DiD碳菁染料标记对小鼠间充质干细胞免疫调节功能及分化的影响

抽象的

间充质干细胞(MSCs)已被用于治疗各种退行性疾病。用合适的示踪剂标记间充质干细胞对证明这一点至关重要体内植入和移植的MSC的分化。所做的是亲脂性的荧光染料用近红外发射光谱，使得它适合于体内跟踪。因此，在本研究中，研究了标记对氧化应激和细胞凋亡的诱导的后果以及间充质干细胞（MSCs）的抑制作用。标签没有挑起ROS的生产，诱导细胞凋亡，或通过MSCs抑制免疫抑制因子（PGE2和IL-10）的产生。此外，在抑制增殖和细胞因子生产中，DID标记和未标记的MSCs之间没有统计差异（IFN-和IL-17）通过在体外刺激后脾细胞或改善EAE的临床评分体内行政。此外，标签没有改变MSC的差异化容量。一起携带，可以被认为是一种安全的染料体内跟踪MSCS。

1.介绍

在具有分化成各种细胞类型能力的干细胞中，具有免疫抑制功能的间充质干细胞(MSCs)是治疗自身免疫性疾病的有前途的工具，甚至在异基因环境中。MSCs治疗自身免疫性疾病的功效主要依赖于抗炎细胞因子的产生对持续炎症反应的抑制以及它们分化为功能细胞的能力[1- - - - - -3.]．目的:研究间充质干细胞向受损组织的迁移体内分化为受伤的细胞，需要适当的追踪系统的可用性。已经使用不同的成像方法来追踪注射MSC的位置而不牺牲动物。然而，基于生物发光的非侵入性成像技术，使用酶转化/保留的单光子发射计算断层扫描和正电子发射断层扫描需要稳定的转基因整合[4，5］．每个成像会话的干细胞遗传操作和静脉内注射潜在免疫原基质的要求是这些方法的缺点。核成像也有几个缺点，包括暴露于辐射，高成本和几乎所有核示踪剂的半衰期[6]．选择追踪注射后细胞命运的技术是基于荧光的体内光学成像，其与的能力的安全和非侵入性的方法体内随着时间的推移标记的细胞的追。除了生物相容性和分辨率的担忧，缺乏对MSCs的期望生物学功能的选择示踪剂的影响也非常重要。因此，用于任何示踪体内MSCS跟踪应影响免疫调节功能，也不会影响MSC的分化能力。

荧光亲脂性碳酸染料在水中不溶于水，但当掺入膜中时容易检测到它们的荧光。它们被归类为标签和跟踪中最合适的染料系列之一。亲脂碳菁染料掺入细胞膜中并在细胞血浆膜中横向扩散，导致整个细胞的染色[7，8]．简单的染色程序，与细胞膜磷脂的结构相似性，并且细胞中的延长染料保留是在活生物体中使用这些染料的优点[9，10.]．在这个家庭的成员中，具有长波长激励和发射光谱的确实适合体内由于NIR荧光避免了靶组织与背景荧光的干扰并在跟踪染料时产生高对比度的成像体内成像系统[10.，11.]．有趣的是，已用来标记MSCs，没有干扰MSCs分化为软骨细胞[11.]．然而，DiD标记对免疫抑制功能和MSCs向成脂或成骨细胞分化的影响仍有待研究。因此，本研究旨在阐明DiD标记对人体健康的可能影响在体外将DID标记的MSCs分化为脂肪发生，卵形和神经祖细胞以及在体外和体内did标记的MSCs的免疫抑制功能。

2。材料和方法

2.1。动物

雌性C57BL / 6和雄性BALB / C小鼠购自伊朗Pasteur学院，并在25°C下维持在12小时光/暗状态下。2至5周龄的Balb / c小鼠用于分离MSCs。实验性自身免疫脑脊髓炎（EAE）在C57BL / 6小鼠中诱导。所有的动物都是根据国家卫生研究所的保健和使用实验室动物（NIH Publication，1985）在Shiraz医学科学大学动物屋的情况下维护。

2.2。间充质干分离，培养，鉴定，并没有标签

根据先前报道的方法是由Da Silva Meirelles和Nardi的方法与股骨和胫骨分离的MSCs [12.]．简而言之，来自股骨的骨髓细胞和Balb / C小鼠的胫骨悬浮在适当的培养基中并保持在5％的CO₂气氛中，在37℃下用95％的湿度。After 24 h, the suspended cells were removed by changing the medium. After reaching 70–90% confluence, the adherent cells were trypsinized and moved to a new flask with suitable density. In order to separate the pure MSCs population, trypsinization of MSCs was repeated for at least 4 times when the cells reached suitable confluence. MSCs in passage 5 were trypsinized and analyzed with flow cytometry (BD FACSCalibur, USA) for surface markers using phycoerythrin- (PE-) conjugated anti-CD45, anti-CD44, and anti-Sca-1 as well as fluorescein isothiocyanate- (FITC-) conjugated anti-CD34 (eBioscience, UK) and anti-MHCII (BD Pharmingen, USA) antibodies. Proper isotype controls were used in all experiments. The data were collected and analyzed by Cell Quest and Flow Jo software (version 7.6), respectively. MSCs were labeled with different concentrations of DiD to determine the highest nontoxic concentration of the dye which could be traced after multiple division of MSCs. Accordingly, staining of MSCs was performed with 5 μ.米的。简而言之，1×10⁶MSCs悬浮在含5μ.M在37°C，95％湿度下和5％CO的湿度下（AAT Bioquest，USA）20分钟₂．用PBS洗涤标记的细胞3次以除去过量的方法并在进一步的实验中使用。

２.３.did标记的间充质干细胞的增殖能力

标记5后评估MSCs的增殖能力μ.中号一样。总共2×10^3.将标记和对照细胞计数和镀在96孔板中。在30小时的培养期后，MSCs脉冲0.5 μ.ci [^3.H]-methylthymidine (MP Biomedical, USA) 18小时测定褶皱扩张。

２.４.MSCs活性氧(ROS)的产生

使用二氯荧光素二乙酸酯(DCFDA, Invitrogen公司，美国)染色测定did标记的间充质干细胞中ROS的产生[13.]．DiD的标记的和未标记的MSC（2×10⁵）用2ml DMEM在6孔板中温育一天。然后，将DCFDA（最终浓度10mm）加入到CO中的培养物中30分钟₂孵化器。之后，用PBS洗涤细胞三次，并通过流式细胞仪定量胰蛋白酶，染料强度定量。

2.5。MCS的线粒体膜电位（MMP）

MMP降低是细胞凋亡的早期指标。根据Chang等人报道的程序[14.]，2×10⁵标记或未标记的间质干细胞接种于6孔板中，并与40 nM的3,3-二己基氧杂碳菁DiOC6(3) (Enzo life Sciences, USA)在37℃下孵育20分钟。培养后，将MSCs冲洗，PBS重悬，用流式细胞仪检测荧光强度。

2.6。DiD的-标记细胞分化

将MSCs细胞与5孵育 μ.M DiD 20 min，培养1 d后开始分化。除了用DiD标记外，对对照井进行相同处理。为向脂肪细胞分化，70%的融合细胞在DMEM中添加1μ.M地塞米松，0.5 μ.中号抗坏血酸磷酸盐，和200 μ.m indomethacin [15.]．培养基每2-3天改变。还通过用0.5％油红O染色10分钟，将细胞内积聚脂质耐水解。用补充有1的培养基进行成骨分化 μ.M地塞米松，10毫米β- 甘油磷酸盐和0.5 μ.M抗坏血性磷酸盐10天[16.]．通过每三天改变一次培养基通过细胞喂食细胞。钙沉积透露1％茜素红染色10分钟。对于神经前体（NP）分化，1×10⁶/毫升的MSC从通道7-10的neurobasal分化培养基中培养，在其上作为由生死谍变等人描述了用于加强神经球感应琼脂糖凝胶包被的板。[17.]．Neurobasal培养基得到1％B27，1％胰岛素转移 - 硒沸石，2mM L-谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素，10％FBS，1ng / mL B-FGF和1 μ.中号DHEA。差异化的所有材料从Sigma公司购得。7天后，神经球的形成的鉴定通过显微镜检查和收集细胞来调查神经干细胞标记物（巢蛋白）通过实时PCR的表达。总细胞RNA通过RNAX Plus试剂盒（Cinnagen公司，伊朗）从神经球分离。此外，cDNA被从2合成 μ.使用随机六聚体引物和M-MuLV逆转录酶(Fermentas, USA)在42°C下处理60分钟。Nestin引物序列(正向、反向)分别为:5 ' -TACAGAGTCAGATCGCTCAGATCC-3 '， 5 ' - cagagtcctgtatgtagccac -3 '。这两个引物都有一个内含子跨越，以避免基因组DNA污染。利用选择性引物5 ' -AGCTTCTTTGCAGCTCCTTCG-3 '和反向引物5 ' -CATCCATGGCGAACTGGTG-3 '将PCR反应归一化β-Actin作为内部控制。如下扩增cDNA：在95℃下温育10分钟，然后在95℃下在95℃下为40℃，在60℃下为1分钟。在反应结束后，观察到实时PCR产物的熔化曲线用于产品的特异性。

2.7。混合白细胞反应(MLR)

在MSCs存在下进行MLR，比较未标记MSCs和did标记MSCs的免疫调节功能。3×10⁴从段4-6中的细胞在含有10％FBS，100u / ml青霉素和100的DMEM中播种在96孔板中。 μ.g / ml链霉素。8小时后，用PBS和3×10洗涤MSCs两次⁵CFSE标记的脾细胞（1.5×10⁵来自C57BL6和1.5×10⁵从BALB / C小鼠中加入到MSC中。脾细胞用10次标记 μ.M CFSE在150中 μ.l rpmi 15分钟。1 μ.g/ml刀豆蛋白A加入每孔，未刺激的脾细胞除外(阴性对照)。5 d后，收集脾细胞，采用流式细胞术检测CFSE荧光强度对细胞增殖的影响。

2.8。did标记的间充质干细胞治疗EAE

猫_35-55肽（Mevgwyrspfsrvvhlyrngk，Peptron，韩国）用于在C57BL / 6小鼠中诱导慢性EAE [18.]．简而言之，200 μ.g米木_35-55在200岁稀释 μ.L PBS与200μ.L皮下注射PBS中的不完全弗氏佐剂（Gibco，德国）和1毫克/ ml热灭活的分枝杆菌（Difco，USA）被皮下注射。莫尔后_35-55行政管理，200ng Pertussis毒素（名单生物实验室，美国）在免疫之日和两天后腹腔内注射。EAE的临床评分每周至少记录3次。EAE标志得分如下：0 =没有疾病，1 =跛行尾，2 =后肢瘫痪，3 =瘫痪所有四肢，4 =奄奄一息状况，5 =死亡[19.]．将小鼠分成三组，每个小鼠含有5只小鼠的平均临床评分为2.2。在治疗组的第22,29和36天内注射一百万标记的或未标记的MSC，在0.2毫升PBS中注射到治疗组的腹膜中，而对照EAE小鼠在同一天接受0.2ml稀释剂。直到第45天，小鼠进行。为了检查DID标记的MSCs对抗原特异性免疫抑制的影响，初始施用MSC的24天，用沼泽刺激EAE小鼠（处理和未处理）的脾细胞_35-55通过肽和增殖进行评估^3.H-thymidine合并。简而言之，2 × 10⁵小鼠脾细胞经20μ.g /撤走_35-55．在72小时的培养期后，用0.5脉冲脾细胞 μ.ci / well [^3.H] - 甲基吡啶（MP生物医学，美国）18小时以确定膨胀的折叠。通过测量放射性核素摄取β闪烁计数器(瓦拉克，德国)。

2.9。ELISA的细胞因子检测

上清液1 × 10⁶在2 mLs DMEM中培养24小时后收集标记为did和未标记的MSCs，在−70°c冷冻，直到检测细胞因子水平。同时收集MLR上清液，在相同条件下进行细胞因子分析。MSCs上清中PGE2、IL-10水平以及PGE2、IL-10、IFN-水平γ.并且根据制造商的说明（Mabtech，UK），通过酶联免疫吸附测定（ELISA）定量分析MLR上清液中的IL-17。来自治疗方法的血清（用标记和未标记的MSCs）和未处理 - EAE小鼠的炎症水平（IFN-γ.IL-17)和抗炎(IL-10)细胞因子的测定。

2.10。数据分析

数据显示为平均值±SD。Kruskal-Wallis测试用于检查组之间的整体差异。也是曼恩惠特尼用于分析治疗和未经处理的EAE基团之间的临床评分和细胞因子水平的差异。SPSS 15软件用于统计分析。被认为是统计学意义。

结果

标记和未标记的MSC均以均质成纤维细胞形状的图案生长。此外，用于表达CD44，SCA-1，MHC II和造血干细胞标记物（CD45和CD34）的MSCs的流式细胞术分析显示，第五段（未显示数据）中的大于95％纯度。

3.1。did标记的间充质干细胞的增殖能力

为了评估标记DiD的对MSCs的增殖可能的效果，将细胞用染色DID和48小时后培养物脉冲与[^3.H] -methylthymidine 18小时。DiD的标记和完整MSC之间没有观察到显著差异（CPM和CPM，REAC .;；数字1(一)）.

３．２．did标记的间充质干细胞的多谱系分化能力

在分化条件下培养10天后，分别用茜素红和油红O染色，证实MSCs细胞质中有钙沉积和脂空泡的积累。显微镜检查未标记的MSCs成骨分化能力无显著差异(图)图2（a））并标记为MSC（图2（b））.同样，DID标记的MSCs（图2 (d))显示出与完整MSCs相同的成脂分化能力(图图2（c））.此外，在适当的分化介质的培养七天后，还评估了未标记的和标记的MSCs进入NPS的分化。显微镜检查证明了未标记的MSC的分化（图2 (e))以及did标记的间充质干细胞(图2 (f)）根据神经圈的形成进入NPS。此外，与MSC相比，Nestin的MRNA表达水平越增加，NPS在NPS中几乎增加，而NPS衍生自未标记的MSCs的NPS之间的巢蛋白mRNA表达没有显着差异，并且标记为标记的MSC（和，resp .;）.

3.3。DID标记的MSCs中的线粒体膜潜力和ROS生产

中所做标记，线粒体膜电位和ROS产生由DiD的标记的MSC的毒性的情况下，通过DiOC6（3）和标记DCFDA，分别评估。结果表明，有在平均荧光强度DiOC6的（MFI）（3）之间DiD的标记的和未标记的MSC（没有显著差异和，resp .;；数字3(一个)）.为了进一步巩固DiD标记对MSCs功能的安全性，我们还通过DCFDA染色研究了细胞凋亡的可能发生。在did标记的MSCs和未标记的MSCs中，DCFDA的MFI无显著差异(和，resp .;；数字3 (b)）.因此，结果证实DiD的标记不影响MSCs的活力。

3.4。PGE2和IL-10通过DID标记的MSC制作

本研究的结果表明，未标记的和标记的MSCs能够产生可检测和统计上类似的PGE2水平（和pg / mL,分别地;；数字1 (b)）和IL-10（和pg / mL,分别地;；数字1 (c)）24小时后的培养。PGE2生产中也没有显着的统计差异（和pg / mL,分别地;）或IL-10合成（和pg / mL,分别地;）在48小时文化之后，未标记的和标记的MSC之间。

3.5。抑制脾细胞的增殖和细胞因子产生通过标记的MSCs

为了测试MSCs对脾细胞的抗溶剂函数，在存在和不存在MSC的情况下进行MLR反应。在没有MSC的情况下以双向MLR检测到明显的增殖（%;数字4(一)），虽然MSC /脾细胞的1：10细胞比例显着降低，但MSCs是否未标记，而Proiferative反应显着降低（％，；数字4（b）)或标有DiD (％，；数字4（c））.这可能是PGE2过量产生的结果，因为对MLR上清液的分析显示，在未标记和did标记的MSCs存在时，PGE2表达上调( pg/mL and pg/mL, resp.) in comparison to supernatant of MLR reaction in the absence of MSCs ( pg/mL;对于相比;数字4（d））.有趣的是，如图所示4（d）与MSR在没有MSCs的情况下，未标记的和标记的MSC的存在显着降低了IL-10的水平（ pg/mL,pg / mL,pg / mL,分别地;两个),干扰素-γ.（ pg/mL,pg / mL,pg / mL,分别地;对于两者而言，和IL-17（ pg/mL,pg / mL,pg / mL,分别地;对于培养上清液中的两者），而在未标记的和标记-MSCs的情况下，上述细胞因子的水平在来自MLR收集的上清液之间没有显着差异。

3.6。EAE临床评分的提高

三次注射有或没有确实标记的同种异体MSCs的临床评分（和，resp。）与控制未经治疗的小鼠（；对于两个比较;数字5（a））.在临床评分方面，血清水平的促炎细胞因子（IFN-γ.在用标记的小鼠血清中显着下降（ pg/mL andpg / mL,分别地;和，resp .;数字5）或未标记的MSCs（ pg/mL andpg / mL,分别地;和，resp .;数字5）与未经治疗的对照小鼠的对照小鼠相比（ pg/mL and pg/mL, resp.). Of interest, the levels of IL-10 were significantly higher in untreated control mice (pg/mL)与标记MSCs处理小鼠(，；数字5（b））或未标记的MSCs（，；数字5（b））.与促炎细胞因子类似，在用未标记的MSCS处理的小鼠之间观察到IL-10水平没有显着差异，并标记为标记的MSCs（ pg/mL andpg / mL,分别地;；数字5（b））.还，在体外用沼泽刺激EAE治疗小鼠的脾细胞_35-55Peptide显示出比对照组小鼠更少的增殖，尽管这种差异并不显著(用于未标记和对于已标记的MSCS组，RESP .;数字5（c））.

4。讨论

最近的研究已在的MSC作为有效的治疗的候选人炎症和自身免疫介导的疾病的线索。MSC的特权优点包括它们在分化成多种细胞类型的能力[1，2，20.]抑制对免疫反应的影响[3.，21.]．但是，缺乏对MSC的独特和经过身份验证的标记体内追踪使得研究人员采用了各种非特异性追踪方法。使用生物相容性荧光染料(如DiI)的光学成像跟踪间充质干细胞已在若干研究中得到评估[22.，23.]．然而，由于与背景荧光的干扰较低，使用长波长发射光谱的“DiD”是首选[10.，11.]．因此，可以被认为是DII的合适替代品。由于缺乏对MSCs的生物学功能的标记的可能影响的出版调查，研究了在该研究中，研究了在活力，增殖，免疫抑制活性和MSCs的分化潜力上进行标记的后果。本研究结果表明，用5个标签 μ.M确实没有诱导MSCS中的ROS生产。此外，作为早期细胞凋亡的标志物，DID标记的MSCs中的线粒体膜电位保持不变。此外，在标记的标记和对照MSC之间没有观察到其增殖性效力的显着差异。结果，5 μ.M对MSCs既无凋亡作用，也无细胞抑制/细胞毒性作用。这一结果与之前的报告一致，表明标记为4μ.中号的DiI对间充质干细胞抑制无/细胞毒性作用[22.，23.]．

标签对MSCs分化能力的不良影响一直是研究人员的另一个担忧。目前的研究表明，标记不影响MSCs对不同祖细胞的分化能力，包括脂肪细胞和骨细胞的不同祖细胞，并在形态学和分子水平下朝神经前体分化（巢蛋白mRNA的表达）。Sutton等人。表明，DID标记的人体MSCs将其能力维持分为软骨细胞谱系[10.]．虽然在分化时降低了标记的MSC的糖胺基聚糖水平，但标记对细胞形态没有明显的影响[10.]．Weir等人。[22.]和Dai等。[24.还表明，用DII标记MSCs并没有干扰它们分化成心肌细胞的能力。总体而言，与一些报道相比，揭示了揭示了对抗的负面影响CDSE / ZNS.MSCS差异化容量上的量子点标签或FERIDEX示踪剂[25.，26.]，确实对小鼠MSCs分化没有影响。

已经证明，MSCs可以通过物理接触或分泌可溶性因子来抑制免疫细胞的功能[27.- - - - - -30.]．因此，我们调查了5的标记是否有5个 μ.M DiD可能影响MSCS的免疫抑制能力，以防止脾细胞增殖和细胞因子的产生。本研究结果表明，未标记和did标记的间充质干细胞具有相同的能力产生两种著名的抑制介质(PGE2和IL-10;数字3.）抑制淋巴细胞激活[31.，32.]．按照这些结果，DID标记的MSCs能够以双向MLR降低脾细胞的增殖，如未标记的MSCs（；数字4）.此外，生产炎症（IFN-γ.和IL-17)和抗炎(IL-10)细胞因子在有did标记和未标记MSCs存在的MLR培养上清中显著降低(图)4（d））.可以推测，did标记的和未标记的MSCs都能产生高水平的PGE2(图)3 (b)）可能导致预防淋巴细胞活化和细胞因子表达。在这方面，PGE2对IFN的抑制作用γ.生产 [33.]或通过PGE2生产抑制MSCs的淋巴细胞增殖[34.]先前已经报道。PGE2对IL-10产生的影响是争议[35.- - - - - -38.]．但是，鉴于PGE2涉及在某些条件下抑制IL-10产生的抑制[37.，38.[在我们的结果中，在拟标记的或未标记的MSC存在下，可以根据MSC和脾细胞的共培养的高水平PGE2的存在，解释IL-10在存在下的IL-10的产生。37.，38.]．总的来说，完整和标记的MSCs都同样能够在PGE2的生产中具有同样能干的，并且其他机制最终通过MLR测定中的脾细胞产生细胞因子产生的细胞因子。

本研究表明，与未标记MSCs类似，与未处理对照组相比，did标记MSCs显著提高了EAE的临床评分(和与，resp .;）.另外，与未处理的对照相比，DID标记和未标记的MSCS处理的小鼠表现出IFN的血清水平显着降低γ.（ pg/mL versus pg/mL andpg / mL,分别地;)及IL-17 ( pg/mL versus pg/mL andpg / mL,分别地;)及IL-10水平升高( pg/mL versus pg/mL andpg / mL,分别地;和、职责)。这些结果可以解释为，通过给药did标记或未标记的MSCs，以及细胞因子谱偏离Th2/Treg模式，从而提高了外周耐受性。因此，我们的研究没有显示出显著的差异体内未标记和标记的MSCs在减少疾病症状中的影响。然而，在追踪MSCs的追踪中的特异性需要更详细地研究，因为可以从标记的细胞和供体对染料转移的DII离解[39.] 已经被报告了。

结论

目前研究的结果表明，该研究可能是MSCS标记的合适候选染料体内追踪以来标签并未对两者中的小鼠MSCs的不同生物行为和功能显示任何影响在体外和体内条件。

利益冲突

提交人声明没有关于本文的出版物的利益冲突。

致谢

这项研究在财政医学科学的设拉子大学，设拉子，伊朗（批准号：6152，6022，5147和）的支持。在此，笔者想感谢Samiee博士，Malekmakan先生，塔基女士，哈希米先生和Dehghan女士对他们的技术支持。本文从提取硕士M. S. Mohtasebi的和F.纳斯里的论文的论文为履行硕士度。

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