3D牛椎间盘器官培养系统注入人间充质干细胞的生长和分化因子5的非病毒基因传递

摘要

椎间盘（IVD）细胞疗法与无条件的2D膨胀间充质干细胞（MSC）是一个有前途的概念，但却具有挑战性。通过电穿孔介导的基因转移的生长和分化因子5（GDF5）的非血流基因递送MSC的分化可能是细胞移植的优异源。从骨髓吸气中收获人体MSCs，并通过体外电穿孔。转染细胞在1.2%海藻酸钠珠培养中作为单层培养物和3D培养物培养。MSC高效表达GDF5长达21天。与未转染细胞相比，GDF5基因转移和海藻酸钠中3D培养的组合显示聚集蛋白聚糖和SOX9（软骨形成的两个标记）的上调，以及KRT19作为椎间盘形成的标记。海藻酸钠包裹的细胞产生更多的蛋白多糖，以GAG/DNA比率表达。此外，将GDF5转染的MCS注射到IVD木瓜蛋白酶变性器官培养模型中，7天后显示GAG/DNA比率部分恢复。在这项研究中，我们证明了GDF5转染的MSC作为椎间盘再生临床翻译的一种有希望的方法的潜力。

1.介绍

非病毒基因传递对于刺激细胞在广泛的肌肉骨骼疾病中的直接潜在临床应用非常有意义。为了修复和再生脊柱椎间盘，需要细胞与椎间盘（IVD）中的自然群体相匹配位于椎间盘中心的髓核细胞和纤维环细胞（位于IVD“小生境”中）很难在实验室复制，因为识别这些细胞的独特标记尚不清楚[1-4.］.IVD Niche定义为低pH，非常致密的细胞外基质，由胶原蛋白和糖胺聚糖组成，例如聚集体和相对低细胞性[5.那6.]；因此，椎间盘环境对植入细胞（如MSCs）造成了重大挑战。如果要将细胞移植到复杂的生态位（如IVD）中，一种策略是用某种特殊的生长因子（GF）鸡尾酒对细胞进行预处理，IVD由高度专业化和完全适应的天然细胞群填充（尚不清楚）或通过额外的机械刺激[7.]毫无疑问，骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）已被提出用于肌肉骨骼研究的许多领域，因为它们相对容易分离，具有快速增殖，并具有分化为不同间充质组织的潜能[8.那9.］.但是，它们对临床应用的使用尚未确定，因为在重新植入患者之前需要安全限制和质量检查[10.那11.］.

目前的手术方法是摘除椎间盘(椎间盘切除术)并融合相邻椎体或在适当位置添加金属笼[12.］.生物疗法修复椎间盘是非常必要的。生长因子治疗被认为是一种很有前景的IVD再生方法。然而，向靶细胞的传递似乎受到阻碍，而且主要是未解决的，因为在临床研究中已经报道了BMP-2注射研究[13.].另一方面，使用水凝胶再生椎间盘中心的方法已被提出并研究了多次，结果一般，特别是在生物力学性能方面，以长期承受机械负荷[14.］.在尝试了基因转移迄今腺病毒的方法[方法15.那16.]已被广泛应用，其效率高，但在翻译研究的角度上尚未被广泛接受[17.］.生长和分化因子5（GDF5，顺式。BMP14或CDMP1）已被证明是推动初级的hMSC向椎间盘样表型的关键因素[18.那19.]，但它也被证实是椎间盘细胞的一种刺激和强大的再生因子体外[20.),在活的有机体内兔下腔静脉环扎变性模型的建立[21.］.对于腰痛GDF5至关重要进一步的证据来自人口为基础的研究，以确定单核苷酸多态性的连锁不平衡[22.]重组人rhGDF5目前正在一项随机II期临床试验中作为再生IVD的药物进行研究(http://www.clinicaltrials.gov/情况下NCT01124006）.然而，外源性注射GDF5是一种非常昂贵的治疗方法，并不是一种非常耐受性的方案，除非采用一种能够提供持续水平的技术来实现治疗效益。正如Carragee等人最近提出的，直接注射BMP2作为脊柱融合增强剂的情况下，药物传递到细胞的问题尚未解决[13.]因此，我们有兴趣通过电穿孔原代人骨髓间充质干细胞直接传递基因来测试非病毒基因治疗方法，并测试它们是否会通过过度表达GDF5分化为椎间盘样前体细胞体外电穿孔介导GDF5基因转移到原代hMSCs，并将其注射到椎间盘外植体模型中，以实现椎间盘再生。

2.材料和方法

2.1.电池来源和扩展

在书面同意后，人骨髓是从20-60岁的12岁的患者中获得的12名患者（表格）获得臀部或脊柱手术（表1)该程序由伯尔尼州道德办公室（KEK#187/10）批准。密度梯度离心后从单核细胞部分扩增人类间充质干细胞（hMSCs）（Histopaque-1077，Sigma-Aldrich，Buchs，Switzerland）通过选择1-2代塑料粘附。使用Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、低葡萄糖、谷氨酰胺和丙酮酸盐（含10%FBS，100%）扩增hMSCs μ.g / ml青霉素，100 ui / ml链霉素，2.5 ng / ml bfgf-2 [23.］.

２.２.间质CD标记物表达的hmsc特征

分离的人类间充质干细胞的表面标记物进行了表征。随机选择两个独立的MSC群体（2个不同的供体，患者59和60），并通过流式细胞术在FACS LSRII（BD Biosciences Inc.，比利时布鲁塞尔）上分析CD105、CD44、CD29、CD90和CD45（美国马萨诸塞州坎布里奇市Abcam）.将每个CD标记的结果与未染色细胞和同型对照进行比较。

2.3。细胞核折纸

选择载体的转染准备的质粒RG207105人cDNA ORF克隆的GDF5（NM_000557）。质粒含有CMV启动子和GDF5的​​融合蛋白，包括GFP标签（Origene Technologies Inc.，Rockville，MD，US）（图1）.在电穿孔之前，RG207105被扩增大肠杆菌根据氨苄西林（Sigma-Aldrich，St.Louis，USA）存在的阳性选择，并根据制造商（Qiagen Inc.，Basel，Switzerland）的使用QuiceSe Miniprep套件纯化。通过使用提供的DNA引物使用RG207105（MicroSyynth，Balgach，瑞士）的直接DNA测序来克切所引起的点突变的序列的累积的ORF。hMSCs were electrophoresed by Nucleofector technology (Amaxa, Lonza, Basel, Switzerland) using Lonza’s optimized protocol U-23 (the protocol C-17 revealed low transfection efficiency of ~10% transfected cells) and the mesenchymal stem cell Nucleofector solution (VPE-1001, Amaxa, Lonza Inc.), which provided a protective environment and allowed high transfection efficiency and cell viability. About 500k cells were transfected per reaction, centrifuged, resuspended in Nucleofector solution, and mixed with 2 μ.g的质粒DNA，按厂家说明。电脉冲结束后，将预热过的DMEM LG, 10%胎牛血清加入试管中，将细胞悬液播种到6孔或12孔板中。

２.４.Immunohistological染色

细胞单层生长进行染色用于细胞内GDF5的​​存在。转染的细胞在6孔板中接种于玻璃盖玻片并培养14天。然后将细胞最初固定在4％多聚甲醛（PFA）直接在6孔板中。然后将细胞温育在PBS中的0.1％吐温制成可渗透的。Cells were preincubated for 1 h with 1xPBS and 10% FCS to block the unspecific staining, washed, and then incubated with the primary rabbit polyclonal antibody (GeneTex, Ivine, CA, US, cat. Number GTX113580) against GDF5 at a dilution of 1 : 200 for 1 h. After thoroughly washing the cells the secondary red fluorescently labelled antibody (Abcam, ab6939) was amended at a dilution of 1 : 1000. The stained cells on the glass cover slip were mounted on a glass slide with 1 droplet of mounting medium for fluorescence with DAPI (Vectashield, H-1200, Reactolab, Servion, Switzerland). Images were taken with a fluorescence microscope AF 6000 LX from Leica (Wetzlar, Germany).

2．5．3 d藻朊酸盐文化

使用0.5％EDTA-ktpsin（Gibco，Life Technologies，Basel，Switzerland）后1周的单层培养（膨胀）后胰蛋白酶蛋白化。将细胞在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤，并以密度为2×10的藻酸盐接种^6.细胞/mL，用22g针头注射器压入。这个过程允许创建~30μ.L将海藻酸盐滴入溶液中形成的珠子 毫米CaCl₂解决方案。然后在没有地塞米松的情况下，在含丙酮酸、10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素(Gibco, Life Technologies, Invitrogen, Basel, Switzerland)的高葡萄糖DMEM GlutaMAX中培养细胞。在第7、14和21天将小珠快速冷冻，分析基因表达和GAG/DNA含量。

2.6。相关基因表达分析

对基因表达，直接裂解细胞或海藻酸盐微珠在液体N₂. 然后在液态氮下将珠子粉碎成粉末₂总RNA由TRI试剂(分子研究中心)用改良的TRIspin方法提取[24.].总RNA（100-200 使用基因特异性引物和探针进行逆转录（RT）和随后的PCR（RT-PCR）[25.那26.］.用Bio-rad逆转录试剂（Bio-rad，Glattbach，瑞士）进行逆转录。使用SYBR绿色技术对IQ-5 RT-PCR系统（Bio-Rad，Regach，瑞士）进行实时PCR。寡核苷酸引物（来自MicroSyyth，Balgach，瑞士）的偏爱灯塔设计师软件（Palo Biosoft Inc.，Palo Alto，CA，USA）设计了使用来自Genbank数据库的核苷酸序列（表2）.使用IQ-5循环器软件（Bio-Rad，Basel，瑞士）量化RT-PCR。在扩增的指数阶段中设定荧光的阈值，并且每个样品所需的PCR循环的数量被记录为C. C_T.价值观[27.］.基因表达通过ΔC进行定量分析_T.（：用户公告号2 ABI PRISM 7700序列检测系统，2001 Applied Biosystems公司），其正常化下使用相对定量法值_T.与管家基因（如核糖体18S）的基因表达相关的值。ΔΔC_T.然后，第七天的值将相对于第0天进行估计，并使用公式2-ΔC转换为相对mRNA值_T.[28.］.我们筛选了主要的合成代谢基因的相对基因表达：蛋白，胶原蛋白I，胶原II;和其他最近出版的IVD标记基因[2那18.那29.)(表2）.

2.7。呕吐/ DNA比

3个小珠或IVD组织在60°C下用125消化过夜从番木瓜乳胶（P-3125，Sigma-Aldrich）中的G / ml毒品在5 mm半胱氨酸-HCl（30119，Fluka，Buchs，瑞士），55 mm Na-柠檬酸盐（71406，Fluka），150 mm NaCl（71380，Fluka）和5 mm EDTA（03685，Fluka）。通过1,9-二甲基亚甲基蓝（DMMB）结合测定量定量糖胺聚糖（GAG）含量。DMMB在pH为1.5的pH下与Gag结合（但是，据信藻酸盐在pH 1.5处质子化），并且可以在600nm的波长下测量吸收。在上述蛋白酶缓冲液中稀释硫酸软骨素（C9819，Sigma-Aldrich）的稀释性，标准曲线进行。T.he amount of DNA was determined by Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent (P11496, Invitrogen, Life Technologies Corp., Basel, Switzerland), following the manufacturer’s protocol with a high-range standard curve of Lambda DNA standard (P11496, Invitrogen Life Technologies Corp., Basel, Switzerland) [30.那31].使用荧光光谱仪读数器（SpectraMax，M5，分子器件，美国）在激发487下测量荧光 在525 nm处的辐射 纳米，截止值为515 纳米。

2.8。在体外器官培养模型和hMSC的注射

为了测试细胞在IVD环境中存活的可行性，将转染细胞注射到已建立的器官培养模型中。根据地方当局的规定，从当地屠宰场获取牛尾骨椎间盘。如前所述，准备椎间盘进行器官培养sly使用Ringer溶液和喷射灌洗喷雾技术，使营养物质扩散用于器官培养[32那33]。然后将制备好的光盘注入60 i、 木瓜蛋白酶U（Sigma，Aldrich）使用25 如前所述，将G针置于IVD中心，在37°C的标准培养箱和HG-DMEM及5%FCS的自由溶胀条件下培养7天。细胞密度为4 软Q-凝胶聚乙二醇（PEG）水凝胶（参考文献1004，不含RGD的MMP可降解基质，Q-凝胶SA，瑞士洛桑）中的M细胞/mL。在木瓜蛋白酶消化形成空腔后约200 五十、 因此大约有200人 用22-羟色胺将k个hMSCs注射到空腔中 G针和a 1 mL注射器（BD Bioscience，Allschwil，瑞士）。共注射了三组细胞：（1）未转染的骨髓间充质干细胞，（2）转染对照质粒（pmaxGFP，Amaxa，Lonza，Basel，Switzerland）和（3）含有GDF5序列的MSC+pRG207105。此外，还有一个仅水凝胶对照和一个未经处理的器官培养对照盘。然后将带有注射水凝胶/细胞混合物的IVD在特殊设计的培养室中培养7天，不加载[33］.孵育后，解剖ivd并在宏观和显微镜下观察水凝胶/细胞混合物。对IVD内、外纤维环进行GAG和DNA分析。

2.9。统计数据

由于数据的非正态分布，使用非参数Wilcoxon符号秩检验对相关基因表达数据进行测试，假设平均值为1.0，这是未受感染的假细胞。所有计算均在Prism 6.0中完成 c（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托）。对于GAG/DNA比率，我们使用未配对的T.-假设标准差相等且尾部为一侧的检验。

3.结果

３．１．hmsc的CD标记表达

两个选定的供体的标记物CD90、CD44均呈阳性染色，一个供体的CD105也呈轻微阳性。两个供体的CD标记物45均呈阴性染色（见补充图1，可在线获取，网址为http://dx.doi.org/10.1155/2013/326828）.

3.2.在体外二维和三维转染分析

MSC高效表达GDF5达3周。融合蛋白可被发现为绿色荧光（GFP标签），转染后在绿色荧光显微镜下监测达3周，也可使用针对GDF5的特异性抗体检测（图2（c）和2（d））.协议U-23比C-17产生更大的绿色细胞（图2（a）和2（b））.藻酸盐中GDF5基因转移和3D培养物的组合显示出在与未经传播的细胞相比，作为软骨发生的标记物和KRT19作为灭菌的标记的显着上调，与未转染的细胞相比（图3.)。电穿孔后封装在藻酸盐中并生长14天的hMSCs在培养物中倾向于产生更多的蛋白多糖（GAG/DNA）；然而，这在统计学上并不显著，（数字4.）.

3.3.三维器官培养

通过宏观检测培养在3D器官培养内的细胞和水凝胶培养，即PEG水凝胶的体积大约缩小到其初始体积的20％。然而，通过用PMAXGFP转染的细胞的荧光显微镜（图形）成像，可以在水凝胶中检测细胞。5.）.木瓜蛋白酶消化的盘的GAG / DNA比通过10几乎因子显着减少（图6.）.然而，在具有HMSCs的基团中，用RG207105质粒转染，可以观察到GAG / DNA比的部分恢复（图6.）.

4。讨论

4.1。HMSCs的表型

我们的GDF5转染的MC向IVD样表型分化。我们发现ACAN、SOX-9和有趣的KRT19显著上调。KRT19最近被确定为椎间盘基因表型的潜在标记物[18.那19.]，KRT19的这种“标记行为”可以在我们的研究中确认。然而，胶原蛋白2型没有显示出任何增加，这可能是在没有地塞米松的情况下的生长因子GDF5的​​典型反应。之前的学习 [18.那19.]联合使用地塞米松和生长因子GDF5和TGF-β，地塞米松已被证明具有刺激作用[34那35]，而TGF-不存在β或其他与BMP相关的细胞因子。因此，由于缺乏地塞米松或由于单独的GDF5（没有GFP），因此可以通过缺乏地塞米松或由于GFP标记的融合蛋白的差异表达来解释电流缺乏胶原2表达。以前的研究表明刺激性效果体外椎间盘细胞[20.那36］.王等人也进行了类似的方法。[16.]但是在使用腺病毒作为载体。我们还测试了质粒pZS2GDF5，其中Wang等人。[16.之前使用。相关基因表达结果(数据未显示)与gfp标记的质粒RG207105相似。有趣的是，与单层培养相比，3D培养中GAG的产量增加。GDF5是一种有趣的椎间盘基因治疗候选基因，因为它已在兔环穿刺退变模型中显示[21.］.

本研究中使用的hMSCs主要来自女性捐赠者(见表)1)值得一提的是，供体变异的结果可能是有偏差的。最近在原发性椎间盘细胞中有报道[37只有雄性髓核细胞(NPC)对培养基中存在的睾酮有反应。然而，在hMSCs中，Bertolo等人[37]没有找到供体变异性的任何依赖效应。此外，雌激素受体αPvuⅡ限制网站的性别相关的基因多态性最近已与MSC的较高的基础成骨细胞分化能力[相关38］.

器官培养可行性研究的结果显示，转染的细胞可能有恢复GAG/DNA比率的潜力(图)6.)，特别是在房颤内部，在椎间盘退变模型中形成空洞的区域。目前还不清楚注射的hMSCs在PEG水凝胶和椎间盘环境下的表型如何进展。由于无法提取足够的RNA进行RT-PCR反应和/或PEG水凝胶存在问题，我们无法在细胞的3D器官“共培养”后证明hMSCs的实际表型。然而，我们推测，由于GAG/DNA比率从9.0急剧增加到55.2，表型可能已经得到了改善(图)6.）.

4．2．GDF5在肌肉骨骼发育中的作用

为了研究GDF5在骨骼系统发育中的作用，已经进行了许多研究。

在野生型小鼠中，短足症的表型出现在胚胎发育的E12.5状态。此时，第一次软骨凝聚形成，然后在短足（bp）小鼠中减少，软骨分化也延迟。然而，小鼠中GDF5的过度表达[39]和鸡[40]导致软骨凝集增加，继发于软骨胶原增厚。这些研究表明，GDF5通过诱导细胞粘附和间充质细胞凝聚，进而向软骨细胞分化，调控软骨形成的起始。在发育过程中，GDF5控制软骨膜中软骨细胞的增殖，因此影响发育中的骨骼的生长和形状。GDF5在未来关节区也有表达，在未来关节区对关节发育影响较大[41那42］.

在GDF5中失去功能的患者中可以很容易地看到GDF5为极端的发展。GDF5中功能突变的杂合损失导致手中的畸形，BrachyDactyly型C [43].纯合子GDF5功能缺失突变导致更复杂的骨骼改变，也称为肢端系膜软骨发育不良。临床上分为Grebe型、Hunter-Thompson型和DuPan型。Grebe型患者的骨骼改变最严重，伴有高度侏儒症m、 极短的四肢和残缺的手指[44］.hunt - thompson型患者的表型相似，但症状较轻[45]DuPan型被称为肢端系膜软骨发育不良的最温和型。其临床特征为腓骨发育不良，导致正常行走的严重残疾[46］.

5。结论

本研究中能复制部分使用腺病毒递送系统用于髓核（NP）的细胞或外植体NP [过表达的GDF5在以前的研究中获得的GAG / DNA比的刺激作用16.那20.那40]在此，我们进一步表明，GDF5的过度表达将启动ACAN的表达，但在培养基中没有地塞米松的情况下，不一定是2型胶原的表达。然而，这种由GF诱导的特异性基因表达谱使GDF5成为从扩增的hMSCs中生长的治疗性细胞的可能候选靶点即将进行的研究将调查多个基因（即GDF5与TGF结合）的非病毒基因转移的效率-β)，以及基因治疗和环境条件(如可溶性GFs或缺氧)的联合作用。

缩写

女友:	生长因子
GDF5:	生长和分化因子5，同义词（BMP-14，CDMP-1）
FBS：	胎牛血清
禁毒常务委员会：	Aggrecan
COL1：	1型胶原
COL2：	2型胶原
hMSC：	人间充质干细胞
KRT19：	细胞角蛋白19
IVD：	椎间盘
开放阅读框：	打开阅读框。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者感谢Patrizia Castiglioni和Elena Calandriello的技术援助。该项目由Lindenhof集团的基金会资助(项目编号:13-02-F)。

补充材料

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