在所有的实验中,胸骨骨髓送气的自愿献血者使用后获得了同意根据伦理当地伦理委员会批准,罗斯托克大学和已经完成按照道德标准的《赫尔辛基宣言》。患者64年( ± 12)岁,接受了心脏手术。七人男性,三是女性(参见图S1在网上补充材料 http://dx.doi.org/10.1155/2013/698076)。因此,没有一个病人滥用酒精或烟草消费。然而,四个的十个病人过去消费烟草(S1和S2的数据)。病人的平均身体质量指数为27.79 ± 5.15(公斤/ m²)这就是为什么他们在平均视为preobese。

人类骨髓样本的患者被分成部分7毫升,随后被播种到血清MSGCM-CD (Lonza集团、德国科隆)PowerStem(锅生物技术GmbH, Aidenbach,德国),或血清培养基MSCGM (Lonza集团)。肝素化(250 - 500年。美国)人类骨髓抽出物转移到细胞培养瓶(75厘米²,他一一Bio-One GmbH Frickenhausen,德国)。烧瓶是储存在37°C和5%的公司₂。常规介质变化进行每2 - 3天。

骨髓播种后,10到16天的主要文化(=通道0)被要求直到达到confluency hMSC殖民地。在这个时间点,分裂了。因此,5000 - 7000细胞每厘米²被播种到新的培养瓶,通道1所示。达到confluency后,这个过程反复进行通道3。从通道1到3,分裂时期三到九天。因此,平均倍增时间在不同的媒体范围从2.60到4.00天(见部分 3)。

详细分解过程如下:层与prewarmed洗PBS (PAN生物技术GmbH)和通道的胰蛋白酶(2.5毫克/毫升,1毫升/ 25厘米²的细胞培养表面,PAA实验室GmbH, Colbe,德国)分离的细胞。之前删除中新增了胰蛋白酶抑制。无血清MSCGM-CD和胰蛋白酶抑制PowerStem单独似乎并不充分,1.5毫升HSA(白蛋白20%,低盐;CSL贝林GmbH, Hattersheim主要、德国)添加到细胞培养介质。整个悬架是离心机(300×g, 20°C, 10分钟)。上层清液被丢弃,剩下的细胞颗粒在0.5 - 2毫升resuspended适合细胞计数的培养基。人类msc在分化进行分析化验和fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)第三段。

检查multilineage hMSCs培养的潜力,他们分化成脂肪形成的,成骨,chondrogenic血统使用“人类间充质干细胞功能识别工具包”(研发系统、Wiesbaden-Nordenstadt德国)根据制造商的协议。人类msc被播种在封面的过失(门泽尔GmbH,布伦瑞克,德国)24-well板块(他一一Bio-One)脂肪形成的(每)37000细胞和成骨的(7400个细胞)分化,分别,而细胞颗粒(250000细胞/粒)是用于chondrogenic分化。当细胞脂肪形成汇合的100%和骨生成细胞汇合的50% - -70%,他们用适当的诱导分化培养基,改变每3 - 4天(研发系统)。细胞软骨形成直接被播种chondrogenic分化介质与介质变化每2 - 3天(研发系统)。21天之后,所有的细胞都在2%多聚甲醛溶液固定(Sigma-Aldrich化学GmbH,慕尼黑,德国),和chondrogenic颗粒嵌入Tissue-Tek安装介质(樱花Finetek欧洲帐面价值位于莱茵河畔,荷兰)和cryosectioned到5 μ 米厚片。

分化hMSCs染色是采用以分析其对脂肪形成的的承诺,成骨的或chondrogenic血统。染色是根据制造商的协议执行的“人类间充质干细胞功能识别工具包”(研发系统)。细胞permeabilized 0.5毫升1 x PBS含有0.3% Triton x - 100(卡尔罗斯GmbH +有限公司KG,卡尔斯鲁厄,德国),阻止了45分钟与HSA 1%和10%马血清(PAA实验室GmbH)在室温下1 x PBS。细胞被孵化与适当的初级抗体(1:350年1%的储蓄帐户,10%马血清)一夜之间在4°C,或没有主要抗体作为消极的控制。主要抗体(研发系统)是针对FABP-4脂肪形成的,为成骨的骨钙素,对aggrecan chondrogenic分化。细胞被洗1 x mL PBS (1% HSA)和孵化与250染色 μ L足够的1:300稀释二次抗体(AlexaFluor488反鼠标,表达载体,生命技术公司,卡尔斯巴德,美国)在黑暗中在室温下60分钟。后续的清洗后,4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI英杰公司)是用于染色细胞核(250 μ L的0.3 μ M DAPI 10分钟)的解决方案。之后,细胞被洗1 x PBS包含1%和蒸馏水。最后,细胞或cryosections被安装在玻璃幻灯片使用prewarmed (60°C) Dako glycergel安装介质(Dako GmbH,汉堡,德国)。

荧光显微镜的图像hMSCs被分化后化验和染色。确定细胞响应的速度给定的刺激,细胞数在10高功率字段包含至少100个细胞,细胞染色阳性的数量分化标记与核的数量(代表总数量的细胞)。共焦激光扫描显微镜(ELYRA、卡尔蔡司AG)、耶拿德国)被用来获得高分辨率的图像采用彩色分化hMSCs放大100倍和400倍。

在整个染色过程中细胞、抗体和所有试剂都保存在冰。生物素化的抗体是由混合4 μ L anti-CD90-biotin和40 μ L biotin-isotype控制(表 1),1 μ 分别L streptavidin-V450 (BD生物科学)。混合物在4°C孵化了30分钟。所需的抗体(表 1)和20 μ L FcR-block (BD生物科学)被添加到100000个细胞1 x PBS 0.5% EDTA BSA和2毫米。达到最终成交量为100 μ L 1 x PBS 0.5% BSA和2毫米EDTA是补充道。一个清白的控制、单抗体染色,同形像控制每个抗体染色,和一个eight-color抗体染色了。孵化后30分钟,染色细胞被洗1毫升PBS和张成(300×g 4°C, 5分钟)。细胞颗粒resuspended于150年 μ L 1 x PBS和转移到流式细胞仪测量管(BD生物科学)。数据分析使用FACSDiva软件(BD生物科学)。

统计分析,未配对的双尾的学生 t 以及使用软件GraphPad Prism 5.0执行。差异显著的如果 P 的价值 t 以及≤0.05。

无血清培养基上培养hMSCs (MSCGM-CD或PowerStem)或血清培养基(MSCGM)显示人口同质的纤维母细胞,但细胞形状和大小不同的培养基。P0 Subconfluent细胞培养在PowerStem细长并分别增长而不是紧密在一起(图 1)。MSCGM-cultured细胞出现更大、更多的传播,P0单个细胞之间更多的空间。相比之下,细胞生长在MSCGM-CD很小,证明了紧增长行为与空之间的地区建立细胞密集的领域。殖民地经济增长也可以区分。尽管组之间差异不显著,细胞培养MSCGM-CD发达一般大的殖民地和更高的殖民地数量(图 2比细胞生长在MSCGM或PowerStem)。hMSC殖民地的平均时间达到confluency P0 11.5 d ± 0.96 d MSCGM SEM, 11.3 d ± 1.97 d MSCGM-CD SEM,和11.8 d ± 2.23 d SEM PowerStem(所有 n = 6 )。细胞的倍增时间后P1为2.60±0.19 d MSCGM SEM, 2.39 d ± 0.19 d MSCGM-CD SEM,和4.00 d ± 2.43 d SEM PowerStem(所有 n = 4 )。MSCGM-CD自细胞培养,MSCGM菌落数最高和最可靠的增长,提供细胞生长在这些媒体进一步分析表面标记表达式和分化潜能。

MSCGM-CD和MSCGM增长媒体和每一个捐赠者,hMSCs总是高于90.1%的平均生存能力 ± 扫描电镜的5.8%。细胞表面标记蛋白的表达CD29、CD44、CD45、CD73, CD90 MSCGM和MSCGM-CD细胞(图之间的相似 3)。几乎所有分析细胞阳性CD29、CD44、和CD73,表明几乎所有细胞表达相应的细胞表面标记蛋白质(表 2和图 3)。此外,干细胞标记CD90不丰富(87.04% ± 4.39%的扫描电镜, n = 5 MSCGM-CD和87.14% ± 4.55%的扫描电镜, n = 5 MSCGM),而CD45完全缺席(表 2和图 3)。有趣的是,endoglin (CD105)存在于相比只有一半的血清治疗hMSCs MSCGM-CD-cultured细胞(51.70% ± 14.53%的扫描电镜, n = 5 在MSCGM-CD和95.83% ± 2.35%的SEM MSCGM-cultured细胞, n = 5 , P ≤ 0.05 )。

生长条件的hMSCs关于初始群体形成,倍增时间,confluency,通过可比MSCGM和MSCGM-CD之间。此外,每个病人的骨髓测试在这些媒体并行。病人军团是同质的年龄、BMI和心脏状况。同样,没有滥用酒精或烟草。然而,我们不能排除影响结果由前烟草消费(补充数据图S2)。尽管如此,图 2表明,殖民地经济增长在很大程度上是依赖于不同的媒体,而菌落生长在每个媒介之间高度一致的病人。

文献资料表明, 体外培养hMSCs能够区分在三个不同的间叶细胞谱系(成骨的脂肪形成的,和chondrogenic) ( 9]。检查是否这是影响无血清条件下,hMSCs分化培养基上培养,刺激提交到这些血统。

人类msc分化的脂肪细胞谱系无论在生长培养基(13.51%血清的存在 ± 2.89%的扫描电镜, n = 5 MSCGM-CD细胞比例为18.37% ± 5.10扫描电镜, n = 5 MSCGM;数据 4(一), 4 (c), 5)。

调查hMSC分化成成骨的行数建议整体骨钙素的表达(数字 4 (d)和 4 (f))。如果可以区分出单个细胞,antiosteocalcin绿色荧光似乎覆盖整个细胞体。这表明骨钙素至少部分在细胞质中积累或覆盖质膜。此外,几个地点亮荧光代表累积的骨钙素检测(数字 4 (d)和 4 (f)箭头所指)。因此,在区分MSCGM没有变更,MSCGM-CD-cultured细胞被发现,在两组细胞与成骨表型(100%相对应 ± 0%的扫描电镜, n = 5 ;图 5)。

检查chondrogenic分化,hMSCs aggrecan表达进行了分析。所有的细胞都aggrecan染色阳性(数据 4 (g)和 4(我))。由于这染色,分化诱导hMSCs都决定chondrogenic细胞(100% ± 0%的扫描电镜, n = 5 MSCGM和MSCGM-CD培养细胞;图 5)。这些结果可能是重要的关于hMSCs扩大临床使用的无血清培养基。

验证培养骨髓细胞hMSCs,特定的细胞表面标记物的表达蛋白进行了研究。像预期的那样无论培养介质、细胞阳性CD29、CD44, CD73,大多CD90。细胞不表达造血CD45标记(图 3)。只有表面CD105标记,两组之间存在显著差异。MSCGM-CD培养条件下,大约一半的细胞(51.70%)CD105是积极的,而几乎所有MSCGM(95.82%)细胞积极治疗。CD105表达这种差异可能是由于生长培养基的成分。它可能包含因素诱发CD105的表达。TGF - β 已被证明在缺氧条件下上调CD105转录( 21]。然而,由于知识精确媒介组合是生产性质,这种影响是假设,需要进一步的调查。之前的数据显示,CD105在血管生成中起着重要作用[ 12]。我们的分析表明,CD105的表达hMSCs潜力产生重大影响再生在小鼠心肌梗死模型( 22]。我们假设这个改进可能引起的诱导增殖或cytoprotection CD105在缺氧条件下⁺肽( 22]。此外,小鼠心肌缺血模型显示,移植的hMSCs选择CD105增强心脏性能相比,六周后治疗unpurified hMSCs [ 22]。综上所述,这表明无血清培养hMSCs可能导致一个受损的治疗结果。 在活的有机体内研究,比较血清hMSCs扩大和血清中必须进行显示细胞是否也同样适用于心脏再生。

为了检查是否hMSCs血清培养期间维持他们的可塑性,他们沿着脂肪形成的刺激来区分,成骨,分别和chondrogenic血统。脂肪形成的分化通常发生少(大约15%的细胞显示脂肪形成的差异化),而成骨和chondrogenic分化的标志出现在所有细胞。这可能是由于这一事实已经承诺间叶细胞祖细胞出现在骨髓的文化 23]。Muraglia和同事已经证明,大约三分之一的hMSCs拥有潜在的分化脂肪形成的血统,而大多数的细胞表现出osteochondrogenic潜力( 23]。这对应于我们的发现(图 5)。

脂肪形成的分化率还不到30%,这可能取决于骨髓抽出物本身。在我们的研究中,骨髓捐赠者在Muraglia以上的研究(平均年龄在我们的研究中:73.6年相比一个年龄段Muraglia捐助者之间的5月,30年)( 23]。因此,骨髓细胞衰老可能经历了开始在我们的研究中,导致较低的可塑性。此外,Muraglia使用从髂骨骨髓而我们使用sternum-derived骨髓,而且尚不清楚这是否有额外的影响分化潜力( 23]。此外,利等人表明,脂肪tissue-derived hMSCs丰富CD105的表达^高有降低成骨的潜力比CD105吗^低( 24]。这可能是脂肪中提取hMSCs特点,从我们的结果明显骨骨髓来源hMSCs:在后一种情况中,我们没有观察到CD105表达之间的相关性和成骨的潜力。此外,利等 。hMSCs用于P1和诱导骨生成7天,而我们使用hMSCs P3和诱导21天。因此,它可能是一个时间的效果。先前的研究使用协议类似于我们确实表明,大部分的脂肪组织,骨髓、脊髓血液hMSCs做共同特征 25),能够区分沿成骨的血统( 26]。

媒体用于脂肪形成的和成骨分化包含10%的边后卫。在进行这项工作时,血清分化培养基没有商业化。此前,无血清培养细胞因此血清诱导分化治疗。然而,在无血清条件下preculture没有显著影响区分沿着这些血统的能力。虽然不显著,脂肪形成的分化细胞倾向于显示个人捐赠者的降低分化。因此,MSCGM-CD-cultured细胞可能一定程度上失去了脂肪形成的分化潜能。这方面将在进一步详细调查研究。

所有细胞成骨的观察和chondrogenic标记表达式根据诱导血统。虽然骨钙素和aggrecan是细胞外基质的蛋白,可能他们也存在细胞,由于分泌之前积累。在这两种血统,细胞生长在多个层。因此,它是可能的,并不是每一个细胞分化,但骨钙素和aggrecan在细胞外空间不允许未分化细胞的识别。然而,据报道,大多数hMSCs有能力分化成成骨和chondrogenic血统 23]。最后,MSCGM MSCGM-CD-cultured细胞显示类似的成骨的级别和chondrogenic标记表达式。