文摘

的发病机制失调的免疫调节的间充质干细胞(msc)强直性脊柱炎(AS)被认为是一个复杂的过程,涉及多个基因改变。在这项研究中,来自健康的捐赠者和msc患者正常的媒体或媒体模仿炎症环境中培养。全基因组表达谱分析的33351个基因进行了相关的差异表达基因,为分析去分析和KEGG途径分析。我们的研究结果表明,在正常媒体676基因的表达有差异,354年调节和322个表达下调,而在炎症环境1767基因的表达有差异,1230年调节和537个表达下调。分析表明,这些基因主要是细胞过程、生理过程,生物调控、生物过程的监管,绑定。此外,通过KEGG通路分析,14个关键基因从MAPK信号和8个关键基因TLR信号通路被认定为不同监管。中存在的结果验证上述9基因的表达变化。我们的研究发现,在炎症环境强直性脊柱炎发病机制可能与激活MAPK和TLR信号通路。

1。介绍

强直性脊柱炎(AS)是一种慢性,免疫介导的炎症性疾病,其特征是炎症背部疼痛和enthesis [1]。到目前为止,已经提出一些假设来描述这种疾病背后的发病机理,包括遗传易感性HLA-B27 [2]和ERAP1 [3)、感染(4),和环境因素(5]。然而,这些假说可以完全占强直性脊柱炎的发病机制。最近的证据日益表明,自身免疫性疾病可能参与该病的发病和发展(6]。

它最近表明,间充质干细胞(msc)具有免疫抑制功能抑制Th17细胞和诱导Treg亚种群的CD4 + T细胞(7,8]。相比2011年,我们的研究表明,健康的捐赠者,msc的免疫调节能力降低的患者。这是通过增加Th17细胞和减少Treg细胞CD4 + T细胞后子组混合淋巴细胞反应(高)9]。此外,我们的临床试验也表明,注入msc是可行的,安全的,和有前途的治疗患者(10]。因此,我们相信,msc可以发挥重要作用的调节功能改善疾病状态或临床症状的患者,msc的免疫调节功能障碍的发病机制的研究中可能发挥重要作用。

最近,一些研究人员进行全基因组表达谱分析比较患者健康献血者(11- - - - - -13]。这些研究发现与HLA-B27拥有强大的协会,和其他non-HLA易感基因,如IL23R和ERAP1 [14,15]。然而,这些基因变异可能没有完全占强直性脊柱炎的发病机制。例如,HLA-B27只占~ 45%的遗传风险。因此,在这项研究中,我们主要关注的重要作用msc在发病机理提供一个新的视角炎性疾病。我们的研究调查了msc在体外是否从病人表现出基因表达差异在正常培养基或在炎症环境中,与健康对照组相比。我们发现,模仿炎症环境可以激活MAPK和TLR信号通路在msc来自病人,从而上调炎症基因的表达。这些数据提供了暗示的线索在强直性脊柱炎背后的发病机理的探索。

2。材料和方法

2.1。病人和控制

本研究经伦理委员会批准的中山大学孙逸仙纪念医院,广州,中国。从2012年6月到2012年12月,十二个健康献血者(高清,9男3女),平均年龄为22.1岁和12个病人(10男2女),平均年龄为21.9岁参加这项研究(表1)。作为患者的诊断都是根据研究分类标准执行(16]。此外,所有患者首次确诊和仍在活跃阶段(所有浴强直性脊柱炎疾病活动指数4)。

2.2。隔离和msc的准备

后了解科学意义、可能的风险和并发症,为骨髓的愿望和治疗措施,所有捐助者和患者签署知情同意和被我们吸气熟练的专职医护人员严格按照国际标准化的过程。骨髓msc被孤立于骨髓吸入等密度梯度离心法如前所述,我们的工作和其他人的9,17]。后确定MSC immunophenotype标记流式细胞术,通道3到5用于下面描述的实验。HD和组分为两个子组:msc培养正常的媒体(规范)和msc在炎症环境中培养(Infla)是由添加TNF -α(10 ng / mL)和干扰素-γ(10 ng / mL)为四个小时正常培养基。5培养的msc的代表HD患者随机选择,培养这两种类型的媒体,进一步分析。20个样本选择完整的全基因组表达谱:5 HD-Norm 5 HD-Infla, 5当成一种常态,5 AS-Infla样本。

2.3。总RNA提取和质量控制

1毫升试剂盒(美国卡尔斯巴德英杰公司)被添加到溶解收集细胞。用酚/氯仿法提取总RNA和盐和70%的酒精冲走。后用电吹风在15 ~ 30°C, RNase-free适量的水加入到溶解RNA。完整性和集中的RNA进行评估,以确保准确性和可靠性。总RNA从每个样本量化使用NanoDrop 1000和RNA完整性评估标准变性琼脂糖凝胶电泳。大约5μg总RNA从每个样本用于标签和阵列杂交以下步骤:(1)通过表达载体上标ds-cDNA逆转录合成设备;(2)ds-cDNA与罗氏一种颜色标记的DNA标记设备;(3)使用罗氏阵列杂交杂交系统,其次是洗涤与罗氏洗缓冲设备;(4)阵列扫描使用轴突GenePix 4000 b基因芯片扫描仪(分子设备公司)。

2.4。微阵列扫描和数据分析

然后扫描图片导入NimbleScan软件(版本2.5)网格对齐和表达数据分析。数据被分位数标准化规范化和健壮的多片平均(RMA)算法包含在NimbleScan软件。探测水平文件和基因水平正常化后生成的文件。20个基因水平文件导入到安捷伦GeneSpring GX软件(版本11.5)进行进一步分析。GeneSpring分位数正常化后,差异表达基因被确定使用火山情节过滤。KEGG通路分析,分析被应用于确定这些差异表达基因的作用在生物通路或条款。最后,事后Bonferroni测试是用于正确的多样性因为大量的假阳性观察值。值< 0.01被认为是重要的。

2.5。定量实时聚合酶链反应(存在)

msc后炎症环境中培养上面所提到的,总RNA提取使用试剂盒试剂(美国生命科技有限公司)。互补脱氧核糖核酸的合成(rt - pcr)进行了使用SuperScriptH三世第一链合成系统(英杰公司)根据制造商的指示。实时定量PCR(存在)分析光周期计480实时PCR系统(罗氏,巴塞尔)使用SYBR预混料交货Taq II工具包(豆类,大津)。定量pcr试验项目是30年代的95°C,紧随其后的是40个周期95°C的5 s和60°C 20年代。平均mRNA水平计算从每个样本一式三份分析和融化曲线分析确认的具体放大目标。目标基因的相对数量或褶皱变化是规范化的看家基因的表达β肌动蛋白。部分中使用的引物序列实时PCR分析如下:β肌动蛋白:5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′(向前)和5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′(反向);GNA12:5′-CCGCGAGTTCGACCAGAAG-3′(向前)和5′-TGATGCCAGAATCCCTCCAGA-3′(反向);DUSP1:5′-AGTACCCCACTCTACGATCAGG-3′(向前)和5′-GAAGCGTGATACGCACTGC-3′(反向);MAPK11:5′-CTGAACAACATCGTCAAGTGCC-3′(向前)和5′-CATAGCCGGTCATCTCCTCG-3′(反向);RAC1:5′-ATGTCCGTGCAAAGTGGTATC-3′(向前)和5′-CTCGGATCGCTTCGTCAAACA-3′(反向);MAPK3:5′-CTACACGCAGTTGCAGTACAT-3′(向前)和5′-CAGCAGGATCTGGATCTCCC-3′(反向);TRAF3:5′-CAGACTAACCCGCCGCTAAAG-3′(向前)和5′-GATGCTCTCTTGACACGCTGT-3′(反向);IFNAR1:5′-AACAGGAGCGATGAGTCTGTC-3′(向前)和5′-TGCGAAATGGTGTAAATGAGTCA-3′(反向);白细胞介素6:5′-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3′(向前)和5′-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′(反向);IFNA1:5′-GCCTCGCCCTTTGCTTTACT-3′(向前)和5′-CTGTGGGTCTCAGGGAGATCA-3′(反向)。

3所示。结果

3.1。识别MSC Immunophenotype

骨髓msc被吸入物的健康志愿者和病人。msc是培养和纯化根据文化同质性方法中描述我们的以前的工作9]。图1(一)显示附着msc越来越像相交轴包。此外,immunophenotyping是由流式细胞术。点图显示所有(无门的)细胞以及封闭的msc是显示在图1 (b)。msc持续表达CD29、CD44和CD105但不CD34、CD45、或HLA-DR(图1 (c))。

3.2。微阵列杂交和数据分析

实验系统稳定,荧光信号强度是强大和同质。当炎症条件下培养,msc从病人的差异表达的基因数量增加(图2(一个))。当成一种常态组的差异表达基因有676,其中354是调节和322年相比HD-Norm组表达下调。1767个基因的差异表达AS-Infla集团1230年调节和537个表达下调,而HD-Infla组。我们使用(基因本体)去分析这些差异表达基因在三域(图2 (b))。

在生物过程域,我们发现79年重大功能描述节点组当成一种常态,这主要是与细胞内的信号级联,积极调节细胞代谢过程,调控的分子功能,积极的高分子代谢过程的监管,积极调节细胞生物合成的过程,和积极的代谢过程的监管。有134个功能描述节点(组AS-Infla与组BD-Infla),主要是与信使rna代谢过程,nucleobase、核苷、核苷酸和核酸代谢过程,细胞周期,细胞有丝分裂细胞周期,基因表达和氮化合物代谢过程(表2)。

在细胞组件领域,发现8个重要功能描述节点当成一种常态集团BD-Norm组相比,主要位于细胞外区域,细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复杂,细胞外区域部分,角蛋白纤维,神经元投射,胞质微管,细胞外空间,顶端等离子体膜。相比之下,与集团BD-Infla相比,有44 AS-Infla集团重要的功能描述节点,主要位于细胞内部分,细胞内面上细胞器,面上细胞器,胞内细胞器内腔,细胞器内腔(表3)。

分子功能域,相比BD-Norm组有12个重大功能描述节点当成一种常态组,如蛋白质酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活动,生长因子活性,纤维母细胞生长因子受体结合,以及受体信号蛋白的活动。同时,20个重要功能描述节点(组AS-Infla与组BD-Infla)被发现,其中包括蛋白质绑定,核酸绑定,绑定structure-specific DNA, RNA绑定,和己糖胺酶活动(表3)。

3.3。检查相关的信号通路

KEGG路径分析是用来发现关键信号通路和差异表达基因之间的关系。在炎症环境中,两个指标的得分最高组hsa04010:增殖蛋白激酶(MAPK)信号通路,和hsa04620: toll样受体(TLR)信号通路(表4)。在MAPK通路,有14个差异表达基因():DUSP1、GNA12 RAC1、mra ELK1, ATF4, MAPK3, CDC25B, STMN1,马克斯,TGFBR2, MAPK11, CACNB3, FGF8, RASA2(表5)。在TLR通路,有8关键基因表达显著差异():RAC1、TRAF3 MAPK3、IFNAR1 TICAM1,白细胞介素6,MAPK11和IFNA1(表5)。然而,只有两个差异表达基因(CACNA2D3和PPM1B) MAPK通路和一个关键基因(TLR6)在TLR通路组织培养在正常的媒体,都与一个无关紧要的KEGG分析分数()。的结果中存在上述验证这些基因的表达变化,包括GNA12 DUSP1, MAPK11, RAC1, MAPK3, TRAF3, IFNAR1,白细胞介素6、IFNA1(图3)。

4所示。讨论

强直性脊柱炎是一种慢性炎症性关节炎。我们以前的工作展示了其发病机制可能与msc在患者的免疫调节功能障碍(9]。功能失调的免疫调节的msc的发病机理被认为是一个复杂的过程,涉及多个基因改变。在这项研究中我们集中利息msc的差异之间的病人和健康的捐赠者和全基因组表达进行分析。我们的研究表明,当成一种常态组之间有676个基因差异表达和HD-Norm集团354年调节和322个表达下调。1767年基因AS-Infla组和HD-Infla组之间的差异表达,1230个调节和537个表达下调。此外,我们发现,当在炎症环境中培养,msc从病人建议MAPK和TLR信号通路的激活。

通过去分析,差异表达基因在生物过程主要是与信使rna代谢过程有关,nucleobase、核苷、核苷酸和核酸代谢过程,细胞周期,细胞有丝分裂细胞周期,基因表达和氮的化合物代谢过程。此外,差异表达基因主要在分子功能主要是与蛋白质绑定,核酸绑定,绑定structure-specific DNA, RNA绑定和己糖胺酶的活动。此外,KEGG路径分析表明,MAPK和TLR信号通路与msc从患者显著相关的炎性环境。

一些早期的研究已经证实,肿瘤坏死因子诱导msc的反应通过激活MAPK-dependent机制(18]。此外,因为患者的全血转录分析也显示炎症候选基因包括MAPK [19]。我们必须考虑到,在炎症条件下,MAPK信号通路可能发挥关键作用在msc的病人。在这项研究中14 MAPK信号传导基因差异表达,包括GNA12 DUSP1, MAPK11, RAC1, mra, ELK1, ATF4, MAPK3, CDC25B, STMN1,马克斯,TGFBR2, CACNB3 FGF8, RASA2 ()。其中一些基因已报告有一个与免疫系统的关系,甚至与炎症性自身免疫性疾病。例如,GNA12已被证实能扮演一个关键的角色在溃疡性结肠炎的发展障碍函数(20.]。DUSP1(也称为MKP1)已被证明是一个关键的负面调节器炎性细胞因子(21]。增加表达DUSP1 AS-Infla组可能是系统性炎症病人的结果。此外,RAC1激活可以直接引起IL17A [22)和RAC1抑制肽被发现抑制T细胞的活化作用和自身抗体在自身免疫性疾病(生产23]。MAPK11(也称为p38BETA)的四个p38MAPK家族成员(p38alpha, p38BETA、p38gamma p38delta)。现在大量的证据表明,p38MAPK活动对于正常的免疫和炎症反应是至关重要的。p38MAPK通路是促炎细胞因子生物合成的关键调节器在转录和翻译水平,使组件的途径有吸引力的潜在目标治疗自身免疫和炎性疾病24]。此外,p38MAPK抑制剂已被证实是有效的在类风湿性关节炎的动物模型,如胶原诱导关节炎的鼠标和adjuvant-induced关节炎大鼠(25,26]。我们的研究报道,上述基因显著调节msc的患者,建议在强直性脊柱炎的发病机制中的作用。然而,这些差异表达的基因之间的关系和强直性脊柱炎以前没有报道。

众所周知,upregulation TLR取决于MAPK信号(27]。我们目前的研究发现,八个关键基因从TLR信号通路(包括RAC1、TRAF3 MAPK3, IFNAR1, TICAM1,白细胞介素6、MAPK11,和IFNA1)有显著差异表达()。一些先前的研究报道,白细胞介素6可能参与类风湿性关节炎(RA)的发病机理,和一些临床试验的安全性和有效性进行了评估Tocilizumab-an anti-IL6抗体RA患者(28]。增加白细胞介素6表达的患者中观察到我们的研究可能提供一个有用的线索说明它的发病机理。此外,肿瘤坏死因子receptor-associated因子3 (TRAF3)是一种消极的调节器IL17受体(IL17R)信号。TRAF3抑制IL17-induced NF -κB和增殖蛋白激酶激活和炎性细胞因子和趋化因子的后续生产29日]。TRAF3观察AS-Infla组表达增加可能是由于持续的炎症的病人。此外,科尔等人证明IFN-1生产抗炎细胞因子中扮演着重要的角色,维护肠道T细胞内稳态的限制效应T细胞扩张和促进Treg稳定(30.]。使用基因敲除小鼠模型,De Weerd等人发现lipopolysaccharide-induced脓毒症改善老鼠但不老鼠,这表明IFNAR1-IFN -β信号扮演一个在炎性疾病病理作用[31日]。本研究发现IFNA1显著降低而IFNAR1增强在msc来源于患者炎症环境中培养,占增加促炎的能力和减少抗炎状态的病人。

5。结论

我们目前的研究证实,作为源于多个基因相互作用的发病机制和关键信号通路激活。我们的研究发现,炎症环境可能激活MAPK和TLR信号通路在msc来自病人,导致upregulation炎症基因的表达。这些数据提供了暗示的线索探索强直性脊柱炎的发病机理。最后,进一步验证和确认这些差异表达基因的发病机理是将需要在未来的研究。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

玉溪李和彭王同样贡献了这个工作。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(81271951、81271951和81271951),广东省自然科学基金(S2012010009654 S2012010008927, 10151008901000076)和广州科技基金会(2014 j4100167)。作者感谢明梁任实验室和技术支持。此外,作者感谢所有同事提供细胞生物疗法中心的协调。

补充材料