受体(通常)是重要的类型的模式识别受体(PRRs)以及I型跨膜糖蛋白。他们最广泛表达于人类和其他动物的细胞和组织,不仅启动的主要免疫反应,也扮演着重要的角色在一般免疫系统和其他身体机能的调节包括增殖干细胞( 5]。此外,激活通常能引起各种炎症因子的分泌白介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)和前列腺素(PG)已被证明能够促进骨愈合的早期炎症( 6, 7]。据报道Raicevic和他的同事们,通常能够促进人类间充质干细胞的成骨的潜力通过炎症过程( 8]。推断,通常扮演重要角色的过程中骨生成的干细胞。TLR-3和表面地表达人类骨髓间充质干细胞(bmsc) [ 9),对炎症的规定有不同的影响 10]。虽然TLR-3促进分泌白细胞介素- 10”(il - 10),吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO)和前列腺素依照(PGE-2)和诱发急性炎症,地促进il - 6的分泌,引发,TNF - β 和诱发慢性炎症。因此,它是合理的建议的影响TLR-3地最有可能也不同骨生成的干细胞。

Wnt信号通路可能是一个重要的机制过程中骨生成的干细胞在基因转录水平调节OB函数( 11, 12]。Wnt信号通路的激活能增强osteoblastogenesis [ 13和促进骨形成 14]。 β 连环蛋白是Wnt通路的下游信号分子。胞质 β 连环蛋白积累的Wnt信号途径的激活,然后转移到细胞核。核 β 连环蛋白能够移植RUX-2的表达,这是至关重要的骨生成的干细胞,通过整合与T细胞因子/淋巴增强因子(TCF /中位数。

本研究旨在确定TLR-3的不同影响和地bmsc的分化为骨细胞的观察和骨化,观察。的另一个目的是探讨影响Wnt信号通路在此过程中骨生成的干细胞。

 2。材料和方法

隔绝后大鼠 ( n = 5 ) 描述( 15),伴着被流式细胞仪鉴定。第三代的bmsc被分为三组:TLR-3激活组( n = 12 井)、地激活组( n = 12 井),空白组( n = 12 威尔斯)。TLR-3激活细胞组织与TLR-3受体激动剂治疗,polyinosinic-polycytidylic酸(聚(我:C))(σ、美国、L2630-10MG), 10 ng / mL。地激活组的细胞治疗与脂多糖(LPS)(σ、美国、L2630-10MG), 10 ng / mL,地的活化剂。空白组的细胞没有治疗。所有治疗组在osteoblastogenic-promoting差异化培养介质(10<年代up>−810 mol / L地塞米松,更易与L β 钠甘油磷酸盐,50 mg / L维生素C, H-DMEM 10%胎牛血清(的边后卫)]。在10天的细胞培养、I型胶原和骨钙素的蛋白表达的细胞被免疫印迹检测(如前所述)( 16),为了证明TLR-3的影响和地的bmsc分化的观察。定量分析也执行。

为了演示不同的TLR亚型的影响骨化,骨细胞,碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色进行如下协议。在第十天,从老鼠诱导bmsc孤立的观察与osteoblastogenic-promoting区分媒介上面提到的。观察诱导bmsc的分为TLR-3激活组( n = 12 井)、地激活组( n = 12 威尔斯)和世界银行集团( n = 12 井),然后用同样的方法治疗。然后,所有这些组织细胞与ossification-inducing介质(3更易诱导L Na<年代ub>3阿宝<年代ub>4,50 mg / L维生素C,与10%的边后卫H-DMEM)另一个10天。之后,高山染色茜素红染色被执行在这些组织细胞。

上述三组的观察者,TLR-3激活集团地激活组和空白组,培养了10天,完全的表达 β 连环蛋白和核 β 连环蛋白免疫印迹检测。

 3所示。结果

流式细胞术结果显示,表面标记bmsc的积极(图 1)。细胞从老鼠分离鉴定为bmsc,并与这些细胞实验后。在目前的研究中,免疫印迹分析(图 2)透露,I型胶原蛋白的表达高于TLR-3激活组( t = 9.258 , P = 0.010 < 0.05 )和地激活组( t = 23.469 , P = 0.001 < 0.05 )与空白组相比。此外,地激活组的细胞表达高水平的I型胶原蛋白比TLR-3激活细胞组( t = 9.061 , P = 0.001 < 0.05 )。同样,骨钙素的表达高于TLR-3激活组( t = 5.854 , P = 0.017 < 0.05 )和地激活组( t = 20.663 , P = 0.001 < 0.05 比空白组)。地激活组和TLR-3激活组之间,骨钙素的表达高于前一个( t = 6.134 , P = 0.004 < 0.05 )。免疫印迹图像定量分析的数据表 1。

定量分析的免疫印迹( x ¯ ± 年代 )。

Collagen-I 骨钙素 总β-catenin 核β-catenin
对照组 0.063±0.004 0.322±0.018 0.806±0.022 0.792±0.031
TLR-3集团 0.209±0.027 0.509±0.052 0.788±0.019 0.769±0.017
地组 0.401±0.025 0.719±0.028 0.116±0.030 0.181±0.028

通过流式细胞术方法bmsc的识别。bmsc的流式细胞术检测的表达差别bmsc表面标记中描述的部分 2。所示这个集合代表bmsc的发现:积极表达CD29, CD95, HLA-I, CD44, CD34和CD14的负面言论 ( n = 7 ) 。黑色线条代表bmsc孵化与相应的同形像抗体控制。

西方墨点法collagen-I和骨钙蛋白。由不同的TLR bmsc刺激配体collagen-I和骨钙素分泌的影响。collagen-I和骨钙蛋白被西方墨点法分析评估。与综合治疗这是作为消极的控制,细胞刺激TLR-3配体和地配体分泌更多collagen-I和骨钙蛋白 ( n = 12 ) 。地配体的影响强于TLR-3配体。

茜素红染色(图的强度 3在空白组比地激活组( t = 4 。 017年 , P = 0.015 < 0.05 ),甚至弱TLR-3激活组( t = 4 。 791年 , P = 0.018 < 0.05 )。高山染色(图的结果 4),采用免疫(包含IHC)方法是相似的。高山染色的强度是强TLR-3激活组比空白组( t = 3 。 811年 , P = 0.012 < 0.05 ),而高山的强度在空白组比地激活组( t = 4.115 , P = 0.019 < 0.05 )。定量分析是在表的数据 2。

定量分析茜素红和高山染色( x ¯ ± 年代 )。

茜素红染色 高山染色
对照组 0.277±0.016 0.401±0.020
TLR-3集团 0.511±0.035 0.657±0.032
地组 0.082±0.020 0.109±0.011

当总和核的表达 β 连环蛋白被提及(图 5),它是在地激活组相比明显降低TLR-3激活集团( t 总 = 17 。 629年 , P 总 = 0.001 < 0.05 ; t 核 = 16 。 177年 , P 核 = 0.003 < 0.05 )和空白组( t 总 = 19 。 173年 , P 总 = 0.001 < 0.05 ; t 核 = 17 。 992年 , P 核 = 0.005 < 0.05 )。然而,没有差别的表达 β 连环蛋白之间TLR-3激活组和空白组( t 总 = 1 。 727年 , P 总 = 1.220 > 0.05 ; t 总 = 1 。 675年 , P 总 = 1.009 > 0.05 )。定量分析是在表的数据 1。

的表达 β 连环蛋白。免疫印迹分析是用于访问全部的表达 β 连环蛋白和核 β 光突发交换了连环蛋白TLR-3配体 ( n = 12 ) 和地配体 ( n = 12 ) 。未经治疗的观察作为消极的控制 ( n = 12 ) 。更多的表达 β 连环蛋白显示更好的Wnt信号通路激活。地配体抑制Wnt信号通路,而TLR-3配体不影响机制。

 4所示。讨论

这项研究清楚地表明,TLR-3和地bmsc的骨生成的影响。然而,这两个TLR亚型在不同阶段扮演不同角色的bmsc的骨生成。bmsc的分化观察被提拔的激活TLR-3和地。I型胶原和骨钙素检测照亮TLR-3和地的影响。I型胶原蛋白,骨基质和骨钙蛋白的主要成分,通过观察分泌。I型胶原蛋白的分泌高潮之间10到14天,观察在准备骨化,形成后的骨细胞( 10]。在过去的骨化,I型胶原蛋白的含量减少( 17]。骨钙素也分泌观察,参与一个骨化负反馈机制,骨钙素的分泌抑制overossification [ 18, 19]。I型胶原蛋白表达和蛋白表达的骨钙素是观察的指标的可行性。当前研究的结果表明,TLR-3和地促进分化的bmsc的观察。此外,地的激活是更有效的比TLR-3的激活。TLR-3和地的不同影响干细胞骨可以归因于不同引起的炎性环境不同的TLR亚型。TLR-3的过度所致急性炎症环境,抗炎等因素、PEG-2,和il - 10分泌而引起的慢性炎症环境中过度地、肿瘤坏死因子等促炎的因素 β ,分泌il - 6,引发 10]。据报道,促炎因子促进preosteoblasts[的分化 20.]。事实上玻璃等人的研究表明,肿瘤坏死因子- α ,一个典型的促炎因子,增强招聘和分化的干细胞,因此促进骨愈合 6]。此外,骨折修复在il - 6和TNF -被推迟 α 基因敲除小鼠与野生类型( 21, 22]。因此可能地激活可能参与促进促炎因子与分化相关的bmsc奥林匹克广播服务公司。

在骨化阶段,激活TLR-3和地显示相反的效果。高山和茜素红染色进行照亮成骨的影响。成熟的光突发释放大量的矩阵囊泡,每一个都包含大量的钙和有助于矿化( 23, 24]。茜素红染色这些钙存储橙色,和这些钙商店可以通过显微镜分析。据报道,高山表示矩阵的膜囊泡释放的成熟的观察者。因此,高山被认为是主要的监管机构的骨化OB ( 25]。与组织非特异性碱性磷酸酶-突发交换(TNAP−−),形成骨结节和骨化不能观察到;然而,观察与TNAP + /−可以形成骨结节,骨化延迟时( 25]。茜素红染色,因此ALP染色是最直接和有效的方法来确定光突发的骨化。结果表明,虽然骨化,骨细胞被TLR-3增强,抑制了地的激活。

鉴于激活TLR-3和地有相同的影响促进干细胞分化的观察,它是有趣的观察,TLR-3和地有不同的骨细胞的成骨效果的观察。很明显,有必要调查下游TLR-3机制和地,改变这些下游机制可以提供洞察TLR-3的不同影响,在干细胞骨生成地。Wnt信号通路促进骨形成和抑制骨吸收和骨代谢的最重要的一个信号通路( 26]。结构稳定、可溶的存在 β 连环蛋白在细胞质中,Wnt信号通路的下游信号分子,对完整的Wnt信号转导途径至关重要( 27]。缺乏 β 连环蛋白导致骨代谢异常和功能障碍的骨头 26]。据报道,地抑制Wnt信号通路在肠道上皮细胞的新生小鼠( 28]。因此,地也可能抑制Wnt信号通路在观察大鼠。为了研究这种可能性,的表达 β 光突发交换在地调查连环蛋白激活组和TLR-3激活组。在当前的研究结果支持地在Wnt信号途径的抑制作用,这或许可以说明的抑制效应的骨化地观察骨细胞,观察到在目前的研究。然而,激活TLR-3并不影响的表达 β 连环蛋白和Wnt信号通路。因此,TLR-3显示微分效应在骨化,相比地。

 利益冲突

作者都没有利益冲突。

 确认

这项研究是由江苏大学。感谢张志坚博士将他的指导实验。感谢曹Xinbin博士将他的帮助在数据分析。

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