不同的IPS细胞显示出不同的心脏分化效率

抽象的

通过将胚胎干细胞(ES)中高表达的转录因子引入体细胞，可以产生患者特异性诱导多能干细胞(iPS)细胞。通过克服与胚胎干细胞相关的伦理问题和免疫学问题，这为基于细胞移植的再生医学开辟了新的可能性。尽管各种iPS细胞生成方法的发展已经提高了效率、安全性和普遍的多功能性，但哪种类型的iPS细胞适合临床使用仍是未知的。因此，本研究的目的是评估(1)不同类型的iPS细胞系在体外向心肌细胞分化的潜力、时间进程和效率，以及(2)iPS细胞来源的心肌细胞的特性。我们发现高质量iPS细胞在心肌细胞分化的时间进程和分化效率方面比低质量iPS细胞表现出更好的心肌细胞分化，后者几乎从未分化成心肌细胞。由于各种iPS细胞株的特性不同，如心脏分化效率和潜在的安全危害，新建立的iPS细胞株在用于心脏再生医学之前必须进行特征鉴定。

1.介绍

胚胎干细胞(ES)细胞是用于心血管干细胞治疗的有吸引力的候选细胞，因为小鼠和人类ES细胞已被证明具有无限增殖能力和有前途的多能性[1那2]．还有证据表明，ES细胞在细胞替代疗法的心脏疾病，因为它们的能力来区分并增殖使用的最佳候选之一，供给成熟移植人类心肌细胞为大相当数量的，患病的人的心脏[3.-5.]．在动物模型中先前的研究已经表明，ES细胞衍生的心肌细胞的移植改善心脏功能和存活[6.那7.]然而，由于ES细胞的起源以及对免疫排斥或细胞移植后需要免疫抑制剂的担忧，人类ES细胞的建立和使用在伦理和法律上仍存在争议[8.]．

小鼠和人诱导的多能干（IPs）细胞是人工建立的多能干细胞，其类似于ES细胞[9.-16]．iPS细胞在形态、增殖能力、表面抗原、基因表达、多能干细胞特异性基因的表观遗传状态、端粒酶活性等方面与ES细胞相似。此外，小鼠iPS细胞已经表现出生殖系贡献和四倍体互补，这是最理想的干细胞特性之一[10那13那17]．人类iPS细胞最初由成人皮肤成纤维细胞通过四种转录因子(10月3日那Sox2那Klf4,c-Myc); 然而，最近的证据表明，其他几种类型的体细胞可用于产生带有或不带有残余转基因的iPS细胞[18]。由于iPS细胞可以很容易地从人体体细胞中产生，并且与ES细胞具有几乎相同的潜能，因此，应该有可能开发iPS细胞衍生的心肌细胞移植，作为衰竭心脏的治疗，而不存在与使用ES细胞相关的伦理问题或免疫排斥。

因此，iPS细胞被认为是基于干细胞的细胞替代疗法的强有力的候选细胞，其应用有望解决目前预后非常差的严重心脏病的心脏再生医学中许多遗留的挑战。尽管人们认为诱导多能干细胞的形态、生长特征和多能性与胚胎干细胞相似，但是否每个诱导多能干细胞都具有类似的特性并适合用于心脏再生医学尚不清楚。在本研究中，我们使用了特征明确的iPS细胞系Fbx15和Nanog。Fbx15-iPS细胞是第一个被报道的iPS细胞系，它们表现出与ES细胞相似的形态、增殖和畸胎瘤形成，尽管它们没有表现出生殖系能力[9.]．随后产生纳米-IPS细胞以克服这些问题，并且该细胞系表现出通过殖民线的成功传输到下一代[13]因此，在本研究中，我们使用Fbx15 iPS细胞作为低质量iPS细胞，使用Nanog iPS细胞作为高质量iPS细胞。目前使用iPS细胞进行细胞移植治疗的关注点集中在iPS细胞源性细胞移植后的肿瘤形成上。具体而言，分化细胞中残留转基因的存在以及分化细胞中iPS细胞的污染令人担忧。然而，很少有人试图阐明不同类型的诱导型多能干细胞分化的心肌细胞是否具有正常功能和/或与ES细胞衍生的心肌细胞相同的功能。为了实现iPS细胞在再生医学中用于治疗各种心脏疾病的潜力，我们需要确定使用的最佳类型的iPS细胞。因此，本研究的目的是：（1）阐明几种小鼠iPS细胞系之间心肌细胞分化潜能的差异；（2）对来自不同iPS细胞系的心肌细胞进行分子表征。

2.材料和方法

2.1。鼠标ES和IPS细胞

小鼠ES细胞（EB3）从里肯发育生物学中心多能干细胞研究实验室获得。小鼠iPS细胞（iPS-MEF-Ng-20D17、38C2、38D2、iPS-TTF-Fbx-WT-1和4-3）从京都大学iPS细胞研究和应用中心获得，并根据日本教育、文化、体育、科学和技术部的人类胚胎干细胞衍生和利用指南使用。使用Nanog iPS、Fbx15 iPS和ES细胞比较特征在不同的iPS细胞系和ES细胞之间进行cs。为了产生Fbx15 iPS细胞，通过携带逆转录病毒的方法将转基因导入小鼠尾端成纤维细胞10月3日（也被称为POU5F1)，Sox2那Klf4,原癌基因。随后，通过先天选择FBX15-IPS细胞菌落Fbx15（也被称为Fbxo15）在先天式FBX15启动子下敲入其中选择标记基因的表达[9.]．要生成的Nanog-iPS细胞，转基因通过逆转录病毒携带导入细菌人工染色体（BAC）的转基因小鼠的胚胎成纤维细胞10月3日那Sox2那Klf4,原癌基因。随后，通过启动子的Nanog活化，其中，所述选择标记基因是在Nanog的启动子控制下插入，它是在转基因的BAC引入选定的Nanog-iPS细胞[13]．我们证实，IPS细胞表现出典型的ES细胞样特征，并且所有细胞在形态上相似，并且对于碱性磷酸酶（ALP），未分化细胞标记的染色，揭示了ES，Nanog-IP和FBX15-IP中的强ALP表达细胞。

２.２.小鼠ES和iPS细胞的维护

Mouse ES and iPS cells were maintained on gelatin-coated dishes in Glasgow minimum essential medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Equitech-Bio Inc, Kerrville, TX), 0.1 mM minimum essential medium (MEM) nonessential amino acids solution (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 2 mML.-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)， 0.1 mM-巯基乙醇(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)和2000 U/mL小鼠白血病抑制因子(LIF;微孔,Billerica, MA)。Fbx15-iPS细胞在小鼠胚胎成纤维细胞中维持，培养液为Dulbecco 's modified Eagle 's培养基(Life Technologies, Grand Island, NY)，添加10%胎牛血清(Equitech-Bio Inc, Kerrville, TX)， 0.1 mM MEM非必需氨基酸溶液(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)， 2 mML.-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)， 0.1 mM-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), and 2000 U/mL murine LIF (Millipore, Billerica, MA).

２.３.小鼠ES和iPS细胞来源心肌细胞的分化

用0.25%胰酶- edta分离小鼠ES和iPS细胞。用400个细胞在一个悬吊液滴中形成一个EB制定的老鹰的媒介（MEM;Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)补充10% FBS (Equitech-Bio Inc, Kerrville, TX)。第2天，用新培养基将EBs转移到漂浮培养板中。在分化后4 ~ 5 d，将漂浮的EBs转移到附着培养中。通常，搏动细胞出现在第7天。

２.４.Immunofluorescent染色

用4%多聚甲醛在pH 7.0的磷酸盐缓冲盐水中固定细胞20分钟。随后，在室温下用0.2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)渗透细胞10分钟，然后用一抗在4°C孵育过夜。用含0.1% Tween-20的tris缓冲盐水冲洗细胞4次，然后与二抗室温孵育30分钟。本研究使用的主要抗体为小鼠单克隆抗体-肌动蛋白(1: 200稀释;Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)和抗肌球蛋白重链(MF20;1: 100;发育研究杂交瘤库)，山羊多克隆抗Nkx2.5(1: 50;圣克鲁斯生物技术)和反GATA4.(1: 50;Santa Cruz Biotechnology)和兔多克隆抗anp (1: 200;凤凰制药)。细胞与荧光染料结合的二抗在室温下孵育30分钟。4 '，6 ' -二氨基-2-苯基吲哚(Life Technologies, Grand Island, NY)核染色后，在荧光显微镜下观察荧光信号(IX71;奥林巴斯、日本)。

2.5。总RNA提取，cDNA合成和实时PCR

根据制造商的说明，使用Isogen（Nippon Gene）的组织和胚胎体制成组织和胚胎体制成的总RNA。污染的基因组DNA在37℃下通过RNase的DNase I（Life Technologies，Grand Island，Ny）降解30分钟。处理后，通过苯酚 - 氯仿萃取和乙醇沉淀使DNase灭活。我们使用寡聚（DT）12-18底漆（上标II Rt试剂盒; Life Technologies，Grand Island，Ny）逆转转录到cDNA中的总RNA。如前所述进行RT-PCR [19]．引物和探针的混合物（Applied Biosystems）上的靶基因名称和标识号列于补充表1中，可在网上http://dx.doi.org/10.1155/2013/659739.。

2.6。电生理学

使用配备有记录室的显微镜和无辐射加热板（微量钢板; KITAZATO供应）进行电生理学研究。向培养基中加入HEPES（10mmol / L），将灌注液的pH保持在7.5-7.6。标准玻璃微电极，具有25-35米的直流电阻when filled with pipette solution (2 mol/L KCl) were used. The electrodes were positioned using a motor-driven micromanipulator (EMM-3SV; Narishige, Japan) under optical control. Spontaneously beating cells were selected as targets, and the action potentials of the targeted cells were recorded. The recording pipette was connected to a patch-clamp amplifier (Axopatch 200B; Axon Instruments); signals were passed through a low-pass filter with a cutoff frequency of 2 kHz and digitized with an A/D converter with a sampling frequency of 10 kHz (Digidata 1440A; Axon Instruments). Signals were monitored, recorded as electronic files, and analyzed offline with pCLAMP 10 software (Axon Instruments).

2.7。利用片上MEA系统进行现场潜在记录

MEA芯片从Multi Channel Systems(德国)获得，并用纤维连接蛋白(F1141 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)进行涂层。敲打EBs被镀在电极上，并在37°C的95%空气和5% CO的湿化气氛中培养₂。MEA测量在37℃下进行。最初处理信号，随后用MC_RACK（多通道系统）分析所获得的数据。从2分钟标记提取分析数据到记录的5分钟。异丙醇和维拉帕米（Sigma-Aldrich，St.LOUIS，MO）溶解在蒸馏水中，为0.1,1和10mm和10 μ.M股溶液。将这些储备溶液稀释至培养基中所需的浓度，并施加到测试芯片上。用于药物测定的方案如下：将测试芯片上的培养基交换为新鲜培养基，并记录现场电位5分钟。随后，将药物施加到试验芯片上，并在5-10分钟孵育后，再次测量现场电位。

2.8。统计分析

结果以平均数报告SEM。学生们T.- 最低用于评估任何差异的重要性。被认为意义重大。

3.结果

３．１．Fbx15-iPS细胞显示明显的残留转基因表达

为了评估ES、Nanog-iPS和Fbx15-iPS细胞的分子特征，我们用半定量RT-PCR检测了四种内源性和外源性(转基因)转录因子的表达。结果表明，这四种内源性转录因子在ES、Nanog-iPS和Fbx-iPS细胞中表达相似。两个独立的Fbx-iPS细胞系，WT-1和4-3，清楚地显示了残留的转基因表达。与Fbx15-iPS细胞相比，这4个转基因基因在3个独立的纳米ips细胞株(即20D17、38C2和38D2)中的表达显著降低(图)1）.这些的Nanog-iPS细胞系的两种，即，20D17和38D2，显示的c-Myc转基因表达，而Nanog的-iPS细胞系38C2表明KLF4转基因表达。在三个的Nanog-iPS细胞系中观察到残余的转基因的不同的表达，并有转基因表达的iPS细胞中没有统一的图案。这些结果表明，反转录病毒的转基因表达在Nanog的-iPS细胞在很大程度上与沉默FBX 15-iPS细胞相比，认为转基因沉默的程度的Nanog-iPS细胞系的不同而不同。人们普遍认为，局部重编程的iPS细胞表达所述病毒的转基因和内源性多能性基因，和全重编程的iPS细胞沉默病毒转基因的内源基因维持多能状态[20]因此，逆转录病毒载体沉默可以作为iPS细胞的质量指标，高质量的iPS细胞沉默转基因，低质量的iPS细胞表达转基因。

3.2。Nanog的-iPS细胞呈现更大的跳动效率要比感染Fbx15-iPS细胞

为了检查心脏分化效率的差异，用于诱导常规垂直的垂直跳动胚胎体（EBS），含有丰富的心肌细胞。EBS的跳动效率与ES和IPS细胞的心肌细胞分化良好，并且可以是心肌细胞分化效率的良好标记[5.那21]．在EB形成后的第6-7天左右，在ES细胞和所有纳米-IPS细胞系中开始跳动EBS。但是，FBX15-IPS细胞线需要更长时间才能区分击打EBS（图2（a））.此外，跳动EB的发生率在感染Fbx15-iPS细胞系显著更低。有趣的是，打浆效率评价三个的Nanog-iPS细胞系之间的差异。具体而言，跳动EB的发生率在20D17和38D2的Nanog-iPS细胞系比38C2的Nanog-iPS细胞线和感染Fbx15-iPS细胞系都显著更高，虽然跳动EB的发生率比仍然显著降低胚胎干细胞。有在38C2的Nanog-iPS细胞系和12天后的感染Fbx15-iPS细胞系之间没有显著差异，虽然有在直到38C2的Nanog-iPS细胞系进行观察，感染Fbx15-iPS细胞系自主跳动的时间差。这些结果表明，有在心脏分化的效率，以及在用于心脏分化所需要的时间的差异，个体iPS细胞系之间。

３．３．Fbx15-iPS细胞中中胚层和心脏标记基因的表达明显减少和延迟

FBX15-IPS细胞表达转基因，并且表现出比ES和纳米IPS细胞的心脏分化的较低效率。为了确定在来自多能干细胞的FBX15-IPS细胞的心脏分化期间阻抗哪个步骤，我们评估了心肌细胞分化期间的时间基因表达的模式。时间表达短尾Ť，中胚层标记物，在ES和Nanog-iPS细胞中相似。相比之下,短尾Ť表达在感染Fbx15-iPS细胞中显著延迟，这表明这些细胞趋向于抵抗中胚层分化（图2 (b)）.的表达Mesp1，最早的心脏命运标记之一，在ES和Nanog-iPS细胞中，在第3天和第5天短暂上调;然而,Mesp1Fbx15-iPS细胞的表达明显延迟(图)2 (c)）.在心脏特异性基因方面，我们评估了心脏转录因子的表达Nkx2.5和GATA4.以及与心脏相关的基因钠尿肽A型(Nppa)和肌球蛋白轻链-2v（Myl2）。对于所有心脏特异性基因，在ES细胞中检测到最高表达的趋势，在FBX15-IPS细胞中看到的最低（和延迟）表达（图2 (d)-2 (g)）.这些数据表明，Fbx15-iPS细胞对中胚层和心脏分化具有抗性。

3.4。纯化的感染Fbx15-iPS细胞来源的心肌细胞保留残余转基因表达

如上所述，Fbx15-iPS细胞继续表达残留的转基因，减弱了心脏分化效率。尽管如此，跳动的心肌细胞还是从Fbx15-iPS细胞中获得的。这可能是由于Fbx15-iPS细胞群体的异质性:尽管存在抗分化的转基因阳性iPS细胞，转基因阴性iPS细胞能够分化成心肌细胞。为了确定Fbx15-iPS细胞来源的心肌细胞分化后是否表达转基因，我们使用四甲基罗丹明甲酯(TMRM)荧光染料法纯化心肌细胞[22]．令人惊讶的是，即使在纯化Fbx15-iPS细胞来源的心肌细胞后，残留转基因的表达仍然相对较高(图)3.）.此外，在三种纳米IPS细胞系中，发现38C2细胞具有低水平的KLF4残留转基因的表达。这些数据表明，转基因阳性IPS细胞可以分化成心肌细胞，并且在心脏分化后仍然表达转基因。在一起，FBX15-IPS细胞系具有低心脏分化效率的观察结果，并且38C2纳米-IPS细胞系具有比其他纳米IPS细胞系更低的跳动效率，表明剩余表达Klf4转基因可能对心肌细胞分化有负面影响。此外，部分沉默的逆转录病毒基因的相对高表达可能解释了ES、Nanog-iPS和Fbx15-iPS细胞之间心肌细胞分化效率的差异。

3.5。在iPS细胞来源的心肌细胞的心脏特异性标志物的基因表达

由于iPS细胞来源的心肌细胞继续在不同水平上表达转基因，半定量RT-PCR和免疫染色被用来评估心脏特异性基因在ES、Nanog-iPS和Fbx15-iPS细胞来源的心肌细胞中的表达。如图所示4(一)，RT-PCR分析显示各种心脏标志物基因的适当表达，包括肌球蛋白重链（myh6.)，肌球蛋白重链（myh7.)，肌球蛋白轻chain-2a（myl7.)，myl2.那-sarcomeric辅肌动蛋白（ACTN1蛋白),B型利钠肽（NPPB.)免疫荧光分析显示，ES和iPS细胞衍生的心肌细胞显示出典型的肌节形成，这是基于针对-肌动蛋白和肌球蛋白重链（MHC），心脏特异性转录因子的适当核表达Nkx2.5和GATA4.，心房钠尿肽和存在（ANP）在围绕核分泌颗粒（图4 (b)）.

3.6。IPS细胞衍生心肌细胞正常功能性能的电生理学证明

因为IPS细胞衍生的心肌细胞在各种水平下继续表达转基因，所以我们使用玻璃微电极记录IPS细胞衍生心肌细胞的动作电位，以表征IPS细胞衍生的心肌细胞的电生理学性质。ES细胞衍生的心肌细胞用作对照。选择第20天拍摄殖民地并分散到小簇和单细胞中。起搏器状，静脉般的心室型作用电位被记录在ES和IPS细胞衍生的心肌细胞中（图5(一个)-5 (c)) [23那24]．两者的Nanog-iPS细胞与感染Fbx15-iPS细胞来源的心肌细胞表现出适当的起搏器状，心房 - 样，和胎儿心室型动作电位。

3.7。IPS细胞衍生心肌细胞的正常顺从响应

接下来，我们试图确定iPS细胞来源的心肌细胞是否能够对各种药理学干预作出适当的反应。为此，我们将搏动EBs放置在多电极阵列(MEA)板上，并记录搏动EBs暴露于电极下的多个电极的细胞外电图- 肾上腺素能受体激动剂异丙烯醇（数字6.（一种）-6.(d))和l型钙通道阻滞剂维拉帕米(图)6.（e） -6.(h))。异丙肾上腺素剂量依赖性地增加iPS细胞来源的心肌细胞的自发搏动频率（图6.(d))。纳米ips细胞来源的心肌细胞搏动频率从1.1增加0.1到1.60.2 Hz in the absence and presence of 500 nM isoproterenol, respectively (；)而Fbx15 iPS细胞来源的心肌细胞从0.50.1至1.10.5赫兹(；）.Similar responses were observed to 500 nM isoproterenol in ES cell-derived cardiomyocytes (Figure6.(d))。相比之下，维拉帕米剂量依赖性降低了自发跳动的频率（图6.(h))。纳米ips细胞来源的心肌细胞搏动频率从1.5降低0.3至1.10.1 Hz时，分别存在1000nm维拉帕米(；)而Fbx15 iPS细胞衍生的心肌细胞从0.60.1到0.40.1赫兹(；）.在ES细胞来源的心肌细胞中观察到1000 nM维拉帕米的类似反应(图)6.(h))。这些实验表明，两者的Nanog-IPS和感染Fbx15-iPS细胞衍生的心肌有正常的性频率响应。

4。讨论

在多能干细胞技术最近的突破，开辟了利用iPS细胞在患者特异性干细胞治疗的可能性。由于从高桥和山中的第一份报告，许多贡献已对这一新兴领域[9.]．许多重编程转录因子的传递系统可用于生成iPS细胞[9.-12那25-31]．此外，各种组织可以用来生成iPS细胞，包括胚胎成纤维细胞、成人真皮成纤维细胞、肝细胞、胃细胞、神经干细胞、脂肪干细胞和造血干细胞/祖细胞[14那32-36]．单个iPS细胞系的分子特征和质量可能因所使用的重编程策略和细胞来源而不同，在这些细胞的临床应用之前识别这些差异是很重要的[21那37-39]．

在目前的研究中，我们使用Nanog-iPS细胞和Fbx15-iPS细胞。我们在这些iPS细胞中观察到许多不同的特征(补充表2)。初始iPS细胞集落产生的时间也会影响iPS细胞的质量，包括转基因沉默、染色体稳定性和生殖系贡献[40]．它们是由类似的协议，但iPS细胞产生的精确的定时产生的可能不同，这可能会影响iPS细胞的质量。iPS细胞衍生的心肌显示典型的心脏表型，包括对心肌特异性转录因子和蛋白，以及典型的电生理学特性的表达。虽然iPS细胞来源的心肌细胞的结构和功能特性是相似的，有在自发跳动效率和心肌特异性转录因子和蛋白质的瞬时表达方面的Nanog-iPS细胞与感染Fbx15-iPS细胞之间明显的差异。由于大量在心脏再生医学需要的成熟心肌细胞的，最好是用高质量的iPS细胞（Nanog的-iPS细胞在本研究中）。所述感染Fbx15-iPS细胞保留剩余的转基因表达，甚至感染Fbx15-iPS细胞来源的心肌细胞的纯化后，残余的转基因的表达保持相对较高。如果剩余的转基因表达会直接影响心脏分化效率，并且如果转基因在低质量的iPS细胞的抑制会增加心脏分化效率仍不清楚。还有另一种可能性，即残余的转基因表达是简单地用于低质量的iPS细胞的标记物，并且低质量的iPS细胞将显示出低的心肌分化效率。另外，肿瘤的形成仍然存在的这样的细胞的移植后的风险，并且转基因的表达的残留可能会妨碍正常的心肌功能。

5.结论

在这些细胞在心脏再生医学的未来临床应用之前，将用于再生治疗的iPS细胞能够以最小的风险产生足够数量的心肌细胞是势在必行的。目前的研究结果对iPS细胞系的选择和这些细胞在未来的临床实践提出了安全性的担忧。

披露

Tomofumi田中和服部史之都的生物医学研究实验室，Asubio制药有限公司，日本的员工。

致谢

该研究得到了日本教育，科文，日本的研究资助，向Shinsuke Yuasa和Keiichi Fukuda提供支持。资助者在研究设计，数据收集和分析中没有作用，决定发布或编写纸张。

补充材料

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