DNA甲基化参与mir - 142 - 3 - p的表达在成纤维细胞和诱导多能干细胞

文摘

小分子核糖核酸在细胞差异表达和管理多个生物过程。我们一直在全面分析微rna表达模式在人类和小鼠胚胎干细胞和诱导多能干细胞。我们确定小分子核糖核酸特异表达在这些多能干细胞,和mir - 142 - 3 - p是一个这样的小分子核糖核酸。mir - 142 - 3 - p表示在更高水平相对于成纤维细胞在小鼠体内诱导多能干细胞。miR142-3p表达水平下降期间身体形成胚状体诱导多功能干细胞。丧失分析mir - 142 - 3 - p建议mir - 142 - 3 - p扮演的角色在诱导多能干细胞的增殖和分化。CpG图案中发现了5′的基因组区域mir - 142 - 3 - p;他们高度甲基化在成纤维细胞,但未分化的诱导多能干细胞。治疗成纤维细胞5-aza-2′脱氧胞苷增加mir - 142 - 3 - p的表达显著和减少甲基化在中央人民政府网站,表明mir - 142 - 3 - p的表达抑制成纤维细胞的DNA甲基化。荧光素酶分析使用不同长度的5′基因组区域miR142-3p表明论文认定近端增强地区可能扮演的角色在抑制mir - 142 - 3 - p的表达在成纤维细胞。

1。介绍

多能干细胞的自我更新和分化是由各种因素包括生长因子、细胞因子、细胞内信号分子、细胞外基质和转录因子。此外,小分子核糖核酸(microrna)和表观遗传调控的角色如DNA甲基化和组蛋白修饰近年来受到越来越多的关注(1]。复杂的监管网络涉及这些机制已经被广泛的研究在胚胎干细胞(ES)和诱导多能干细胞(iPS)细胞和显示,监管活动,结合转录因子,与多能性(2]。

我们之前评估microrna的表达模式在人类和小鼠ES和iPS细胞(3]。我们发现许多microrna在未分化的“诱导多能性”细胞中表达的高度3]。其中,我们致力于microrna - (miR) 142 - 3 - p在当前的研究中。mir - 142是首次发现在造血细胞4),在分化中扮演不同的角色和功能在造血作用[5- - - - - -7]。mir - 142中是高度保守的脊椎动物(8)和心脏细胞命运的决心都会涉及到9],成骨细胞分化[10),血管发展(11]。在癌症,mir - 142 - 3 - p被确认的断点MYC易位在b细胞白血病(12),在20%的突变弥漫型大b细胞淋巴瘤(13]。这也是极度参与t细胞白血病生成(14和肝癌细胞的迁移15]。

microrna转录的RNA聚合酶II (16),包括各种转录因子。在造血细胞,特别是Spi1、Cebpb Runx1、LMO2都报道调节mir - 142的表达(17,18]。然而,这些转录因子主要是造血特异性,表明mir - 142的表达在未分化的“诱导多能性”细胞涉及监管的其他因素。在这项研究中,我们审查的角色mir - 142 - 3 - p在“诱导多能性”细胞,发现mir - 142 - 3 - p可能参与“诱导多能性”细胞的增殖和维持他们的不成熟。此外,mir - 142 - 3 - p也可能在“诱导多能性”细胞的中胚层分化中扮演角色。我们的数据显示角色CpG甲基化的5′基因组区域的图案mir - 142 - 3 - p在抑制成纤维细胞的表达。荧光素酶分析孤立的基因组区域的mir - 142 - 3 - p支持这个想法,mir - 142 - 3 - p的表达在细胞包括成纤维细胞和iPS是监管,至少部分,通过DNA甲基化。

2。材料和方法

2.1。细胞系,5-Aza-2′脱氧胞苷(5-Aza-dC)治疗,和转染

3 t3细胞在DMEM培养(Nacalai Tesque)补充10%胎牛血清(GIBCO)和0.5%青霉素和链霉素(Nacalai Tesque)。小鼠胚胎成纤维细胞的制备和文化(MEF)和tail-tip成纤维细胞(TTF)是前面描述的(3]。ICR小鼠从当地经销商购买,所有实验动物研究所的动物保健委员会批准东京大学的医学科学。鼠标iPS细胞系、SP-iPS是从B6小鼠MEF感染4因素(Sox2, Oct3/4 Klf4,和原癌基因)通过使用逆转录病毒(19]。文化的“诱导多能性”细胞,形成胚状体的身体(EB)是前面描述的3]。5-aza-dC治疗,细胞治疗最后5或10的浓度μM 5-aza-dC(σ)或二甲亚砜(DMSO)控制镀样品6小时后细胞和细胞培养3天前分析除非另有注明。质粒转染,在24-well镀3 t3细胞培养板转染前1天。荧光素酶质粒是由使用基因的转染汁转染试剂(Novagen)。简而言之,基因汁试剂(1.5μ质粒(0.25 L)μg在0.25μL为每一个质粒),Opti-MEM (Gibco-Life技术)混合,加入3 t3细胞。质粒转染iPS,电穿孔是就业。“诱导多能性”细胞被分离成单个细胞0.05% trypsin-EDTA,用PBS洗净,resuspended Opti-MEM。对于每个转染,细胞/ 30μ我轻轻混合15μ克质粒和放置在2毫米差距电穿孔试管(Nepa基因有限公司)。这些细胞被electroporated两次为175 V, 2女士50毫秒间隔(CUY21编辑Nepa基因有限公司)。后立即电穿孔,1毫升的iPS培养基温柔地添加到试管,馈线上培养的细胞转移和iPS细胞介质。第二天,这些细胞被分离和染色SSEA-1标记。随后,GFP + SSEA-1 +双阳性细胞从研究或对照组按流式细胞仪(MoFlo DakoCytomation)和用于细胞增殖和集落形成试验。

2.2。RNA提取和实时PCR microrna的量化和信使RNA

总RNA提取使用Sepasol (Nacalai Tesque),和水平的成熟MicroRNA检测使用TaqMan微系统(应用生物系统公司)使用底漆为每个成熟的MicroRNA的具体应用生物系统公司提供的使用光周期计1.5(罗氏)。短暂,500 ng RNA与Taqman reverse-transcribed逆转录PCR设备与特定的引物mir - 142 - 3 - p。然后,cDNA混合了TaqMan普遍掌握混合(应用生物系统公司)和受到实时PCR。分析了Ct值与SDS 2.4和RQmanager 1.2.1和量化方法(Livak, 2001)。所有数据规范化内生控制,U6核内小rna。引物的序列是T / brachyury 5′-cacaccactgacgcacacggt-3′, 5′-atgaggaggctttgggccgt-3′, 5′Gata4 -agccggtgggtgatccgaag-3′, 5′-agaaatcgtgcgggagggcg-3′, 5′Fgf5 -gcagtccgagcaaccggaact-3′, 5′-ggacttctgcgaggctgcga-3′。量化的信使RNA, RNA (1μ从每个样本用于生成cDNA g)使用ReverTra Ace存在RT工具包(Toyobo)。然后,cDNA混合Sybr绿色主人混合(罗氏)和受到实时PCR使用光周期计1.5(罗氏)。信使rna的表达水平比较已知GAPDH的标准样品和规范化。

2.3。基因组DNA的亚硫酸氢隔离和治疗

基因组DNA分离~ 5×10⁶使用QIAamp细胞DNA迷你和血液迷你包(试剂盒)。基因组DNA (1μg)受到亚硫酸氢转换使用亚硫酸氢EpiTect(试剂盒)。撤离的进一步转换DNA进行PCR过程与HotStarTaq DNA聚合酶(试剂盒)。区域覆盖到700个基点的上游mir - 142种子序列被放大,被克隆到pGEM-T简单向量(表达载体)。所有阳性克隆序列和甲基化结果被量化分析工具进行甲基化分析(QUMA,http://quma.cdb.riken.jpCpG岛)是用于检测甲基化(20.]。

2.3.1。DNA结构

包含反义序列的质粒成熟mir - 142 - 3 - p或mir - 17表达质粒构建如下:双链DNA编码反义的成熟mir - 142 - 3 - p或者mir - 17,插入U6启动子的下游使用Bam你好,生态国际扶轮网站的pMX逆转录病毒载体包含EGFP 5′LTR后(图1 (b))。表达质粒对鼠标Oct4、Sox2 Klf, Myc从AddGene购买。

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图1

mir - 142 - 3表达水平差- p在成纤维细胞和iPS。(a)表达了mir - 142 - 3 - p RT-qPCR在各种细胞。从表示细胞总RNA提取,并使用TaqMan RT-qPCR是微系统。U6 shRNA被用作控制。实验做了三次使用独立准备细胞,平均值和标准偏差。(b)的示意图表示反义- (-)mir - 142 - 3 - p EGFP表达质粒。LTR是用于驱动EGFP, U6启动子是用于驱动- mir - 142 - 3 - p。(c)过表达的影响- mir - 142 - 3 - p的表达水平内生mir - 142 - 3 - p在“诱导多能性”细胞。- mir - 142 - 3 - p / EGFP转染到ip或控制向量,,24小时后,mir - 142 - 3 - p水平iPS被RT-qPCR检查。数据表示为相对表达水平mir - 142 - 3 - p - mir - 142 - 3 - p / EGFP表达细胞控制向量表达的细胞。 Experiments were performed three times, and average values with standard deviation are shown. (d, e, and f) Effects of expression of as-miR-142-3p for proliferation and alkaline phosphatase (ALP) expression of iPS. as-miR-142-3p/EGFP plasmid was transfected into undifferentiated iPS, and EGFP positive cells were purified by a cell sorter. Then EGFP positive cells were cultured for 2 days for Ki67 immunostaining and for 5 days for ALP assay. Immunostaining with anti-Ki67 antibody or ALP staining was done, and positive cells were counted under a microscope. Experiments were performed three times, and average values with standard deviation are shown. In (f), morphology of representative colonies of as-miR-142-3p or control vector transfected iPS is shown. (g–i) Expression of lineage marker genes in embryoid body (EB). iPS cells were transfected with as-miR-142-3p/EGFP or as-miR-17/EGFP as a control, purified according to their expression of EGFP, and then subjected to an EB formation. After 6 days of culturing in EB formation condition, the differentiation of cells into the ectodermal (g), endodermal (h), and mesodermal (i) lineages was assessed using RT-qPCR with primers againstFgf5,Gata4,T brachyury,分别。值* 0.05 < 0.05和n。>,被学生的计算以及。

2.3.2。细胞排序、细胞碱性磷酸酶染色(高山)和免疫染色

细胞的分类做了使用MoFlo (DakoCytomation)。高山染色完成使用BCIP-NBT解决方案工具包进行碱性磷酸酶染色(Nacalai Tesque)根据制造商的指示。疣是使用抗体anti-Ki67增殖抗原(BD生物科学)和主要抗体是可视化使用适当的二次抗体共轭Alexa 488(分子探针)。

2.3.3。荧光素酶分析

3 t3细胞在24-well培养板镀前1天转染和荧光素酶质粒转染(0.25μg)通过使用基因汁转染试剂(Novagen)。六小时后,转染细胞治疗的最终浓度的10μM 5-azacytidine,培养3天。使用细胞培养细胞收获裂解试剂5 x (Promega)。荧光素酶活性对荧光素酶测定底物(Promega)用光度计测量(Lumat LB9507,贝特技术)。

3所示。结果

3.1。表征mir - 142 - 3 - p在“诱导多能性”细胞表达,拟胚体,成纤维细胞

我们以前描述的microrna的表达模式在老鼠和人类iPS和ES细胞使用microrna的数组,发现mir - 142 - 3 - p,但不是mir - 142 - 5 - p,表达高水平的iPS细胞(请参见图1补充网上http://dx.doi.org/10.1155/2014/101349)[3]。我们首先确认mir - 142 - 3的表达模式- p使用定量逆转录-聚合酶链反应(存在)。mir - 142 - 3 - p表示在未分化的“诱导多能性”细胞的高水平,而成纤维细胞等3 t3,小鼠胚胎成纤维细胞(mef)和tail-tip成纤维细胞(TTF)表示只有非常低的水平(图1(一))。当“诱导多能性”细胞分化形成的拟胚体(EBs), mir - 142 - 3的表达- p降至非常低的水平在2天然后增加第二天(图1(一))。

3.1.1。功能分析mir - 142 - 3 - p在iPS细胞生理学

我们下一个构建表达质粒编码反义mir - 142 - 3 - p (- mir - 142 - 3 - p)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP;图1 (b))。没有插入的质粒的反义mir - 142 - 3 - p被用作控制实验。表达的影响- mir - 142 - 3 - p在内源性mir - 142 - 3 p被检查和证实了在老鼠的iPS细胞(图1 (c))。特别,mir - 142 - 3 p / EGFP转染到未分化的iPS的角色来分析mir - 142 - 3 - p在“诱导多能性”细胞的增殖和维护不成熟。转染24小时后,EGFP-positive细胞纯化使用细胞分选仪和培养3天。细胞增殖是评估Ki67的疣状,增殖标记(图1 (d))。Ki67-positive细胞的人口略,但值得注意的是,低- mir - 142 - 3 - p - iPS细胞(图表达1 (d))。然后我们计算数量的碱性磷酸酶(高山)积极的iPS殖民地,并显著减少ALP-positive细胞内被发现- mir - 142 - 3 - p -表达iPS殖民地(图1 (e))。形态学的殖民地“诱导多能性”细胞之间难以控制和mir - 142(图3 - p表示样本1 (f))。

然后,我们分析了角色的microrna的p - 142 - 3 - iPS细胞分化的能力。“诱导多能性”细胞转染的- mir - 142 - 3 - p / EGFP,根据EGFP的表达纯化,然后被一个EB形成试验。一个包含反义序列的表达质粒对mir - 17,表达无差别的iPS细胞(在非常高的水平3,21),被用作控制。6天后,细胞的分化成外胚层,内胚层、中胚层的血统是评估使用实时定量PCR (qPCR)引物Fgf5,Gata4,T brachyury分别(图1 (g),1 (h),1(我))。数据显示,mir - 142 - 3 p,但不是as-miR-17,压抑的表达T brachyury表示具体的中胚层细胞谱系(22)(图1(我))。- mir - 142 - 3的表达- p没有影响的表达Fgf5或Gata4,尽管as-miR-17增强的表现Fgf5像预期的那样(数据1 (g)和1 (h))。

3.2。5-Aza-2′脱氧胞苷治疗移植mir - 142 - 3 - p在成纤维细胞

评估的转录调节mir - 142 - 3 - p表达式,我们检查它的5′基因组序列和识别25 CpG主题区域覆盖~ 1000碱基对(bp)上游的mir - 142 - 5 - p核心序列(补充图2)。我们假设mir - 142 - 3 - p的表达是由DNA甲基化调控epigenetically iPS细胞和成纤维细胞。mef和3 t3细胞治疗3天5或10μM 5-aza-2′脱氧胞苷(5-aza-dC), DNA甲基转移酶(Dnmt)抑制剂,mir - 142 - 3 - p水平评估使用实时qPCR。mir - 142 - 3 - p的表达被5-aza-dC治疗(数字调节2(一个)和2 (b))。相比之下,mir - 17的水平相当但不显著减少了5-aza-dC(图2 (c)),而表达的mir - 142 - 3 - p和mir - 17被5-aza-dC显著改变在未分化的iPS细胞(数字2 (d)和2 (e))。我们还研究了影响5-aza-dC mir - 142 - 3 - p在EBs,发现10μM 5-aza-dC而抑制表达(图2 (f))。我们还研究了影响5-aza-dC mir - 142 - 3 - p在胸腺细胞表达。mir - 142 - 3 - p水平调节略了10μ5-aza-dC M,但在一个小得多的程度上比成纤维细胞(图中观察到2 (g))。总的来说,这些结果表明,mir - 142 - 3 - p是由DNA甲基化抑制成纤维细胞的差别,但对这些mir - 142 - 3 - p在EB的形成可能是由一个不同的机制。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(一)
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(d)
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图2

5-Aza-2′脱氧胞苷(5-aza-dC)治疗移植mir - 142 - 3 - p在成纤维细胞。(g) 3 t3 (a), MEF (b, c), iPS (d, e),胚状体的身体(EB)由鼠标iPS (f),或鼠标胸腺细胞(g)治疗与5-aza-dC表示最终浓度(5或10μ米)。细胞培养3天在5-aza-dC面前,除了EB, 5-aza-dC处理了两天。控制细胞DMSO溶液处理。然后,细胞被收获,总RNA提取。mir - 142 - 3 - p水平或mir - 17被RT-qPCR检查。U6被用作控制的价值。值表示为相对于控制的每一个细胞类型和样品的平均标准偏差的3或4次实验。价值,∗∗< 0.01、0.01 <∗< 0.05,n。> 0.05,被学生的计算以及。

3.3。近端论文认定mir - 142 - 3 - p基因组区域调节转录活动

我们下一个执行的启动子分析的不同片段5′上游地区mir - 142 - 3 - p使用荧光素酶检测。先前的报道表明,瞬变转染质粒可以CpG-methylated细胞新创(23,24]。荧光素酶转染成3 t3细胞结构,是培养的存在与否5-aza-dC 3天。荧光素酶分析被执行。没有5-aza-dC、274−−540和860−Luc构造显示显著的荧光素酶活性,而逐渐增加,当不再使用启动子(图3(a))。相比之下,1130−Luc荧光素酶活性很低,表明一个区域的存在之间的860年和1130−−核苷酸(nt)抑制荧光素酶的活动。细胞培养在5-aza-dC时,274−Luc的荧光素酶活性调节显著(图3(a))。因为有六个论文认定该地区覆盖274−ATG,我们推测,近六个论文认定的甲基化状态可能在荧光素酶活动的upregulation扮演的角色。

图3

mir - 142 - 3 - p的表达是由DNA甲基化。(一)左面板显示荧光素酶结构的示意图表示。荧光素酶分析使用含有表示长度的片段的质粒的5′上游地区mir - 142 - 3 - p -荧光素酶。质粒转染到3 t3细胞,6小时后,样本处理DMSO溶液或5-aza-dC (10μ米)和培养额外的3天。然后细胞收获,检测荧光素酶的活动。值的平均3次独立实验标准差。价值,∗∗0.05 < 0.01和n。>,被学生的计算以及。(b-g) CpG甲基化的5′上游地区mir - 142 - 3 - p亚硫酸氢转换了。基因组dna提取3 t3, MEF 5-aza-dC的存在与否,iPS,亚硫酸氢或EB准备从iPS受到序列。5-Aza-dC出现在3 t3的培养基或MEF收获细胞基因组DNA提取前72小时(e, f)。(h) 3 t3细胞表达质粒的转染Oct4、Sox2, Klf4或Myc 540−卢克。为控制样本,空质粒表达和−540 Luc被转染。细胞收获3天后文化和荧光素酶进行了分析。(我)3 t3细胞与表示表达质粒,转染,3天后,细胞被收获,总RNA提取。表达水平的内生mir - 142 - 3 - p被RT-qPCR检查。(h i)值是相对于控制向量转染样品和4个独立样本SD的平均水平。

3.4。CpG甲基化的5′基因组区域mir - 142 - 3 - p

进一步阐明CpG网站和DNA甲基化的作用在调节mir - 142 - 3 - p的表达,我们分析了CpG位点的甲基化状态确定在该地区700 bp上游的pre - mir - 142 - 5 - p核心区域(补充图2)使用亚硫酸氢转换。分析在3 t3细胞和mef hypermethylated(数据显示,中央人民政府网站3(b)和3(c))。相比之下,那些在hypomethylated无差别的“诱导多能性”细胞(图3(d))。然后,我们分析了影响5-aza-dC的3 t3细胞和mef甲基化状态。治疗5-aza-dC甲基化水平显著降低,尤其是在近八论文认定(数字3(e)和3(f))。论文认定也在第五天hypomethylated EBs(图3(g)),即使mir - 142 - 3 - p的表达是远低于在未分化的iPS细胞(图1(一))。

3.5。的角色Pluripotency-Related转录因子在mir - 142 - 3 - p基因激活

我们下一个调查的可能参与pluripotency-associated转录因子Oct4、Sox2 Klf4,原癌基因在调节mir - 142 - 3 p转录。mir - 142 - 3 - p promoter-luciferase构造(540−Luc)转染成3 t3细胞的四个转录因子,并进行了荧光素酶化验3天后。荧光素酶活性被Klf4强烈的调节,而其他三个转录因子抑制荧光素酶活性(图3(h))。此外,cotransfection Klf4和Oct4之一,Sox2,原癌基因荧光素酶的活性降低而独自Klf4(图3(h))。然后我们分析的影响overexpressing这些转录因子的表达内源性mir - 142 - 3 - p在3 t3细胞,但不影响观察(图3(我))。

4所示。讨论

这项研究显示,mir - 142 - 3 - p表示在未分化的“诱导多能性”细胞,但不是在成纤维细胞,DNA甲基化可能发挥关键作用在抑制mir - 142 - 3 - p在成纤维细胞表达。先前的研究显示,microrna的转录可能由DNA甲基化(25,26]。mir - 142 - 3 - p被报道是调节人类黑色素瘤细胞系WM1552C 5-aza-dC(治疗后27),这表明mir - 142 - 3 - p的表达减弱了DNA甲基化不仅在成纤维细胞,而且在黑素细胞谱系细胞。在当前的研究中,5-aza-dC没有提高mir - 142 - 3 - p的表达在鼠标P1胸腺细胞,支持DNA甲基化并不是一个主要的假设机制,调节mir - 142 - 3 - p的表达在造血细胞。

mir - 142 - 3 - p的表达在造血细胞是由各种转录因子也扮演了一个重要的角色在造血作用[17,18]。pre - mir - 142的顺序是脊椎动物中高度保守的(8]。此外,人类mir - 142的表达是最近报道由CpG甲基化的增强剂的地区间充质细胞(8]。虽然没有发现相似的老鼠和人类基因上游地区(mir - 142 ~ 2000元)3 - p, mir - 142表达式是由CpG甲基化在这两个物种。

甲基化变化主要发生在重组。基因组区域窝藏pluripotency-associated基因包括Nanog Oct4, Zfp42脱甲基很晚在重编程(28]。当5-aza-dC存在在这一时期,胚胎干细胞的殖民地是观察到的数量增加(29日]。此外,5-aza-dC增强“诱导多能性”细胞的生成通过抑制Dnmt1活动(30.]。mir - 142 - 3 - p的表达可能被压制desilenced其他基因的DNA脱甲基作用和刺激,在后期阶段的重组中发挥的作用。我们发现Klf4调节荧光素酶活性,但Klf4没有增强内生mir - 142 - 3的表达- p在3 t3细胞。因此,我们假设分子环境与重组,可能需要3 t3细胞缺乏,mir - 142 - 3 - p的表达。我们确定了几个潜在的结合位点的原癌基因和基因组地区Sox2 mir - 142 1 kb的成熟的序列使用Genomatix软件套件(http://www.genomatix.de/solutions/genomatix-software-suite.html)。因此,这些转录因子的结合在一个更广泛的基因组区域可能合作的全面归纳mir - 142 - 3 - p的表达。

TGF -R1和TGF -R2都预测目标mir - 142 - 3 - p (31日],TGF -R1被认定为直接目标在非小细胞肺癌32]。TGF -1参与重组过程的抑制TGF -信号增强重组的效率(33]。最近的一份报告表明,mir - 142 - 3 - p -介导的监管Wnt信号可以调节间叶细胞祖细胞的增殖(34]。mir - 142 - 3 p的识别目标基因在TGF -和Wnt信号通路进一步支持了假设mir - 142 - 3 - p是参与“诱导多能性”细胞生理学的规定。

5。结论

mir - 142 - 3 - p,这是“诱导多能性”细胞而不是成纤维细胞中高度表达,扮演角色“诱导多能性”细胞的增殖和分化。mir - 142 - 3 - p的表达是由DNA甲基化抑制的CpG图案5′在成纤维细胞基因组区域。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者承认Keiko Akagawa博士为技术援助和英苏女士曾为启动这个项目。这项工作是由教育部的补助金,文化,体育,科学,和日本的技术。

补充材料

引用

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