醛葡聚糖和ε保利(赖氨酸)水凝胶作为病毒的基因载体

文摘

背景。表达的基因转染的细胞需要属于为了使基因治疗临床效果。转染基因的控释可以利用。新型生物可降解水凝胶材料由20 w / w %醛葡聚糖和10 w / w %ε保利(赖氨酸)(ald-dex /锁相环)。我们检查它是否可以作为病毒的基因转移载体。方法。一个质粒(Lac-Z)混合ald-dex /锁相环。一个在体外研究进行了评估的表达与半乳糖苷Lac-Z染色后基因转移到培养293细胞和骨髓细胞。作为一个对照组,锁相环是用作阳离子聚合物。结果。我们确认的转染效率ald-dex /锁相环在293个细胞转染效率高于锁相环(2的质粒μg: ald-dex /锁相环1.1%,锁相环0.23%,质粒的16μg: ald-dex /锁相环1.23%,锁相环0.48%)。在骨髓细胞,我们确认的表达Lac-Z通过改变数量的醛葡聚糖。在团体使用ald-dextran锁相环的1/4和1/12的数量,分别转染效率是0.43%和0.41%。结论。本研究提出了一个潜在的使用ald-dex /锁相环作为基因转移的非承运人。

1。介绍

最近,许多关于基因治疗的研究已发表。基因治疗的成果之一是安全有效的基因在体内的表达。裸DNA疫苗是安全的,但迅速被核酸酶降解,它显示了一个可怜的细胞吸收。基因治疗的成功很大程度上依赖于基因传递向量(1,2]。虽然病毒载体具有良好的传输效率,随之而来的免疫原性副作用不是可以忽略不计。另一方面,安全的优点病毒的携带者包括一个DNA引入:细胞的能力,avoidability整合到染色体,缺乏感染风险,费用可能比病毒载体更低的成本。然而,病毒携带者显示贫穷传输效率比病毒载体(3]。因此,病毒基因载体等阳离子聚合物(4],阳离子脂质(5)和多糖(6)已经发展为了改善这种弱点(1]。

一种阳离子聚合物和脂质形成配合物与DNA之间的静电相互作用带正电荷的聚阳离子胺和带负电荷的磷酸基的DNA。DNA可以浓缩成一个相对较小的大小通过离子相互作用、基因转移是非常重要的,因为一个小尺寸有利于细胞吸收(4,7]。此外,复合物之间的交互和带负电荷的细胞的细胞膜可以增强DNA吸收(3]。这些有助于提高转染效率。

最近,各种材料调查作为交付向量的质粒DNA。阳离子聚合物,聚赖氨酸(PLL)是一个著名的可生物降解的nonantigenic病毒的基因载体。然而,它是有毒的,往往是非绑定到所有哺乳动物细胞表面(8]。因此,有关修改锁相环为了安全有效的病毒基因载体(9]。此外,表达的基因转染的细胞需要足够长的时间以使基因治疗临床效果。转染基因的控释技术是利用延长表达术语通过控制基因的表达水平和术语。直到现在,各种控释技术的基因已报告(10- - - - - -13]。最近,一种新型self-biodegradable一类水凝胶材料了。它是由混合醛葡聚糖ε锁相环(ald-dex /锁相环)。混合后形成凝胶,可以控制降解速度通过改变浓度的乙酸酐在锁相环14]。这些特征可用于控制释放的基因,由于锁相环可以结合DNA。

进一步指出,间充质干细胞(msc)具有较高的增殖和分化的潜力。生长因子刺激和诱导msc分化是不可或缺的msc分化成所需的细胞(15]。建立基因转移msc增强基因治疗和组织工程技术使用msc [16]。在这项研究中,我们使用了ald-dex /锁相环将基因转移到msc,检查它是否可以作为病毒的基因基因转移的载体在体外。

2。材料和方法

病毒的基因转移载体,10 w / w %锁相环(Mw = 4000)也包含2 w / w %乙酸酐和20 w / w % ald-dex (Mw = 75 KDa)这是准备通过引入醛基为右旋糖酐的氧化剂。

质粒DNA名叫pCAGGS-lacZ造成的细胞质表达大肠杆菌β使用牛乳糖。质粒载体是生长在大肠杆菌DH5α和准备试剂盒质粒Giga工具包(试剂盒GmbH是一家现代化、希尔登,德国)根据制造商的指示。验证身份和纯度的质粒向量,琼脂糖凝胶电泳后进行限制性内切核酸酶消化。质粒浓度确定使用紫外/可见分光光度计(du - 530,贝克曼,富勒顿、钙、美国)。

评估的影响转染哺乳动物细胞,细胞从日本获得银行293年(日本筑波)和正常大鼠骨髓细胞从豆类生物获得日本。这些细胞被维护在含5%胎牛血清的DMEM(的边后卫)和青霉素和链霉素(PS)。细胞培养生长在37°C在湿润的气氛中95%的空气和5%的有限公司₂。在融合,1.4×10⁵每口井的细胞受移植者到12孔板和孵化24小时。

案例包括293个细胞使用相同数量的ald-dex和锁相环与质粒DNA在DMEM混合,同时控制与质粒DNA在DMEM只有锁相环使用。质粒DNA的浓度是2μg和16μ分别g。一夜之间都在25°C的环境。文化的骨髓细胞,ald-dex金额的1/1,1/4和1/12的锁相环和锁相环与质粒DNA(混合浓度:2μg)在一夜之间在DMEM和孵化25°C。

细胞汇合的约80%后,改变了媒介与PS DMEM补充没有的边后卫。配合物应用的解决方案和孵化37°C在湿润的气氛中95%的空气和5%的有限公司₂为24小时。293年文化的细胞,只有质粒应用控制。转染24小时后,介质改为一个包含的边后卫的新媒介。另一个24小时后,半乳糖苷进行染色检查转染效率。这些细胞被固定5分钟磷酸盐(PBS)含2%甲醛在室温和0.2%戊二醛。他们随后用PBS和彩色2小时在5-bromo-4-chloro-3-indolyl - 37°Cβ-D-galactopyranoside(半乳糖苷)染色溶液含有1毫克/毫升半乳糖苷,MgCl2 2毫米,5毫米,K3Fe (CN) 6和5毫米K4Fe (CN) 6·3 h2o PBS (pH值7.4)。实验重复三次,除了实验只使用锁相环,重复四次。

3所示。结果与讨论

Ald-dex /锁相环水凝胶是由席夫碱和氧化之间形成醛葡聚糖和锁相环14]。化学结构和交联是显示在图1。锁相环有足够数量的一级胺与正电荷与带负电荷的磷酸基的DNA。锁相环/ DNA复合物有更高的趋势形成沉淀(1,17]。以前的研究报道,锁相环已经修改的亲水右旋糖酐反应还原胺化氨基酸组之间的锁相环和还原的右旋糖酐为了增加锁相环/ DNA复合物的溶解水媒体。葡聚糖链请勿打扰锁相环和DNA之间的静电相互作用[17]。ald-dex /锁相环和质粒DNA的模式复杂图所示1。复合物与带负电荷的细胞膜,通过内吞作用进入细胞(1]。

在293个细胞,第二天lacZ基因转移后,我们发现,半乳糖苷阳性细胞存在于所有期望只接收转染质粒转染(图2)。与2组μ质粒,转染效率的锁相环和ald-dex /锁相环达到%,分别为% (对锁相环)。与16组μ质粒,转染效率的锁相环和ald-dex /锁相环达到%,%,分别()。这些证明ald-dex /锁相环水凝胶可以作为基因载体。更高的转染效率可以通过使用ald-dex /锁相环相比,仅使用锁相环。

随后,我们完成了msc存在于骨髓细胞基因转移。骨髓细胞,半乳糖苷阳性细胞组中并没有使用相同数量的ald-dex和锁相环,而特定的细胞存在于其他组织(图3)。转染效率的组织使用ald-dex 1/4和1/12的锁相环%,分别为()。这项研究证明了一个基因移植到msc的可行性通过减少的ald-dex ald-dex /锁相环。早期研究表明,移植的程度和接枝链的长度有影响在一个复杂的物理化学性质的DNA。PLL-graft-dextran共聚物接枝度较低或较短的葡聚糖链可以坚定地互动与DNA和浓缩DNA (17]。同意我们的发现。此外,据报道,锁相环接枝共聚物显示细胞特定的多糖链可以执行细胞特定的交付和表达外源基因在活的有机体内(18]。本研究发现不同的结果在293细胞和msc、自吸收的复合物在细胞与细胞特异性。

小说一类self-biodegradable生物水凝胶,ald-dex /锁相环,这可以通过在体内水解降解。ald-dex /锁相环的有利特征包括高粘接强度、高灵活性、低细胞毒性。此外,水凝胶形成的起始时间可以控制通过改变醛的量引入右旋糖酐。的在体外水凝胶的降解速度也可以通过改变乙酸酐浓度锁相环控制的解决方案(14]。

再生疗法的目的是诱导修复有缺陷的组织基于自然疗法潜在的病人。应该使用生长因子和/或增强细胞增殖和分化的基因。释放技术使这一切成为可能是必不可少的。控制释放生长因子和基因的成功依赖于公司的生长因子和/或基因与适当的运营商。在适当的公司与运营商、生长因子和/或基因是防止体内蛋白质水解,因此活动时间可以延长19]。

这项研究证实了基因传递的可行性使用小说self-biodegradable水凝胶。ald-dex /锁相环水凝胶显示可能被用作病毒载体控释。临床上,ald-dex /锁相环结合质粒DNA可以应用到受伤的组织提高组织愈合和再生。因此,ald-dex /锁相环结合BMP-2编码质粒可用于缺陷来提高骨再生的骨折的骨头。此外,ald-dex /锁相环水凝胶已被用作外科密封胶(20.]。如果ald-dex /锁相环结合生长因子或基因作为外科密封剂,治愈伤口的新技术将成为有效和可行的。

4所示。结论

我们的研究结果表明潜在的基因治疗使用ald-dex /锁相环水凝胶作为病毒的载体。此外,self-biodegradability的降解速度和控制ald-dex /锁相环水凝胶表示未来应用发布技术。

引用

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