临床前环境中间充质干细胞/基质细胞的生物分布

摘要

由于其多能性和免疫抑制特性，间充质干细胞/基质细胞(MSCs)是治疗免疫疾病和组织修复的重要工具。MSCs使用的增加导致生产过程的发展，需要符合良好的生产规范(GMP)。在欧洲，MSCs是体细胞治疗产品，被称为高级治疗药物(ATMPs)，而在美国，MSCs必须符合当前良好组织实践的要求。无论MSCs的细胞来源如何，其安全性和有效性都必须得到保证，而剂量和生物分布的研究是安全性测试的重要方面。生物分布和药效学的临床前数据是批准的强制性数据。重要的是要证明MSCs不存在不必要的归巢，这种归巢可能导致某些器官的不适当分化，或支持某些实验中提出的癌症发展。根据EMA最近发布的指导方针，所有这些方面都应该在基于风险的方法中解决。在本文中，我们总结了注入MSCs的标记和跟踪的主要方法，报告了目前的动物模型，并概述了现有的生物分布结果。

1.介绍

细胞治疗和再生医学中最有前途的工具之一是利用间充质茎/基质细胞（MSC），因为它们的双分化潜力和免疫调节性能。首先由Alexander Friedenstein描述于20世纪60年代/​​ 70年代[1]，作为粘附在具有纤维囊肿的菌落中粘附到菌落的塑料中的中胚层衍生的骨髓（BM）细胞称为骨骼组织的干细胞（例如，骨，软骨）[2]．首次临床应用是将其与生物材料结合用于修复长骨骨折[3.]．后来，发现间充质干细胞类型的新生细胞起源于神经嵴而不是中胚层[4]，在胎儿、新生儿和成人的几乎所有组织中均发现具有bmm - mscs某些特征的细胞[5]．

国际专家小组[6]描述了MSC类别中细胞的常见最小标准：粘附在塑料中的细胞;能够形成形成菌落形成的单位成纤维细胞（CFU-FS）;膜标志物CD90，CD73和CD105阳性，但造血分子CD45，CD34和HLA-DR阴性;能够通过骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞途径来区分。这些主要特征适用于培养的BM-MSC，但取决于原产地的组织（例如，脂肪组织衍生的CD34和CD54的表达的一些差异[7])。同样，来自不同组织的间充质干细胞在表型和功能上也不相同[8]．

MSC领域已经通过演示迅速移动离体-扩大的MSCs显示免疫抑制特性，这些特性在治疗耐药移植物抗宿主病的广泛2期临床试验中得到了开发[9]器官移植[10]．最后，MSCs具有由许多生长因子和它们产生的细胞因子介导的营养效果[11]．

来自不同组织的MSCs细胞现在被广泛应用于临床试验。在欧洲，MSCs是体细胞治疗产品，被称为高级治疗药物(ATMPs)，符合欧洲法规No. 1394/2007。在美国，与任何其他基于细胞和组织的产品的生产一样，MSCs必须符合美国联邦法规当前良好组织规范的要求。无论MSCs的细胞来源如何，其安全性和有效性都必须得到保证，而剂量和生物分布的研究是安全性测试的重要方面。此外，在批准之前，监管机构要求提供生物分布和药效学的临床前数据;在欧盟，这些数据应该根据欧洲药典产生。事实上，MSCs的生物分布是保证安全性的主要临床前数据之一;重要的是要证明MSCs没有不必要的归巢，这可能导致某些器官的不适当分化[12或支持某些实验中提出的癌症发展[13，14]．所有这些方面都应该以一种基于风险的方法来解决。EMA高级治疗委员会(CAT)最近发布了基于风险方法的指南(基于风险方法指南根据ATMPs指令2001/83/EC附录I, part IV: EMA/CAT/CPWP/686637/2011)。该指南定义了风险，例如，不希望的细胞/器官靶向、不希望的组织形成和肿瘤形成;风险因素，如使用ATMPs后导致特定风险的定性或定量特征。所有关于风险和风险因素的信息都应该被整合起来建立风险分析，而生物分布是提供不同风险和风险因素信息的主要临床前数据之一。为了达到这一目标，必须根据欧洲药典和良好实验室规范进行生物分配。

在注射MSC后，无论途径如何，生物分布的研究都具有挑战性;必须分析不同的方面，主要是用于细胞标记或染色和跟踪，动物模型和人类使用相关性的方法。

2.标记和跟踪MSCS

对于其他活细胞，MSCs可以通过多种方法进行标记和染色。在培养过程中，它们可以很容易地用细胞内染料如5-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯或合成核苷如5-溴-2 ' -脱氧尿苷(BrdU)进行标记。BrdU在细胞复制过程中被引入到新合成的DNA中，取代胸腺嘧啶。在标记阶段，该方法需要细胞分裂，导致标记不均匀，残留的未标记MSCs比例不一致。输注后，brdu特异性抗体可在组织中检测到标记的MSCs [15]．对于这两种标记分子，细胞分裂导致掺入的分子顺序减半，其可以将每种细胞的量降低至低于检测阈值。应该强调的是，这些方法对于在血管内注射后研究分布或局部涂抹更有用。在MSCs中的另一种易于细胞标记的方法是用编码荧光蛋白的基因转染细胞（例如，绿色荧光蛋白[GFP]）[16]．可以遇到两个问题：由于其他细胞如巨噬细胞的蛋白质的再摄取蛋白质，某些组织和非特异性表达的自发荧光。最后，所有这些方法都不允许在活的有机体内MSCs生物分布的跟踪;在动物杀死后，需要不同组织的特异性染色和组织学分析。为了在活的有机体内随访，几种标签技术是有用的：用诸如Technetium-99米的放射性示踪剂分子标记，¹¹¹indium-oxine [17]或氟脱氧葡萄糖(18FDG)，用正电子发射断层扫描(PET) [18];用荧光素酶和基于外部相机的基于外部相机的射流转染在注射后的生物发光（Luciferin）[19];或在间充质干细胞中加入磁性纳米颗粒在活的有机体内核磁共振成像(20.，21]．

使用不同的分子标记可能会对间充质干细胞的功能产生影响，特别是在分化或免疫抑制方面。对于铁纳米颗粒，研究显示了矛盾的结果:Chang等人[20.]报道受损在体外胺表面修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记人间充质干细胞后的成骨和软骨分化相反，Schmidtke-Schrezenmeier等人[21发现用氧化铁-聚(l -丙交酯)纳米粒子标记MSCs并不影响标记MSCs的大量功能:生存能力、表型、增殖、分化或免疫抑制。这些相互矛盾的结果可能与所使用的铁粒子的不同、每个细胞的粒子数量或细胞的生产过程和年龄有关。

最后，在异种模型中，无需事先标记，可以使用人类Alu序列的定量PCR (qPCR)来跟踪人间充质干细胞[22或标记人类特异性抗原后的组织学。人类Alu序列高度重复，具有物种特异性，序列长度为300 bp。由于它们的高重复和物种特异性，Alu序列是检测小鼠器官中少数人类细胞入侵的首选标记。以从小鼠多个组织样本中提取的DNA为模板，以健康非诱导小鼠为阴性对照，通过qPCR扩增评估Alu标记的存在和定量。从不同的小鼠组织和人间充质干细胞中提取已知的DNA，可以建立人类DNA相对于小鼠DNA的标准曲线。这条标准曲线允许估计每重量单位组织的细胞数，如230个人体细胞/g组织(LS，个人数据);通过改进技术，阈值可以达到100个人体细胞/器官[23]．

3.动物模型

至于其他临床前数据，动物模型的选择至关重要。对于生物分布来研究生物分布，第一步可能是使用来自同一动物物种的MSC。但是，监管机构需要人体MSC的数据。为了防止拒绝人体MSCs，这可能会干扰在不同组织内的生物分布和维护，最受欢迎的模型是在免疫染粒剂中注射，例如裸鼠，或防止任何排斥点，点击/ SCID小鼠。由于裸体甚至点击/ SCID小鼠免疫的不完全消失，最好的模型似乎是NOD-RAG鼠标[24]．小鼠模型的主要问题是静脉注入MSCs的剂量，通常在50万到200万之间，以防止肺栓塞死亡。这些剂量相当于每公斤1 - 2亿间充质干细胞，与临床相关的人体剂量有很大的偏差。在欧盟委员会第七框架计划的欧洲项目(REBORNE: FP7-HEALTH-241879)中，我们研究了骨髓和脂肪组织两种不同组织间充质干细胞的生物分布。在SCID小鼠中进行了静脉输注或皮下植入载于陶瓷支架的MSCs后的研究。无论MSCs来源如何，通过对人Alu序列的qPCR分析，均未发现MSCs在静脉输注后出现不必要的归巢现象。在第7天，与At - msc相反，我们在肺中没有发现任何BM-MSCs;第91天，只有少量at间充质干细胞在肺中残留了人类DNA。MSCs +支架植入术后，其他器官无再循环和归巢现象。此外，不同器官的组织学分析未显示任何肿瘤形成。 These data demonstrated the safety of using BM and AT MSCs, and based on these results and other preclinical data, the French, German, Spanish, and Italian regulatory authorities delivered authorization for starting clinical studies in bone repair.

使用其他模型，如非人灵长类动物，似乎更相关，但由于伦理原因，很难，当测试人类间充质干细胞时，使用免疫抑制药物是强制性的。

对于预期的临床应用，模型应与间充质干细胞输注途径(静脉、动脉、局部注射或植入)和治疗条件相关。间充质干细胞优先归属于受损组织，如受辐射损伤的组织[25]．生物分布和药效学必须在正常和动物疾病模型中进行研究。

最后，由于来自不同组织的间充质干细胞并不相同[8]和培养过程不同，应检测不同类型的间充质干细胞。

4.Biodistribution msc的

4．1.在动物模型

检测人alu序列显示，静脉内注射小鼠的人BM-MSC迅速捕获肺部。在本第一次栓塞之后，可以再循环MSC，如通过外周血单核细胞培养显示15分钟的灌注，显示人类源的CFU-FS [23]．在短时间的随访中，注入的人间充质干细胞被移植到不同的器官，主要是肝脏，但这种二次再循环似乎只涉及少量注入的间充质干细胞。在该模型中，在输注后48和96小时，6个组织(肝、脾、胰腺、脑、肾、心脏和骨髓)中只有0.04%和0.01%的人骨髓间充质干细胞恢复。在较长时间(7天和3个月)研究人骨髓间充质干细胞在小鼠中的分布时，仅在脾脏中发现了7天的人细胞(LS，个人数据)。标记技术似乎很重要:用锝- 99m标记和静脉输注人骨髓间充质干细胞显示，人细胞在骨、骨髓、脾脏、肌肉和软骨中可长期存在4至13个月[26]．

BM-MSCs静脉内注入，作为人类AT-MSCs，脂肪组织首先在肺中被捕获。用裸鼠荧光素酶转染的人脂肪组织MSC显示，从肺部1周内清除人细胞，然后在肝脏中持续31周[19]．在NOD/SCID小鼠中检测人脂肪组织MSCs的Alu序列，在输注7天后，人细胞位于脾脏，但主要停留在肺部，并持续3个月，没有任何其他继发定位(LS，个人数据)。近年来，静脉输注人脂肪组织间充质干细胞后，人细胞迅速清除，主要在第11天和第28天出现在肺和胃肠道。此外，结果也有很大的差异:只有17%到25%的小鼠呈阳性[22]．关于特定的监管要求，在睾丸或卵巢中未发现静脉内注入的人体MSC [22，27]．

在小鼠动脉内注入的人骨髓间充质干细胞和静脉注入的细胞中发现相似[23]但是由用于该疾病的动物模型不同。例如，在具有脑缺血的大鼠中，注射人BM-MSCs导致脑中人体细胞的瞬态定位[28]．

在相同物种中使用动物MSC的结果可能有所不同。静脉输注后¹¹¹含铟 - 莫莫氏大鼠MSCs，Yoon等人。用脑创伤的大鼠观察到脑吸收[29]．在辐照的灵长类动物模型中，静脉输注gfp标记的骨髓间充质干细胞和造血干细胞在输注后12 - 82天导致骨髓、皮肤、肠道和肌肉的定位，而肺部没有细胞[27]．

最后，在局部注射模型中，例如关节内注射[22]及肌内注射[30.，细胞在注射部位停留很长时间。肌肉注射后，在肌肉外的任何评估组织中均未检测到人类DNA [30.]．相比之下，在不同时间（从第11-186天）的细胞内注射后，在心脏，脾，肠，脑，睾丸或10％至20％分析的小鼠的肝脏中发现了人ALU序列[22]．当细胞植入生物材料或支架时，局部跟踪和证明人体细胞的持续性可能是困难的[31.]但BM-MSCs或AT-MSCs不会传播（LS，个人数据）。

4．2．在人类

关于人类间充质干细胞生物分布的数据很少。在肺捕获方面，结果可能与在啮齿动物模型中发现的结果有些相似，但在再循环方面的差异可能与疾病或物种有关。Gholamrezanezhad等人[17]用放射性标记的(¹¹¹in -oxine)静脉注入晚期肝硬化患者的骨髓间充质干细胞，发现在最初肺部积聚后，骨髓间充质干细胞重新定位于肝脏和脾脏:肺的放射性从33.5%下降到2%，脾脏的放射性从2%上升到42%。在治疗3例接受同种异体BM-MSCs corticoid-resistant移植物抗宿主病(GVHD)造血干细胞移植后,后期的分析一个病人显示供体DNA针对移植物抗宿主病淋巴结和胃肠道,却一直没找到供体DNA在肺、肝或脾(32.]．

5.结论和观点

用于安全原因，监管要求以及ATMPS使用的风险方法，MSC生物分布的研究是强制性的。MSC的标签很容易，但应考虑每个技术和所需的后续的局限性。经典技术（例如，GFP标签）不允许在活的有机体内跟进。允许外部随访(如荧光素酶、铁颗粒或放射性)的标记系统可能会降低检测灵敏度。qPCR检测人类Alu序列简单、敏感，可用于不需要持续外部随访的情况。在临床前环境中，使用的主要动物模型是免疫缺陷小鼠(裸鼠、NOD/SCID或NOG-Rag)。虽然这种模型易于使用和信息丰富，但也有局限性:它们是异种的，人MSCs比小鼠MSCs大，啮齿动物和人类的生理特征不同。不管模型是什么，骨髓间充质干细胞似乎最初被困在肺部。肺栓塞后，MSCs再循环，但再循环细胞的数量似乎较低，继发性归巢发生在肝脏、脾脏、炎症或损伤部位。

两个主要建议是（1）使用最敏感的技术用于标记和/或跟踪和（2）在免疫排斥潜力和治疗预期疾病方面的相关动物模型。最后，需要动物模型，信息性但不够，需要更多的人类数据。可以与执行某些阶段的监管机构进行讨论，用于验证人类的跟踪系统和生物分布。此外，报告人类中所有可用数据的注册管理机构将具有重要意义。

致谢

本研究得到了欧洲委员会第七框架项目CASCADE (FP7-HEALTH-233236)和REBORNE (FP7-HEALTH-241879)的资助，国家研究机构(Agence Nationale pour la Recherche)资助:SAFE (ANR-2011-RPIB-01201)和ECELLFRANCE基础设施计划(ANR-11-INSB-005)，并获得région Midi-Pyrénées (NOMASEC)、Oncodesign公司(法国第jon)的批准，用于SCID小鼠的研究。

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