SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 659739年 10.1155 / 2013/659739 659739年 研究文章 独特的“诱导多能性”细胞显示不同的心脏分化效率 http://orcid.org/0000 - 0003 - 4203 - 7613 Ohno 洋平 1 汤 Shinsuke 1 Egashira 渡边 1 塞其 Tomohisa 1 桥本 Hisayuki 1 http://orcid.org/0000 - 0002 - 5898 - 3543 Tohyama Shugo 1 http://orcid.org/0000 - 0003 - 2686 - 9604 斋藤 雪 1 http://orcid.org/0000 - 0001 - 8310 - 067 x Kunitomi 阿基拉 1 下地 Kenichiro 1 http://orcid.org/0000 - 0003 - 4943 - 5673 Onizuka 武 1 Kageyama 救护 1 http://orcid.org/0000 - 0002 - 3766 - 2812 Yae 小次郎 1 田中 Tomofumi 1、2 http://orcid.org/0000 - 0002 - 4636 - 6900 金田 Ruri 1 服部年宏 Fumiyuki 1、2 日本村田公司 Mitsushige 1 木村 Kensuke 1 福田 Keiichi 1 Bock-Marquette Ildiko 1 心内科 庆应义塾大学医学院 东京160 - 8582 日本 keio.ac.jp 2 生物医学研究实验室 科比Asubio制药有限公司,650 - 0047 日本 asubio.com 2013年 27 10 2013年 2013年 05年 06 2013年 18 08年 2013年 03 09年 2013年 2013年 版权©2013洋平Ohno et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

不同的诱导多能干细胞(iPS)细胞可以通过引入转录因子生成胚胎干细胞(ES)细胞中高度表达成体细胞。这开辟了新的可能性为再生医学细胞transplantation-based克服与胚胎干细胞相关的伦理问题和免疫问题。尽管各种方法的发展“诱导多能性”细胞的生成,导致提高效率,安全,和一般的多功能性,现在仍不知道哪个类型的“诱导多能性”细胞适合临床应用。因此,本研究的目的是评估(1)分化潜能,时间进程和效率的不同类型的体外诱导多能干细胞分化成心肌细胞和心肌细胞(2)“诱导多能性”细胞衍生的属性。我们发现高质量的“诱导多能性”细胞表现出更好的心肌细胞分化的时间进程和效率比低质量的“诱导多能性”细胞的分化,这几乎不会分化成心肌细胞。因为不同属性的心脏等各种诱导多能干细胞分化效率和潜在的安全隐患,必须为新成立的诱导多能干细胞在心脏再生医学使用。

 1。介绍

胚胎干细胞(ES)细胞是有吸引力的候选人用于心血管干细胞疗法,因为老鼠和人类胚胎干细胞已被证明有无限增殖的能力,并承诺multipotency [ 1, 2]。证据也表明,ES细胞是最好的候选人之一用于心脏疾病的疗法,因为它们分化和增殖能力,提供大量的成熟的人类心脏细胞移植到大,患病的人的心( 3- - - - - - 5]。先前的研究在动物模型表明,ES细胞衍生的移植心脏细胞改善心脏功能和生存 6, 7]。然而,人类胚胎干细胞的建立和使用仍有争议的道德和法律依据,因为胚胎干细胞的起源以及担心免疫排斥反应或需要细胞移植后免疫抑制药物 8]。

老鼠和人类诱导多能干细胞(iPS)细胞是人为建立类似胚胎干细胞的多能干细胞( 9- - - - - - 16]。“诱导多能性”细胞类似于胚胎干细胞的形态、增殖能力,表面抗原、基因表达,多能干细胞特异性基因的表观遗传状态,和端粒酶活性。此外,老鼠“诱导多能性”细胞表现出生殖系贡献和四倍体互补,这是最理想的干细胞特征( 10, 13, 17]。人类“诱导多能性”细胞最初来自成人皮肤成纤维细胞的基因转移四个转录因子( Oct3/4, Sox2, Klf4, 原癌基因);然而,最近的证据表明,一些其他类型的体细胞可用于生成“诱导多能性”细胞有或没有残余转基因( 18]。因为“诱导多能性”细胞很容易产生人类体细胞和几乎相同的潜在的胚胎干细胞,它应该可以开发“诱导多能性”细胞衍生心脏肌细胞移植作为一种治疗心脏衰竭的,没有道德问题或免疫排斥与胚胎干细胞的使用。

因此,“诱导多能性”细胞被认为是干细胞疗法的有力候选人,期望他们的使用可能会解决很多剩余挑战心脏再生医学目前有一个非常严重的心脏疾病的预后不良。虽然形态学、生长特性和多能性的“诱导多能性”细胞被认为是类似于胚胎干细胞,目前尚不清楚每一个iPS细胞系都有相似的性质和适用于心脏再生医学。在目前的研究中,我们使用了良好的诱导多能干细胞Fbx15 Nanog。Fbx15-iPS细胞是第一个报道iPS细胞系,他们表现出类似的形态、增殖,和畸胎瘤形成胚胎干细胞,虽然他们不表现出雄性生殖能力( 9]。随后Nanog-iPS细胞生成的克服这些问题,和这个细胞株展览成功传输通过下一代的生殖系 13]。因此,在目前的研究中,我们使用Fbx15-iPS细胞一样劣质“诱导多能性”细胞和Nanog-iPS细胞高质量的“诱导多能性”细胞。当前关注的细胞移植治疗使用“诱导多能性”细胞的重点是“诱导多能性”细胞衍生细胞的移植后肿瘤形成。具体来说,存在残余转基因“诱导多能性”细胞的分化细胞和污染的分化细胞内关注。然而,很少有试图澄清是否分化心肌细胞的各种类型的展览“诱导多能性”细胞正常功能和/或相同功能的ES细胞衍生心肌细胞。意识到潜在的“诱导多能性”细胞再生医学用于治疗各种心脏疾病,我们需要确定最佳类型的“诱导多能性”细胞。因此,本研究的目的是(1)阐明心肌细胞分化潜能的差异在几个鼠标诱导多能干细胞和(2)执行一个心肌细胞的分子特征源自不同的诱导多能干细胞。

 2。材料和方法 2.1。小鼠ES和“诱导多能性”细胞

小鼠胚胎干细胞(EB3)从实验室获得多能细胞的研究,日本发育生物学中心。鼠标iPS细胞(iPS-MEF-Ng-20D17 38 c2, 38 d2, iPS-TTF-Fbx-WT-1,和4 - 3)获得“诱导多能性”细胞中心的研究和应用,京都大学,并按照指南用于推导利用人类胚胎干细胞的教育,文化,体育,科学和技术,日本。Nanog-iPS Fbx15-iPS, ES细胞之间的特征被用来比较不同的诱导多能干细胞和胚胎干细胞。介绍了生成Fbx15-iPS细胞,转基因逆转录病毒携带向小鼠的尾巴尖成纤维细胞 Oct3/4(也称为 Pou5f1), Sox2, Klf4, 原癌基因。随后,Fbx15-iPS细胞殖民地被天生的选择 Fbx15(也称为 Fbxo15)表达、选择标记基因被撞倒在先天Fbx15启动子( 9]。生成Nanog-iPS细胞,转基因是引入胚胎成纤维细胞的细菌人工染色体(BAC)转基因小鼠逆转录病毒携带 Oct3/4, Sox2, Klf4, 原癌基因。随后,Nanog-iPS Nanog启动子的激活细胞被选中,选择标记基因的插入Nanog子下成立的BAC转基因( 13]。我们证实了“诱导多能性”细胞表现出典型的ES细胞样的特性和所有细胞形态相似,和碱性磷酸酶(ALP)染色,未分化的细胞标记,显示强劲高山表达式,Nanog-iPS, Fbx15-iPS细胞。

 2.2。维护小鼠ES和“诱导多能性”细胞

小鼠ES和iPS细胞保持gelatin-coated菜肴在格拉斯哥最低基本培养基(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)补充10%胎牛血清(的边后卫;Equitech-Bio Inc, Kerrville TX), 0.1毫米的最低基本培养基(MEM)不必要的氨基酸溶液(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼),2毫米 l谷氨酰胺(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州),0.1毫米 β 巯基乙醇(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州),和2000 U /毫升小鼠白血病抑制因子(生活;微孔,Billerica, MA)。Fbx15-iPS细胞在小鼠胚胎成纤维细胞在杜尔贝科的修改维护鹰的介质(生活技术,大岛,纽约)补充10%的边后卫(Equitech-Bio公司、Kerrville TX), 0.1毫米MEM非必需氨基酸溶液(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼),2毫米 l谷氨酰胺(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州),0.1毫米 β 巯基乙醇(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州),和2000 U /毫升小鼠生活(微孔、Billerica MA)。

 2.3。分化小鼠ES和iPS细胞衍生的心肌细胞

小鼠ES和iPS细胞收获0.25% trypsin-EDTA和分离。四百个细胞被用来形成一个EB悬滴 α 修改鹰的介质( α MEM;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)补充10%的边后卫(Equitech-Bio公司、Kerrville TX)。第二天,EBs转移到浮动与新媒体文化板块。然后,分化后4 - 5天,浮动EBs被转移到附件的文化。通常,跳动的细胞出现在第七天。

 2.4。Immunofluorescent染色

细胞与4%多聚甲醛固定磷酸盐(pH值7.0)20分钟。随后,细胞permeabilized Triton x - 100 0.2% (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)在室温下10分钟,然后孵化与主抗体在一夜之间在4°C。细胞被洗Tris-buffered盐水含有0.1% Tween-20四次孵化前的二次抗体室温30分钟。本研究中使用的主要抗体鼠单克隆抗 α - - - - - - 辅肌动蛋白(1:200稀释;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)和anti-myosin重链(MF20;1:100;杂种细胞发育研究银行),山羊多克隆抗 Nkx2.5(1:50;圣克鲁斯生物技术)和反 GATA4(1:50;圣克鲁斯生物技术)和兔多克隆anti-ANP (1: 200;凤凰制药)。细胞被孵化dye-conjugated二次荧光标记抗体在室温下为30分钟。核染色后4′,6′-diamidino-2-phenylindole(生活技术,大岛,纽约),荧光显微镜下观察荧光信号(IX71;奥林巴斯、日本)。

 2.5。总RNA提取,互补脱氧核糖核酸的合成,实时PCR

从组织总RNA制备,使用拟胚体等基因(日本基因,日本)根据制造商的指示。污染基因组DNA被RNase-Free退化DNase我(生活技术,大岛,纽约)37°C为30分钟。治疗后,DNase灭活了phenol-chloroform提取和乙醇沉淀。我们总rna反向转录到cDNA使用益生元- (dT) 12 - 18底漆(上标2 RT设备;生命技术、大岛,纽约)。如前所述执行rt - pcr ( 19]。目标基因的引物和探针混合物的姓名和身份证号(应用生物系统公司)表1给出了补充,网上 http://dx.doi.org/10.1155/2013/659739。

 2.6。电生理学

电生理研究使用显微镜进行配备录音室和一个无噪声的加热板(Microwarm板;Kitazato供应)。玫瑰(10更易/ L)被添加到培养基灌注液的pH值维持在7.5 - -7.6。标准玻璃微电极的直流电阻25 - 35米 Ω 当装满吸管解决方案(2摩尔/ L氯化钾)。电极定位使用电机驱动的显微操纵器(EMM-3SV;Narishige、日本)光学控制。自发地跳动的细胞被选为目标,和目标细胞的动作电位记录。录音吸管是连接到一个膜片钳放大器(Axopatch 200 b;轴突仪器);信号通过低通滤波器的截止频率2 kHz和数字化与a / D转换器的采样频率10 kHz (Digidata 1440;轴突的仪器)。信号监测,记录为电子文件,并分析了离线pCLAMP 10软件(轴突仪器)。

 2.7。领域潜在的录音使用片上系统

意味着芯片获得的多信道系统(德国)和被涂上一层纤连蛋白(F1141 Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)。击败EBs上镀电极和孵化在37°C在湿润的气氛中95%的空气和5%的有限公司2。MEA进行测量在37°C。最初的信号处理,随后分析了获得的数据与MC_Rack(多通道系统)。数据分析提取从马克2分钟到5分钟的录音。异丙肾上腺素和维拉帕米(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)被溶解在蒸馏水为0.1,1,10毫米,10 μ股票的解决方案。这些股票的解决方案在培养基稀释至所需浓度,并将其应用于测试芯片。药物化验的协议如下:测试芯片上的介质交换新鲜培养基,潜力和现场记录5分钟。随后,该药物是用于测试芯片,5 - 10分钟后孵化,场电位测量。

 2.8。统计分析

结果报告的意思 ± 扫描电镜。学生的 t以及用于评估不同的意义。 P < 0.05 被认为是显著的。

 3所示。结果 3.1。Fbx15-iPS细胞表现出明显的残余转基因表达

评估ES的分子特性、Nanog-iPS和Fbx15-iPS细胞,四个内生和外生的表达(转基因)转录因子被半定量rt - pcr检测。结果显示类似的四个内生转录因子的表达,Nanog-iPS, Fbx-iPS细胞。两个独立的Fbx-iPS细胞系,即WT-1 4 - 3,显示剩余转基因表达。四个转基因的表达显著低于三个独立Nanog-iPS细胞系(即。,20 d17, 38 c2,比Fbx15-iPS细胞(图38 d2) 1)。其中两个Nanog-iPS细胞系,即20 d17和38 d2,显示原癌基因转基因表达,而Nanog-iPS细胞系38 c2显示Klf4转基因表达。不同表情的剩余三Nanog-iPS观察转基因细胞系,并没有统一的模式“诱导多能性”细胞的转基因表达。这些发现表明,逆转录病毒转基因表达在很大程度上是沉默Nanog-iPS细胞与Fbx 15-iPS细胞,转基因沉默的程度不同Nanog-iPS细胞系。人们普遍认为部分重组“诱导多能性”细胞表达病毒转基因和内源性多能性基因,和full-reprogrammed iPS细胞内源性基因的病毒转基因沉默维持多能性状态( 20.]。因此,逆转录病毒载体沉默可以作为“诱导多能性”细胞的质量指标和高质量的“诱导多能性”细胞转基因沉默和劣质“诱导多能性”细胞表达转基因。

内源性多能未分化的多能细胞的基因和转基因表达谱。四个转录因子的表达水平。半定量rt - pcr分析内生多能干细胞转录因子和转基因。

 3.2。Nanog-iPS效率比Fbx15-iPS细胞细胞表现出更大的打击

检查心脏分化的效率差异,传统的悬滴法被用来诱导自发跳动(EBs),拟胚体含有丰富的心肌细胞的人口。击败EBs的效率从ES与心肌细胞分化,诱导多能干细胞,可以好标记心肌细胞分化效率( 5, 21]。大约6 - 7天EB形成后,殴打EBs开始出现在胚胎干细胞和所有Nanog-iPS细胞系。然而,花了更长的时间Fbx15-iPS细胞系分化成打EBs(图 2(一个))。此外,击败EBs的发生率显著低于Fbx15-iPS细胞系。有趣的是,击败三Nanog-iPS细胞系评估效率之间的不同。具体来说,击败EBs的发病率明显高于20 d17和38 d2 Nanog-iPS细胞系比38 c2 Nanog-iPS细胞系和Fbx15-iPS细胞系,尽管击败EBs的发病率仍显著低于ES细胞。之间没有明显差异38 c2 Nanog-iPS细胞系和Fbx15-iPS细胞系后12天,虽然有不同的时间自发跳动在38 c2 Nanog-iPS细胞系和Fbx15-iPS细胞株。这些结果表明,有心脏分化的效率上的差异以及在心脏分化所需的时间,个人之间的诱导多能干细胞。

心肌细胞分化多能干细胞的效率和时间在心肌细胞分化的基因表达模式。(a)的百分比超过殖民地在6 - 15天小鼠胚胎干细胞(ES)细胞,Nanog诱导多能干细胞(iPS)细胞,Fbx15-iPS细胞。数据的平均 ± 扫描电镜( n = 5 在所有的组)。((b) - (g))定量rt - pcr分析显示时序基因表达模式的中胚层Brachyury标志 T (b),早期心脏中胚层的标记 Mesp1心脏转录因子(c) Nkx2.5(d)和 Gata4(e)和心脏的蛋白质 Nppa(f)和 Myl2(g)在EB3 ES细胞(封闭广场),20 d17 Nanog-iPS细胞(圆圈),和WT-1 Fbx15-iPS细胞(开放的三角形)。数据的平均 ± 扫描电镜( n = 5 在所有的组)。

 3.3。中胚层和心脏标记基因的表达显著降低,推迟Fbx15-iPS细胞

Fbx15-iPS细胞表达转基因和心脏的表现出较低的效率比西文和Nanog-iPS细胞分化。来确定哪些步骤是阻碍Fbx15-iPS心脏分化过程中细胞的多能干细胞,我们评估时间心肌细胞分化过程中基因表达的模式。时间的表达 Brachyury T中胚层的标记,类似于西文和Nanog-iPS细胞。相比之下, Brachyury T表达显著延迟Fbx15-iPS细胞,这表明这些细胞倾向于抵制中胚层分化(图 2 (b))。的表达 Mesp1最早的心脏命运标记之一,是暂时性的调节在天3和5 ES和Nanog-iPS细胞;然而, Mesp1表达显著延迟Fbx15-iPS细胞(图 2 (c))。的心脏基因,我们评估心脏转录因子的表达 Nkx2.5和 Gata4以及心脏的基因 利钠肽A型(Nppa)和 肌球蛋白轻chain-2v (Myl2)。所有心脏基因,有倾向于表达在胚胎干细胞被发现,最高最低的(延迟)表达在Fbx15-iPS细胞(数字 2 (d)- - - - - - 2 (g))。这些数据表明,Fbx15-iPS细胞表现出抗中胚层分化和心脏。

 3.4。纯化Fbx15-iPS细胞衍生心肌细胞保留残余转基因表达

如上所述,Fbx15-iPS细胞继续表达残余转基因和有减毒心脏分化效率。尽管如此,跳动的心肌细胞取自Fbx15-iPS细胞。这可能是由于异构Fbx15-iPS细胞群:尽管存在transgene-positive iPS细胞分化、抗transgene-negative iPS细胞能够分化成心肌细胞。确定Fbx15-iPS细胞衍生心肌细胞分化后表达转基因,我们纯化心肌细胞使用tetramethylrhodamine甲酯(TMRM)荧光染料法( 22]。令人惊讶的是,即使在净化Fbx15-iPS细胞衍生心肌细胞,剩余转基因的表达仍然相对较高(图 3)。此外,在三个Nanog-iPS细胞系中,38 c2细胞被发现Klf4残留转基因的低水平的表达。这些数据表明,transgene-positive iPS细胞可以分化成心肌细胞,而转基因仍然心脏分化后表达。在一起,Fbx15-iPS细胞系的观察心脏分化效率很低,38 c2 Nanog-iPS细胞系击败效率低于其他Nanog-iPS细胞系建议剩余的表达 Klf4转基因对心肌细胞分化可能有负面影响。此外,相对较高的表达部分沉默逆转录病毒转基因或许可以解释在心肌细胞分化的效率的差异,Nanog-iPS, Fbx15-iPS细胞。

转基因的表达谱纯化心肌细胞来源于Nanog和Fbx15诱导多能干细胞(iPS)细胞。心肌细胞总RNA分离纯化来源于小鼠胚胎干细胞(ES)细胞,三个Nanog-iPS细胞克隆(20 d17 38 c2,和38 d2),两个Fbx15-iPS细胞克隆(WT-1和4 - 3),未分化细胞Fbx15-iPS,鼠标的心。rt - pcr分析,以确定的转基因表达四个转录因子( Oct3/4, Sox2, Klf4, 原癌基因),GAPDH作为内部控制。

 3.5。心脏标记基因表达“诱导多能性”细胞衍生的心肌细胞

因为“诱导多能性”细胞衍生心肌细胞继续各级表达转基因,半定量rt - pcr和免疫染色是用来评估心脏基因的表达,Nanog-iPS, Fbx15-iPS细胞衍生心肌细胞。如图 4(一)rt - pcr分析显示适当的各种心脏标记基因的表达,包括 α 肌球蛋白重链( Myh6), β 肌球蛋白重链( Myh7), 肌球蛋白轻chain-2a( Myl7), Myl2, α -sarcomeric辅肌动蛋白( Actn1), 利钠肽B型( Nppb)。免疫荧光分析显示,ES和iPS细胞衍生心肌细胞表现出典型的肌节形成基于与抗体针对阳性染色 α 辅肌动蛋白和肌球蛋白重链(MHC),适当的核心脏转录因子的表达 Nkx2.5和 GATA4,心房利钠肽(ANP)的存在在原子核周围的分泌颗粒(图 4 (b))。

心肌细胞(CM)特定的基因表达谱,通过rt - pcr和免疫染色,确定厘米来自老鼠的胚胎干细胞(ES)细胞,Nanog诱导多能干细胞(iPS)细胞,Fbx15-iPS细胞。(一)CM-associated结构蛋白基因表达谱。的表达 Actn1, Myh6, Myh7, Myl7, Myl2, Nppb分析了半定量rt - pcr分析。GAPDH是作为内部控制。(b) Immunofluorescent染色的典型CM-specific蛋白质在15天的区别在CM中来自ES, Nanog-iPS, Fbx15-iPS细胞。细胞被沾 Nkx2.5(绿色), GATA4(绿色)、心房利钠肽( ANP;绿色),肌凝蛋白重链( MHC;红色), α - - - - - - 辅肌动蛋白(红色)。比例尺= 50 μm。

 3.6。心肌细胞电生理的正常功能性质的“诱导多能性”细胞来源

因为“诱导多能性”细胞衍生心肌细胞继续各级表达转基因,我们记录了“诱导多能性”细胞衍生心肌细胞的动作电位用玻璃微电极来形容“诱导多能性”细胞衍生心肌细胞的电生理特性。ES细胞衍生心肌细胞被用作控制。天20击败殖民地被选中,分散成小集群和单个细胞。像起搏器、atrial-like和胎儿ventricular-type心肌细胞动作电位记录在ES和iPS细胞来源(数字 5(一个)- - - - - - 5 (c))[ 23, 24]。Nanog-iPS和Fbx15-iPS细胞衍生心肌细胞表现出适当的像起搏器,atrial-like,胎儿ventricular-type动作电位。

心肌细胞电生理的研究(CM)来自老鼠胚胎干细胞(ES)细胞,Nanog诱导多能干细胞(iPS)细胞,Fbx15-iPS细胞。代表动作电位(a) ES细胞衍生的厘米,(b) Nanog-iPS细胞衍生厘米,和(c) Fbx15-iPS细胞衍生厘米显示窦上(上),胎儿atrial-type(中间)和胎儿ventricular-type(底部)动作电位。

ES-CM

Nanog-iPS厘米(20 d17)

Fbx-iPS厘米(WT-1)

 3.7。“诱导多能性”细胞衍生心肌细胞的正常变时性反应

我们下一个试图确定“诱导多能性”细胞衍生心肌细胞是否能够得心应手地应付各种药理干预措施。为此,击败EBs镀在多级阵列(MEA)板,和细胞外的心电图记录从几个电极下击败EBs殴打EBs的接触 β 肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素(数字 6(一)- 6(d))和l型钙通道阻断剂维拉帕米(数字 6(e) - 6(h))。异丙肾上腺素剂量依赖性增加“诱导多能性”细胞衍生的自发的跳动频率心肌细胞(图 6(d))。心肌细胞的跳动频率Nanog-iPS细胞来源从1.1提高 ± 0.1到1.6 ± 0.2赫兹在500 nM的缺失和存在异丙肾上腺素,分别为( n = 3 ; P < 0.01 ),而Fbx15-iPS细胞衍生心肌细胞从0.5提高 ± 0.1到1.1 ± 0.5赫兹( n = 3 ; P < 0.01 )。也观察到类似的反应在ES细胞衍生心肌细胞(图500海里异丙肾上腺素 6(d))。相比之下,维拉帕米剂量依赖性降低自发跳动的频率(图 6(h))。心肌细胞的跳动频率Nanog-iPS细胞来源从1.5降低 ± 0.3到1.1 ± 0.1赫兹在1000 nM的缺失和存在维拉帕米,分别为( n = 3 ; P < 0.01 ),而Fbx15-iPS细胞来源从0.6心肌细胞减少 ± 0.1到0.4 ± 0.1赫兹( n = 3 ; P < 0.01 )。也观察到类似的反应在ES细胞衍生心肌细胞(图1000海里维拉帕米 6(h))。这些实验证明Nanog-iPS和Fbx15-iPS细胞衍生心肌细胞正常变时性反应。

药理研究心肌细胞(CM)来自老鼠胚胎干细胞(ES)细胞,Nanog诱导多能干细胞(iPS)细胞,Fbx15-iPS细胞。((一)- (c))多级阵列(MEA)录音在CM中来自ES (a), Nanog-iPS (b),和Fbx15-iPS细胞(c)显示变时性反应增加剂量的异丙肾上腺素。(d)的积极总结变时性的异丙肾上腺素引起的变化。数据的平均 ± 扫描电镜。* P < 0.05 和* * P < 0.01 相比之下,0毫米异丙肾上腺素。((e) - (g))是录音的负变时性反应增加剂量的维拉帕米在CM中来自ES (d), Nanog-iPS (e)和Fbx15-iPS细胞(f)。(h)引起的负变时性的变动汇总表维拉帕米。数据的平均 ± 扫描电镜。* P < 0.05 和* * P < 0.01 相比之下,0毫米维拉帕米。

 4所示。讨论

最近的一次突破多能干细胞技术开辟了的可能性在特定的干细胞疗法中使用“诱导多能性”细胞。以来的第一份报告从高桥和山中,许多贡献了这个新兴领域 9]。许多运载系统的重组转录因子可用于生成“诱导多能性”细胞( 9- - - - - - 12, 25- - - - - - 31日]。此外,各种组织可以用来生成“诱导多能性”细胞,包括胚胎成纤维细胞,成人真皮成纤维细胞,肝细胞,胃癌细胞、神经干细胞,脂肪干细胞和造血干/祖细胞( 14, 32- - - - - - 36]。分子特征和个别诱导多能干细胞的质量可能有所不同取决于所使用的重组战略和细胞的起源,它重要的是要确定这些差异在这些细胞的临床应用( 21, 37- - - - - - 39]。

在最近的研究中,我们使用了Nanog-iPS细胞和Fbx15-iPS细胞。我们观察到许多不同的角色在这些iPS细胞(补充表2)。最初的“诱导多能性”细胞集落生成的时间也可能影响质量的“诱导多能性”细胞的转基因沉默,染色体稳定性和生殖系的贡献( 40]。他们所产生的类似的协议,但精确的计时iPS细胞一代可能不同,这可能会影响“诱导多能性”细胞的质量。“诱导多能性”细胞衍生的心肌细胞表现出典型的心脏表型,包括心脏转录因子的表达和蛋白质,以及典型的电生理特性。虽然“诱导多能性”细胞衍生心肌细胞的结构和功能性质相似,Nanog-iPS之间有明显的差异和Fbx15-iPS细胞的自发击败效率和颞心脏转录因子的表达和蛋白质。因为大量的成熟的心脏细胞需要心脏再生医学,最好使用高质量的“诱导多能性”细胞(本研究Nanog-iPS细胞)。Fbx15-iPS细胞保留残余转基因表达,甚至经过净化的Fbx15-iPS细胞衍生心肌细胞,剩余转基因的表达仍然相对较高。目前尚不清楚残留转基因表达是否会直接影响到心脏分化效率和如果转基因在低质量的“诱导多能性”细胞的抑制会增加心脏分化效率。还有另一种可能性,剩余转基因表达只是一个低质量的标志“诱导多能性”细胞,和低质量的“诱导多能性”细胞显示心脏分化效率低。此外,移植后肿瘤形成的风险仍然存在这样的细胞,和残余转基因的表达可能会妨碍正常心肌细胞功能。

 5。结论

未来临床应用之前这些细胞在心脏再生医学,必须“诱导多能性”细胞,将用于再生疗法可以产生足够数量的心肌细胞以最小的风险。本研究的结果提出了安全隐患对诱导多能干细胞的选择和推进这些细胞进入临床实践在未来。

 披露的信息

Tomofumi田中和Fumiyuki服部年宏是生物医学研究实验室的员工,Asubio制药有限公司,有限公司,日本。

 确认

本研究从教育部支持的研究经费,科学和文化,日本,Shinsuke汤和Keiichi福田。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。

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