人间充质干细胞在无血清培养基中培养后CD105表达降低

摘要

人类间充质干细胞（hMSCs）是一种很有前途的再生医学工具，离体为了获得足够的细胞用于临床治疗，扩张是必要的。传统的培养基通常含有关键成分胎牛血清。对于临床使用，需要化学定义的培养基。在本研究中，我们检测了两种商业化的化学定义的无血清hMSC生长培养基(MSCGM- cd和PowerStem)对hMSC增殖的能力，并与含血清培养基(MSCGM)进行了比较。流式细胞术对hMSCs进行免疫表型分析，并检测其分化为多种细胞类型的能力。虽然不同培养基培养的hMSCs形态不同，但免疫表型表现出相似的标记模式(CD29、CD44、CD73、CD90细胞表面标记高表达，CD45缺失)。有趣的是，与MSCGM相比，MSCGM- cd培养的hMSCs中CD105的表达明显降低。两组均维持间充质多系分化潜能。综上所述，无血清培养基适合培养hMSC，且与含血清培养基相当。由于CD105的表达已被证明对hMSC心脏再生潜能有积极的影响，在MSCGM-CD中扩增后，CD105的表达对临床应用的影响还有待检验。

1.导言

人类骨髓间充质干细胞在当今医学研究中发挥着重要作用，因为它们为人类疾病的治疗提供了新的途径。它们的可塑性和巨大的潜能离体增殖潜能使间充质干细胞成为细胞移植以及生成适合器官修复和替代的活的、功能性组织的重要工具。间充质干细胞已经成功地应用于治疗成骨不全症［1]通过免疫抑制限制移植物抗宿主病[2]．此外，有报道称MSCs参与小鼠心肌梗死后的再生过程[3.]，并能通过免疫调节作用一般改善异基因移植的结果[4]骨髓间充质干细胞最初被描述为塑料粘附、克隆形成、集落形成的成纤维细胞样细胞[5]。到目前为止，虽然MSC由特定属性确定，但还没有普遍接受的定义[6]最重要的是hMSC自我更新的能力，并产生成脂、成骨和成软骨谱系的成熟细胞，产生骨、软骨、肌腱、脂肪组织和造血支持基质等组织[7- - - - - -9]．

细胞表面标志物如CD29、CD44、CD90的表达[9]、CD73和CD105 [10]允许快速鉴定骨髓间充质干细胞。骨髓来源的骨髓间充质干细胞代表非造血干细胞，因此缺乏典型的造血表面抗原，如CD14、CD34和CD45[11]．CD105 (Endoglin)是一种膜糖蛋白，是转化生长因子-的一部分受体复杂。它在血管生成中起着重要作用[12]我们自己以前的研究表明，在小鼠心肌梗死后，高CD105表达的hMSCs移植对于显著改善心肌性能至关重要。

自愿捐献的人骨髓抽吸物中通常含有的hMSCs数量太少，无法用于临床。因此,体外扩增是必要的。为了维持增殖的hMSCs的多能性，需要类似于体内情况的条件。这通常是通过添加牛血清来实现的，牛血清包括细胞增殖所需的生长因子、激素、氨基酸、蛋白质和其他组分离体．研究表明，人血清的效果不如胎牛血清(FBS或FCS)，因此通常采用胎牛血清[13]不幸的是，牛源性血清成分可能引起移植受体的免疫反应[14].供临床使用，离体扩展的hMSCs仍然代表着危险的健康风险，因为它们保留了fcs衍生的成分。其他报道称，在自体血清中扩增hMSC与在培养物中补充胎牛血清同样有效[15].然而，自体外周血提供的体积太小，不具有实际意义[16]。也曾尝试使用混合同种异体血清，但已证明会导致细胞停滞甚至细胞死亡，因此也不适合用于治疗[17]．

为了提供无血清培养条件，Müller和同事成功地用人血小板裂解液和新鲜冷冻血浆替代了FCS [18]．然而，一些缺点仍然存在，如使用的血浆/血清的成分不明确和不稳定，使培养基的可复制配方的供应复杂化。另一个风险是血清可能被细菌、病毒或支原体污染[19]最后，血清的有限可用性和成本不容忽视。适当的化学定义的生长培养基消除了添加血清的必要性，将解决目前hMSCs临床应用有限的问题。

一种商业无血清培养基（UC补充ULTROSER）已被证明比含有动物血清的培养基能实现更好的细胞扩增[20.]然而，广泛测试每种无血清培养基对扩增hMSCs的能力和临床相关性非常重要。最近，几种新的商用hMSC特异性无血清生长培养基已进入市场成熟期。我们测试了两种商用生长培养基（MSCGM-CD和PowerStem）与传统含血清培养基相比促进hMSC增殖的能力。

我们研究的目的是分析（i）无血清培养的hMSCs是否表达典型的表面标记物和（ii）如果它们保持hMSC可塑性，则通过其分化为成脂肪、成骨和成软骨祖细胞的能力进行评估。这与在常规含血清生长培养基中培养的hMSC进行比较。一种无血清培养条件（MSCGM-CD）提供了可靠的扩增支持，因此与在MSCGM中生长的细胞相比，进一步研究了表面标记物的表达和分化潜能。

2.材料和方法

2.1.病人样本

在所有的实验中，自愿捐献者的胸骨骨髓抽吸液是在征得其同意后，根据罗斯托克大学当地伦理委员会的伦理批准，并按照《赫尔辛基宣言》的伦理标准进行的。64例(12） 岁，接受了心脏直视手术。其中7名为男性，3名为女性（见在线补充资料中的图S1）http://dx.doi.org/10.1155/2013/698076)。因此，没有患者滥用酒精或吸烟。然而，十名患者中有四名过去曾吸烟（图S1和S2）。患者的平均BMI为27.795.15 （kg/m²）这就是为什么它们平均被视为预贝斯。

2.2.细胞培养

患者的人类骨髓样本分为7个部分 随后将其接种到无血清MSGCM-CD（德国科隆Lonza Group AG）、PowerStem（德国艾登巴赫PAN Biotech GmbH）或含血清培养基MSCGM（Lonza Group AG）中，肝素化（250–500 将人骨髓抽吸物转移到细胞培养瓶中（75） cm²，Greiner Bio One GmbH，Frickenhausen，德国）。烧瓶储存在37°C和5% 一氧化碳₂．每2-3天进行常规培养基改变。

2.3.细胞传代

骨髓播种后，需要10-16天的原代培养(代0)，直到hMSC菌落达到融合。此时，执行了分裂。因此，每cm²将5000-7000个细胞播种到新的培养瓶中作为第1代。在达到一致性后，这一过程一直重复到第3段。从第1至第3代，分裂期为3至9天。因此，在不同介质中翻倍的平均时间为2.60 ~ 4.00天(见节)3.）.

具体而言，拆分程序如下：用预热PBS（PAN Biotech GmbH）清洗层，并通过添加胰蛋白酶（2.5）传代 毫克/毫升，1 每25毫升 细胞培养表面的cm²，PAA Laboratories GmbH，Cölbe，德国）分离细胞。添加先前移除的培养基作为胰蛋白酶抑制。由于单独使用无血清MSCGM-CD和PowerStem似乎不足以抑制胰蛋白酶，1.5 毫升 向在此培养基中培养的细胞中添加HSA（人白蛋白20%，低盐；CSL Behring GmbH，Hattersheim Main，德国）。整个悬浮液离心（300分钟） ×克，20摄氏度，10摄氏度 分钟）。丢弃上清液，剩余的细胞颗粒在0.5–2分钟内再悬浮 用于细胞计数的适当培养基mL。第三代传代后，对人骨髓间充质干细胞进行分化实验和荧光活化细胞分选（FACS）分析。

2.4.分化试验

为了检测培养的骨髓间充质干细胞的多系分化潜能，根据制造商的协议，使用“人间充质干细胞功能鉴定试剂盒”(R&D Systems，威斯巴登-诺登施塔特，德国)将其分化为成脂、成骨和成软骨谱系。24孔板(Greiner Bio-One)将人间充质干细胞分别接种在盖片(Menzel GmbH, Braunschweig, Germany)上，用于成脂(每孔37000个细胞)和成骨(每孔7400个细胞)分化，细胞球(每孔250000个细胞)用于成软骨分化。当成脂细胞100%融合，成骨细胞50%-70%融合时，用合适的分化培养基诱导，每3-4天更换一次(R&D Systems)。软骨形成细胞直接播种在软骨分化培养基中，培养基每2-3天变化一次(R&D Systems)。21天后，所有细胞在2%多聚甲醛溶液中固定(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Germany)，软骨源性小球被嵌入Tissue-Tek安装介质(Sakura Finetek Europe B.V.， alphan aan den Rijn, Netherlands)并冷冻切片成5我是厚片。

2．5．采用免疫染色

分化后的hMSCs进行免疫细胞化学染色，以分析其与成脂、成骨或软骨谱系的关系。根据“人间充质干细胞功能鉴定试剂盒”(R&D Systems)的制造商协议进行染色。用0.5 mL含0.3% Triton X-100 (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany)的1x PBS渗透细胞，用1% HSA和10%马血清(PAA Laboratories GmbH)在1x PBS中室温阻断45分钟。细胞与适当的一抗(1:35 0在1% HSA, 10%马血清)在4°C下孵育过夜，或无一抗作为阴性对照。一抗(R&D Systems)针对FABP-4的成脂作用，针对骨钙素的成骨作用，以及针对聚集蛋白的软骨分化作用。用1ml PBS (1% HSA)冲洗细胞，用250孵育染色L适当的1 : 300稀释二级抗体（AlexaFluor488抗小鼠，Invitrogen，美国卡尔斯巴德生命技术公司）60分钟 随后洗涤后，用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，Invitrogen）染色细胞核（250 L (0.3)M DAPI溶液10分钟 然后，用含有1%HAS和蒸馏水的1x PBS清洗细胞。最后，使用预热（60°C）的Dako甘油凝胶安装介质（德国汉堡Dako GmbH）将细胞或冰冻切片安装在玻片上。

2.6.荧光显微镜分析

hmsc分化、染色后荧光显微镜成像。为了确定细胞对给定刺激的反应率，在10个包含至少100个细胞的高倍电场中计数细胞，并将分化标记阳性的细胞数量与细胞核数量(代表细胞总数)进行比较。使用共聚焦激光扫描显微镜(ELYRA, Carl Zeiss AG, Jena, Germany)在100倍和400倍放大率下获得免疫细胞化学染色分化的hMSCs的高分辨率图像。

2.7.荧光激活细胞分选（FACS）

在整个染色过程中，将细胞、抗体和所有试剂冷藏。生物素化抗体由4L抗CD90-生物素和40 L的生物素同型对照(表1), 1分别为L-链霉亲和素-V450（BD Biosciences）。混合物在4℃下培养30分钟 所需抗体的最小值（表1）1)和20 在含0.5% BSA和2 mM EDTA的1x PBS中，将L FcR-block (BD Biosciences)加入100,000个细胞中。最终达到100卷加入1x PBS (0.5% BSA)和2 mM EDTA。未染色对照，单抗体染色，每个抗体的同型对照染色，以及八色抗体染色。孵育30分钟后，用1ml PBS洗涤染色细胞并向下延伸(300 ×g, 4°C, 5分钟)。细胞颗粒于150重悬l1X PBS并转移至FACS管（BD Biosciences）进行测量。使用FACSDiva软件（BD Biosciences）进行数据分析。

2.8.统计分析

对于统计分析，非配对双尾学生的使用GraphPad Prism 5.0软件进行测试。如果的价值以及≤0.05。

3.结果与讨论

3.1.人骨髓间充质干细胞在无血清和含血清的生长培养基中易于扩增

在无血清生长培养基（MSCGM-CD或PowerStem）或含血清培养基（MSCGM）中培养的hMSCs显示出成纤维细胞样细胞的同质群体，尽管细胞形状和大小与培养基不同。在PowerStem中培养的P0中的亚流动细胞被拉长并单独生长，而不是紧密地在一起（图1）1).在P0中，MSCGM培养的细胞更大，分布更广，单个细胞之间的空间更大。相比之下，在MSCGM-CD中生长的细胞较小，表现出紧密的生长行为，建立了密度更高的细胞区，其间有空白区域。也可以区分菌落生长。尽管在与对照组相比，在MSCGM-CD中培养的细胞形成了更大的菌落，并且通常菌落数更高（图2)比在MSCGM或PowerStem中培养的细胞要多。P0的hMSC菌落达到一致性的平均时间为11.5 d0.96 D MSCGM的扫描电镜，11.3 D1.97 D MSCGM-CD的SEM和11.8 D2.23 d PowerStem扫描电镜(所有）.P1后细胞倍增时间为2.60 d±0.19 d SEM MSCGM为2.39 d0.19 D MSCGM-CD的SEM和4.00 D2.43 d扫描电镜PowerStem(所有).由于在MSCGM-CD中培养的细胞和MSCGM提供了最高的集落数和最可靠的生长，因此进一步分析了在这些培养基中培养的细胞的表面标记物表达和分化潜能。

3.2. 与无血清培养细胞相比，在含血清培养基中培养的人骨髓间充质干细胞表达CD105明显增多

对于MSCGM-CD和MSCGM生长培养基以及每个供体，hMSCs的平均生存率始终高于90.1%5.8% MSCGM和MSCGM-CD细胞表面标记蛋白CD29、CD44、CD45、CD73和CD90的表达相似（图3.）.几乎所有被分析的细胞都表达CD29、CD44和CD73，表明几乎所有的细胞都表达各自的细胞表面标记蛋白(见表)2和图3.）.此外，干细胞标记物CD90含量较少(87.04%)4.39% 扫描电镜，MSCGM-CD为87.14%4.55% 扫描电镜，对于MSCGM），CD45完全缺失（表2和图3.)有趣的是，与MSCGM-CD培养的细胞（51.70%）相比，经无血清处理的HMSC中仅有一半存在内皮素（CD105）14.53%的扫描电镜,在MSCGM-CD和95.83%2.35% MSCGM培养细胞的扫描电镜观察，，）.

MSCGM和MSCGM- cd在初始菌落形成、倍增时间、融合性和传代等方面的生长条件具有可比性。此外，在这些培养基中同时检测每个患者的骨髓。患者队列在年龄、BMI和心脏状况方面是同质的。同样，也没有人滥用烟酒。然而，我们不能排除以前的烟草消费对研究结果的影响(补充数据图S2)。尽管如此,图2显示菌落生长在很大程度上依赖于不同的培养基，而每个培养基中的菌落生长在患者之间高度一致。

3.3.在两种培养基中培养的人MSC分化为所有三种间充质细胞系

文献资料表明离体培养的人骨髓间充质干细胞能够分化成三种不同的间充质细胞系（成脂肪、成骨和成软骨）[9]．为了验证这是否受无血清条件的影响，我们在分化生长培养基中培养hMSCs并刺激其进入这些谱系。

人骨髓间充质干细胞在脂肪细胞系中分化，与生长介质中是否存在血清无关（13.51%2.89% 扫描电镜，MSCGM-CD细胞的比例为18.37%5.10 扫描电镜，对于MSCGM；数字4（a），4 (c),5）.

研究hMSC向成骨线的分化表明骨钙素的总体表达（图4 (d)和4 (f)）.如果可以区分单个细胞，抗骨钙素绿色荧光似乎覆盖整个细胞体。这说明骨钙素至少部分积聚在细胞质中或覆盖在质膜上。此外，检测到几个更亮的荧光点，表示骨钙素的积累(图)4 (d)和4 (f)因此，未发现MSCGM和MSCGM CD培养细胞之间的分化改变，因为在两组中，所有细胞均符合成骨表型（100%）0% 扫描电镜，；数字5）.

为了检查软骨分化，分析hMSCs的聚集蛋白表达。所有细胞凝集蛋白染色阳性(图4 (g)和4(我)).由于该染色，分化诱导的hMSCs均被确定为软骨细胞（100%0% 扫描电镜，MSCGM和MSCGM- cd培养细胞;数字5)这些结果可能对在无血清培养基中扩增的hMSCs的临床应用具有重要意义。

为了验证培养的骨髓细胞为hMSCs，我们检测了特定细胞表面标记蛋白的表达。不论培养基如何，细胞均如预期的CD29、CD44、CD73阳性，主要是CD90阳性。这些细胞不表达造血标记物CD45(图3.).仅对于CD105表面标记，两组之间存在显著差异。在MSCGM-CD培养条件下，大约一半的细胞（51.70%）为CD105阳性，而几乎所有经MSCGM（95.82%）处理的细胞均为阳性。CD105表达的这种差异可能是由生长培养基的组成引起的。它可能含有诱导CD105表达的因子。转化生长因子-已经证明在低氧条件下上调CD105转录[21]然而，由于对精确培养基组成的了解是不可靠的，因此这种影响有待于假设，需要进一步研究。先前的数据表明CD105在血管生成中起着重要作用[12]．我们自己的分析表明，在心肌梗死小鼠模型中，hMSCs的CD105表达对再生潜能有显著影响[22]我们假设这种改善可能是由CD105在缺氧条件下诱导增殖或细胞保护引起的⁺肽(22]．此外，小鼠心肌缺血模型显示，与未纯化的hMSCs相比，经CD105筛选的hMSCs移植6周后心脏性能增强[22]．综上所述，这表明无血清培养的hMSCs可能导致治疗结果受损。在活的有机体内必须进行研究，比较在无血清和含血清培养基中扩增的hMSCs，以表明这些细胞是否同样适合心脏再生。

为了检测hMSCs在无血清培养过程中是否保持其可塑性，分别刺激它们沿成脂肪、成骨和成软骨谱系分化。成脂分化发生的频率通常较低（约15%的细胞显示成脂分化），而成骨和成软骨分化的标记物出现在所有细胞中。这可能是因为骨髓培养物中已经存在了承诺的间充质祖细胞[23]正如Muraglia及其同事已经证明的那样，大约三分之一的人骨髓间充质干细胞具有沿着成脂谱系分化的潜能，而大多数细胞具有成骨软骨的潜能[23]．这与我们的发现相符(图5）.

脂肪细胞分化率低于30%，这可能取决于骨髓抽吸物本身。在我们的研究中，骨髓捐赠者比Muraglia的研究中的年龄大（我们研究中的平均年龄：73.6岁，而Muraglia的捐赠者的年龄范围在5个月到30岁之间）[23]因此，在我们的研究中，骨髓细胞可能已经开始衰老，导致可塑性降低。此外，Muraglia使用来自髂骨嵴的骨髓，而我们使用来自胸骨的骨髓，目前尚不清楚这是否对分化潜能有额外影响[23]此外，Levi等人证明，脂肪组织来源的hMSCs富含CD105的表达^高与CD105相比，其成骨潜能降低^低的［24]这可能是脂肪来源的人骨髓间充质干细胞的特征，从我们对骨髓来源的人骨髓间充质干细胞的研究结果中可以明显看出：在骨髓来源的人骨髓间充质干细胞中，我们没有观察到CD105表达与成骨潜能之间的相关性．在P1中使用hMSCs并诱导成骨7天，而在P3中使用hMSCs并诱导成骨21天。因此，这可能是一个时间依赖效应。先前使用与我们相似的协议的研究确实表明，大多数脂肪组织、骨髓和脐血来源的hMSCs具有共同的特征[25并且能够沿着成骨谱系进行分化[26]．

用于成脂和成骨分化的培养基含有10%的FBS。在进行此项研究时，无血清分化培养基尚未上市。之前，无血清培养的细胞已用血清处理以诱导分化。但是，无血清条件下的预培养并不意味着对这些谱系的分化能力有显著影响。虽然没有统计学意义，但脂肪分化细胞在个体供体中的分化倾向于减少。因此，MSCGM-CD培养的细胞可能在一定程度上失去了脂肪分化潜能。这方面将在更多方面进行研究细节有待进一步研究。

根据诱导谱系观察所有细胞的成骨和成软骨标记物表达情况。虽然骨钙素和骨凝集素是细胞外基质的蛋白质，但它们也存在于细胞内，可能是由于在分泌之前积累。在这两个谱系中，细胞生长在不止一层。因此，可能不是每一个细胞都能分化，但细胞外间隙骨钙素和骨凝集素的存在使未分化细胞无法识别。然而，据报道，大多数hMSCs具有分化为成骨和软骨谱系的能力[23]最后，MSCGM和MSCGM CD培养的细胞显示出相当水平的成骨和成软骨标记物表达。

4.结论

本研究的目的是在考虑细胞生长、传代和融合性的可比条件下，分析化学定义的无血清培养基与常规含血清培养基培养的hMSCs的增殖和分化情况。我们可以证明无血清培养的hMSCs (i)表达典型的hMSC表面标记蛋白，(ii)保持多系潜力。然而，无血清扩增的hMSCs (iii)与有血清培养的细胞相比，CD105蛋白含量显著降低(51.70%)扫描电镜的14.53%。在MSCGM-CD和95.83%2.35% MSCGM培养细胞的扫描电镜观察，，）.

由于其可塑性，hMSCs在再生医学中提供了多种治疗方法，如治疗遗传性骨病或心肌梗死后心脏重塑。此外，未来很有可能会出现进一步的应用领域，培养和扩展hmsc的必要性离体将会增加。由于含血清培养基在临床上是不安全的，其配方也不稳定，因此需要完全化学定义的培养基。到目前为止，尚无关于无血清hMSC培养的详细研究。我们的研究结果表明，无血清培养的hMSCs与常规培养基培养的细胞具有同等的局限性。我们的分析结果有助于将无血清hMSC培养条件引入临床前研究和未来的治疗应用。

利益冲突

作者确认不存在利益冲突。

作者的贡献

Peter Mark和Mandy Kleinsorge对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

作者亲切地感谢Margit Fritsche女士出色的技术支持和组织帮助，以及Frauke博士Stähler对论文的批判性阅读。本研究得到了德国教育与研究部(0312138A)、梅克伦堡-西Pommerania联邦经济部(V630-F-075-2010/183, V630-075-2010/185)和心脏干细胞治疗参考与翻译中心的资助。资助方在研究设计、数据收集和分析、决定发表或论文准备方面没有作用。

补充材料

工具书类

1. E.M.Horwitz，P.L.Gordon，W.K.Koo等人，“分离的异基因骨髓间充质细胞移植并刺激成骨不全儿童的生长：对骨细胞治疗的影响，”美国国家科学院学报，第99卷，第5期。13，第8932-8937页，2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. B. Maitra, E. Szekely, K. Gjini等人，“人间充质干细胞支持非亲缘供体造血干细胞并抑制t细胞激活，”骨髓移植，第33卷，第6期，第597-6042004页。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. H.Kawada，J.Fujita，K.Kinjo等，“非造血间充质干细胞可在心肌梗死后动员并分化为心肌细胞。”血，第104卷，第104号12，页3581 - 3587,2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. C. Nesselmann, A. Kaminski，和G. Steinhoff，心脏干细胞疗法。在扩张型心肌病患者中进行的注册试验和初步研究。”赫兹，第36卷，第2期，第121-134页，2011年。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. A. J. Friedenstein, R. K. Chailakhyan，和U. V. Gerasimov，“骨髓成骨干细胞:扩散室的体外培养和移植”，细胞和组织动力学，第20卷，第3期，第263-2721987页。视图:谷歌学者
6. M. Dominici，K. Le Blanc，I. Mueller等人，“定义多能间充质基质细胞的最低标准。国际细胞治疗学会立场声明，”细胞疗法，第8卷，第2期4, pp. 315 - 317,2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. R. M. Lemoli, F. Bertolini, R. Cancedda等，“干细胞可塑性:重新评估的时间?”血液学，第90卷，第5期。3，页360-381,2005。视图:谷歌学者
8. J. J. Minguell, A. Erices, P. Conget，《间充质干细胞》，实验生物学与医学第226卷第226期6，页507-520,2001。视图:谷歌学者
9. M.F.Pittenger，A.M.Mackay，S.C.Beck等人，“成人间充质干细胞的多系潜能，”科学，第284卷，第5411号，第143-147页，1999年。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. S.E.Haynesworth，J.Goshima，V.M.Goldberg和A.I.Caplan，“具有人骨髓成骨潜能的细胞特征，”骨头，第13卷，第2期1，页81-88,1992。视图:谷歌学者
11. P. A. Conget和J. J. Minguell，“人骨髓间充质祖细胞的表型和功能特性”，细胞生理学杂志，第181卷，第1期，第67-73页，1999年。视图:谷歌学者
12. S. E. Duff, C. Li, J. M. Garland，和S. Kumar，“CD105对血管生成很重要:证据和潜在的应用，”实验生物学联合会会刊，第十七卷，第二期9，第984-992页，2003。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. S.A.Kuznetsov，M.H.Mankani和P.G.Robey，“血清对人骨髓基质细胞的影响：体外扩增和体内骨形成，”移植，第70卷，第12期，第1780-1787页，2000年。视图:谷歌学者
14. J.L.Spees，C.A.Gregory，H.Singh等人，“为了制备用于细胞和基因治疗的低免疫原性间充质干细胞，必须去除内化抗原。”分子治疗，第9卷，第5期，第747-756页，2004年。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. N.Stute、K.Holtz、M.Bubenheim、C.Lange、F.Blake和A.R.Zander，“用于分离和扩增临床使用的人间充质干细胞的自体血清，”实验血液学，第32卷，第2期12，页1212-1225,2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. P. A. Sotiropoulou, S. A. Perez, M. Salagianni, C. N. Baxevanis, M. Papamichail，“临床大规模生产人间充质干细胞的最佳培养条件的特性”，干细胞，第24卷，第2期，第462-4712006页。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. a . Shahdadfar, K. Frønsdal, T. Haug, F. P. Reinholt，和J. E. Brinchmann，“人间充质干细胞的体外扩增:血清的选择是细胞增殖、分化、基因表达和转录组稳定性的决定因素。”干细胞，第23卷，第9期，第1357-1366页，2005年。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. I. Müller, S. Kordowich, C. Holzwarth等人，“从人骨髓基质中分离和扩增多能间充质基质细胞的动物无血清培养条件，”细胞疗法，第8卷，第5期，第437-444页，2006年。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. H. G.德雷克斯勒和C. C.厄普霍夫，《细胞培养支原体污染的发生率、来源、影响、检测、消除和预防》，Cytotechnology，第39卷，第2期，第75-902002页。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. N.Meuleman，T.Tondreau，A.Delforge等，“人骨髓间充质干细胞培养：无血清培养基比传统培养基允许更好的扩增αmem培养基”,欧洲血液病学杂志，第76卷，第76期4，页309 - 316,2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. T.Sánchez Elsner、L.M.Botella、B.Velasco、C.Langa和C.Bernabéu，“内皮胶蛋白的表达受缺氧和转化生长因子之间转录合作的调节-β途径，”生物化学杂志，第277卷，第46号，第43799-43808页，2002年。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. R.Gaebel，D.Furlani，H.Sorg等人，“人类间充质干细胞的细胞起源决定了心脏再生中不同的愈合性能。”《公共科学图书馆•综合》，第6卷，第2期2、文章编号e15652, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. a . Muraglia, R. Cancedda和R. Quarto，“克隆间充质祖细胞在体外根据分级模型分化”，细胞科学杂志，第113卷，第7期，第1161-1166页，2000年。视图:谷歌学者
24. B. Levi, D. C. Wan, J. P. Glotzbach等人，“CD105蛋白耗尽通过减少转化生长因子促进人类脂肪来源的基质细胞成骨β1（转化生长因子-β1)信号。”生物化学杂志，第286卷，第45号，第39497-395092011页。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. W. Wagner, F. Wein, A. Seckinger等人，“来自人类骨髓、脂肪组织和脐带血的间充质干细胞的比较特征”，实验血液学，第33卷，第11期，第1402-1416页，2005年。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. S. Kern, H. Eichler, J. Stoeve, H. Klüter，和K. Bieback，“骨髓、脐带血或脂肪组织间充质干细胞的比较分析，”干细胞，第24卷，第5期，第1294-13012006页。视图:出版商的网站|谷歌学者

版权

版权所有©2013 Peter Mark等人。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，前提是原作被正确引用。