1。介绍
病毒的基因传递的极大兴趣,刺激细胞直接的潜在临床应用广泛的肌肉骨骼疾病。脊柱椎间盘的修复和再生,细胞必须匹配的土著居民椎间盘(试管)利基。髓核细胞,在圆盘的中心,和纤维环细胞填充试管“利基市场”,很难在实验室繁殖以来唯一的标记来识别这些细胞还不知道(
1- - - - - -
4]。试管利基被定义为低pH值,非常密集的细胞外基质组成的胶原蛋白和粘多糖等aggrecan和相对较低的细胞结构(
5,
6];因此盘环境原因等植入细胞的一个重大挑战msc。一个策略如果细胞将被移植到一个复杂的领域如试管,由高度专业化和填充完全适应本地的细胞群,是与一些专业前提细胞生长因子(GF)鸡尾酒(还不知道)或额外的机械刺激(
7]。毫无疑问派生骨髓间充质干细胞(msc)在许多领域提出了肌肉骨骼的研究相对容易,因为他们可以是孤立的,展示一个快速扩散,并持有力量分化成不同的间质组织(
8,
9]。然而,它们的用法为临床应用尚未确定有安全限制和质量检查需要在再植术患者之前(
10,
11]。
目前的手术方法是去除阀瓣(神经)和融合相邻椎体或添加一个金属笼子(
12]。生物疗法修复椎间盘高度的。生长因子治疗被认为是一种很有前途的方法再生。然而,交付到目标细胞似乎阻碍和主要解决BMP-2注射研究已经报道的临床研究[
13]。另一方面,方法使用再生水凝胶圆盘的中心已经提出并研究了无数次与温和的结果,特别是在生物力学属性长期承受机械负荷(
14]。在基因转移的方法试过到目前为止adenoviral方法(
15,
16)已被广泛使用,效率高,但并不很接受在转化研究的角度
17]。生长分化因子5 (syn GDF5。BMP14或CDMP1)已被证明是一个关键因素来推动主要hMSCs intervertebral-disc-like表型(
18,
19),但它也被确认为一个刺激和强大的椎间盘细胞再生因子
在体外(
20.),
在活的有机体内在一只兔子试管环刺退化模型(
21]。关键的重要性进一步证据GDF5下腰痛来自基于人口的研究来确定连锁不平衡的单核苷酸多态性(
22]。重组体人rhGDF5目前正在调查作为药物重新生成随机第二期临床试验试管(
http://www.clinicaltrials.gov/情况下
NCT01124006)。然而,外生GDF5的注入是一种非常昂贵的治疗不是很能忍耐的场景,除非它是交付技术,可以提供持续的水平达到疗效。药物输送到细胞的问题尚未解决的是最近在这里等人提出的情况下直接注射BMP2的脊柱融合增强器(
13]。因此,我们感兴趣的测试病毒的基因治疗方法通过直接交付通过电穿孔基因的主要hMSCs和测试这些是否会分化成intervertebral-disc-like前体细胞GDF5的过度。因此,我们执行
在体外电穿孔介导基因转移GDF5的初级hMSCs和注射到椎间盘外植体模型,旨在实现光盘再生。
2。材料和方法
2.1。细胞来源和扩张
人类骨髓从20岁到60岁间12例髋关节或脊柱手术后书面同意(表
1)。批准的程序伦理广州办公室伯尔尼(KEK # 187/10)。人类间充质干细胞(hMSCs)从单核细胞比例放大后密度梯度离心法(histopaque - 1077, Sigma-Aldrich、书、瑞士)通过选择塑料坚持1 - 2篇文章。hMSCs是扩大使用杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM),血糖低,GlutaMAX,丙酮酸和10%的边后卫,100
μg / mL青霉素,链霉素100 UI /毫升、和2.5 ng / mL bFGF-2 [
23]。
捐赠者名单用于hMSC扩张。所有的细胞都是在道德上获得批准(KEK 187 # 10)骨髓送气的脊柱手术的患者椎体。
| ID |
网站的愿望 |
性别 |
年龄 |
| 患者49 |
- - - - - - |
男性 |
51 |
| 病人50 |
- - - - - - |
女 |
77年 |
| 病人51 |
Th11, Th12 |
女 |
38 |
| 病人52 |
L1 |
女 |
79年 |
| 患者53 |
- - - - - - |
女 |
86年 |
| 患者54 |
Th11, L1 |
女 |
73年 |
| 病人55 |
Th10, Th12 |
男性 |
61年 |
| 病人56 |
Th11, L1 |
女 |
58 |
| 患者57 |
髂嵴 |
女 |
81年 |
| 病人58 |
Th5, Th6 |
女 |
54 |
| 病人59 |
Th10, Th12 |
女 |
80年 |
| 病人60 |
Th10、L2和L3 |
女 |
81年 |
Th:胸椎骨体,腰椎椎体。
2.2。表征存在的hMSCs基质CD标记表达式
孤立的人类间充质干细胞表面标记的特征。两个独立的MSC人口(2不同的捐赠者,病人59 - 60)被随机选择和分析CD105、CD29、CD44, CD90、CD45 (Abcam、剑桥、马、美国)流式细胞术在流式细胞仪LSRII (BD生物科学公司,布鲁塞尔,比利时)。结果为每个CD标记比较清白的细胞和同形像控制。
2.3。Nucleofection的细胞
GDF5的transfection-ready质粒RG207105人类cDNA ORF克隆(NM_000557)被选为一个向量。质粒包含CMV启动子和GDF5的融合蛋白包括GFP-tag(位于马里兰州Rockville OriGene Technologies Inc。,美国)(图
1)。电穿孔之前RG207105放大
大肠杆菌与积极的选择存在的氨苄青霉素(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)和纯化使用QuickLyse Miniprep装备根据制造商的指示(瑞士巴塞尔试剂盒Inc .)。GDF5的ORF序列的查验点突变的积累造成克隆使用直接插入的DNA测序RG207105 (Microsynth、Balgach、瑞士)使用提供的DNA引物。hMSCs被Nucleofector电泳技术(瑞士巴塞尔,Lonza Amaxa)使用Lonza U-23优化协议(该协议的c - 17 ~ 10%转染细胞的转染效率低)透露,间充质干细胞Nucleofector解决方案(汽相外延- 1001,Amaxa Lonza Inc .),它提供了一个保护环境,允许高转染效率和细胞生存能力。大约500 k细胞转染/反应,离心机,resuspended Nucleofector解决方案,和2
μ克的质粒DNA根据制造商的指示。后直接电脉冲,prewarmed DMEM LG、10%的边后卫是添加到试管和细胞悬液被播种到6-well或12-well盘子。
质粒pCMV6-AC-GFP矢量地图包含人类真正的黄金ORF GDF5与c端TurboGFP(加入基因库NM_000557)。
![]()
2.4。Immunohistological染色
细胞生长在单层彩色细胞内GDF5的存在。转染细胞被播种到玻璃盖滑6-well板和培养14天。最初的细胞固定在4%多聚甲醛(PFA)直接在6-well板上。细胞被渗透的孵化与PBS 0.1%的渐变。细胞被preincubated 1 h和1 xpbs和10% FCS阻止非特定的染色,水洗,然后用主兔多克隆抗体(孵化GeneTex、Ivine、钙、美国、猫。针对GDF5 GTX113580)的稀释1:200 1小时。后彻底洗细胞二次红色荧光标记抗体(Abcam ab6939)修订的稀释1:1000。染色细胞在玻璃盖片与1安装在载玻片上滴的安装介质与DAPI荧光(Vectashield, h - 1200、Reactolab Servion,瑞士)。图像是用荧光显微镜房颤6000 LX徕卡(位于德国)。
2.5。3 d藻朊酸盐文化
Electroporated msc在单层培养1周后使胰蛋白酶化(扩张)使用0.5% EDTA-Trypsin(瑞士巴塞尔Gibco、生活技术)。细胞被洗在磷酸缓冲盐(PBS)和播种密度的1.2%海藻酸2×106细胞/毫升,然后通过22 G针头的注射器。这个过程允许创建~ 30
μL珠是由海藻酸为102毫米CaCl下降2解决方案。细胞被种植在高葡萄糖DMEM GlutaMAX含有丙酮酸、10%的边后卫,1%青霉素和链霉素(瑞士巴塞尔Gibco,生命技术、表达载体)在缺乏地塞米松。珠子snap-frozen在7天、14和21和分析基因表达和呕吐/ DNA内容。
2.6。相关基因表达分析
基因表达、细胞直接细胞溶解或海藻酸珠子瞬间冷冻在液体N2。珠子被粉碎成粉末在液体N2从结构和总RNA提取三试剂(分子研究中心)使用修改后的TRIspin方法(
24]。总RNA (100 - 200 ng)用于逆转录(RT)和随后的聚合酶链反应(RT - PCR)使用gene-specific引物和探针
25,
26]。反转录与执行Bio-Rad逆转录试剂(Bio-Rad、Glattbach、瑞士)。实时PCR进行IQ-5 rt - PCR系统(Bio-Rad、死、瑞士)使用SYBR绿色科技。寡核苷酸引物(所有从Microsynth、Balgach瑞士)与引物设计的设计师灯塔软件(帕洛阿尔托总理Biosoft Inc .)、钙、美国)使用核苷酸序列从基因库数据库(表
2)。rt - pcr是量化使用IQ-5周期计软件(Bio-Rad、巴塞尔、瑞士)。荧光阈值的对数生长期的放大,和每个样品PCR循环所需的数量达到这一水平被记录为C
t值(
27]。基因表达被ΔC量化
t值使用相对量化方法(应用生物系统公司:用户通报2号ABI棱镜7700序列探测系统,2001),C正常化
t值相对于辅助基因的基因表达(如核糖体18岁)。ΔΔC
t值在一天第七天将估计相对于0和转换成相对使用公式2-ΔΔC mRNA的价值观
t(
28]。我们筛选相对基因表达的主要合成代谢基因:aggrecan,胶原蛋白,胶原蛋白II;和其他最近出版的试管标记基因(
2,
18,
29日)(表
2)。
用于rt - pcr引物列表。
| 缩写 |
基因名字 |
向前 |
反向 |
| Hs_18S |
参考基因 |
注册会计师TGC GGC GGC GTT ATT C |
GTC TCT GTC AAT有条件现金转移支付资本利得税GTC C |
| Hs_ACAN |
Aggrecan |
猫CAC TGC AGC TGT CAC |
AGC AGC行动ACC苑TTC |
| Hs_COL1 |
Collagen1 A2 |
GTG GCA GTG ATG棉酚GTG |
CAC CAG TAA GGC (CGT TTG |
| Hs_COL2A1 |
胶原蛋白2 A1 |
AGCAAGAGCAAGGAGAAG |
GGGAGCCAGATTGTCATC |
| Hs_SOX9 |
SRY hox基因9 |
GAG TCT棉酚CGA插科打诨 |
GGC TGG TAC TTG TAA移行细胞癌 |
| Hs_KRT19 |
角蛋白19 |
TGT GTC CTC GTC CTC CTC |
GCG手枪CTT CAC CTC标签C |
| Hs_GDF5 |
生长分化因子5 (GDF5) |
ATCAGCATCCTCTTCATTGACTCT |
ACACGACTCCACGACCAT |
| Hs_GFP |
绿色荧光蛋白 |
ATGACCAACAAGATGAAGAG |
AAGTGGTAGAAGCCGTAG |
2.7。呕吐/ DNA比
一夜之间,三个珠子或试管组织被消化与125年60°C
μ
g / mL从木瓜木瓜蛋白酶乳胶(p - 3125, Sigma-Aldrich)在5毫米Cysteine-HCl(30119、丙烯酰胺、书、瑞士),55毫米Na-Citrate(71406年,丙烯酰胺),150毫米氯化钠(71380年,丙烯酰胺)和5毫米EDTA(03685年,丙烯酰胺)。粘多糖(GAG)内容由1量化,9-dimethylmethylene蓝色(DMMB)绑定化验。DMMB结合呕吐在pH值为1.5(但海藻酸被认为是质子化了的pH值在1.5)和吸收可以测量波长600纳米。标准曲线进行稀释的硫酸软骨素(木瓜蛋白酶C9819 Sigma-Aldrich)缓冲区,上面所描述的。DNA的数量取决于Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂(P11496、表达载体、生命技术公司,巴塞尔瑞士),制造商的协议后高幅度的标准曲线λDNA标准(P11496,表达载体的生命技术公司,巴塞尔瑞士)(
30.,
31日]。荧光测量使用荧光谱仪读者(美国SpectraMax、M5、分子设备)在励磁487海里和排放在525 nm,截止在515海里。
2.8。< /斜体> <斜体>体外器官培养模型和hMSC注入
为了测试细胞生存的可行性试管环境转染细胞被注入一个建立器官培养模型。牛尾骨的椎间盘是收获从当地屠宰场根据当地政府的规定。椎间盘器官培养的准备如前所述使用振铃器解决方案和喷射清洗喷涂技术,使营养器官文化扩散(
32,
33]。准备的光盘被注入了60个国际单位。木瓜蛋白酶(σ,奥尔德里奇)使用25 G针在试管如前所述的中心和孵化为7天37°C标准的孵化器和HG-DMEM和5% FCS free-swelling条件。细胞被在4 M细胞的密度/毫升软Q-Gel聚乙二醇(PEG)的水凝胶(Ref 1004年MMP-degradable矩阵没有RGD, Q-Gel SA洛桑瑞士)。后腔形成了木瓜蛋白酶消化大约200
μ
L,因此大约200 k hMSCs被注入腔使用22 G针和1毫升注射器(BD生物科学、Allschwil、瑞士)。有三组细胞注射:(1)untransfected MSC、与控制(2)转染质粒(pmaxGFP、Amaxa Lonza,巴塞尔瑞士),和(3)MSC + pRG207105包含GDF5的序列。此外,有一个水凝胶只控制盘控制和未经处理的机关文化。试管与注入水凝胶/细胞混合培养7天没有加载在特殊设计的文化钱伯斯(
33]。孵化后,试管被切割和水凝胶/细胞混合物是宏观和微观检查。试管的内外纤维环受到呕吐和DNA分析。
2.9。统计数据
相对基因表达数据测试假设的意思是1.0,这是untransfected虚假的细胞使用非参数Wilcoxon符号秩检验数据的非正态的分布。所有的计算都是在棱镜完成6.0摄氏度(美国帕洛阿尔托,CA)。呕吐/ DNA比我们测试未配对
t以及假设等于标准差和片面的尾巴。
3所示。结果
3.1。CD表达hMSCs标志
都选择捐助者显示阳性染色标记CD90、CD44和一位捐赠者CD105也稍微积极。负染法被捐助者的CD标记45(请参见图1补充网上
http://dx.doi.org/10.1155/2013/326828)。
3.2。< /斜体> <斜体>体外转染2 d和3 d的化验
MSC表示GDF5有效3周。作为一个绿色荧光融合蛋白能找到(GFP-tag),绿色荧光显微镜下观察转染后三周,也可以检测到特定的抗体GDF5(数字
2 (c)和
2 (d))。协议U-23产绿色细胞明显高于c - 17(数字
2(一个)和
2 (b))。GDF5基因转移和3 d文化海藻酸显示出显著upregulation SOX9作为软骨形成和KRT19标记的标志discogenesis相比untransfected细胞(图
3)。的hMSCs electroporated然后封装在藻酸盐生长14天会产生更多的蛋白聚糖的文化(每个DNA GAG);然而,这不是统计学意义,
P
=
0.196
(图
4)。
(a)和(b) pmaxGFP-transfected hMSC 48小时后的c - 17 (a)或U-23 (b)电穿孔使用Amaxa nucleofector。(c)和(d) GDF5的表达转染和控制hMSC单层培养14天之后,从GeneTex anti-GDF5抗体。蓝色:细胞核DAPI染色,格林:翻译GFP,红色:胞内GDF5。(c)的细胞群的决议20 x或(d)特写(68 x) hMSC转染RG207105,入口在c =虚假的控制。
![]()
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相对基因表达untransfected细胞后7日,14日和21天(三个时间点)在单层培养(a)和(b)在三维细胞培养使用1.2%海藻酸珠子;灰色酒吧对应的第0天细胞单层培养(7天)。酒吧代表分钟max。与一条线的意思。N = 4±SEM。* * *表示从1 (untransfected细胞)明显不同
P
<
0.0001
。
![]()
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粘多糖(GAG) / DNA比海藻酸珠文化比较转染和untransfected细胞。
![]()
3.3。三维器官培养
细胞的孵化和水凝胶内部的三维器官培养了宏观检查,盯住水凝胶体积大大缩小到20%左右的初始体积。然而,细胞仍然可以发现在水凝胶成像与荧光显微镜的pmaxGFP转染细胞(图
5)。木瓜蛋白酶消化光盘的呕吐/ DNA比率大大减少了几乎10倍(图
6)。然而,hMSCs组中,与RG207105转染质粒,呕吐的部分恢复/ DNA比率可以观察(图
6)。
Q-Gel水凝胶与GFP表达hMSCs (pmaxGFP)成像与荧光显微镜从盘的中心经过7天的牛椎间盘器官文化。
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粘多糖(GAG) / DNA比外部和内部纤维环(AF) 7天后free-swelling牛椎间盘的机关文化。请注意区别untransfected hMSC、控制pmaxGFP, RG207105转染细胞。GDF5的overexpressing细胞正在推动部分呕吐/ DNA比牛试管器官培养。
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4所示。讨论
4.1。表型的hMSCs
我们GDF5转染MCS分化IVD-like表型。我们发现的一个重要upregulation能,SOX-9,有趣的是还KRT19。KRT19最近被确定为一个潜在的标记discogenic表型(
18,
19),这个“标记行为”KRT19可以证实在我们的研究中。然而,事实上,胶原蛋白2型没有任何增加的这可能是一个典型的反应缺乏生长因子GDF5的地塞米松。先前的研究[
18,
19)使用地塞米松结合生长因子GDF5和TGF -
β,地塞米松已经证明自己有刺激作用[
34,
35在缺乏TGF -
β或其他BMP-related细胞因子。因此,当前缺乏胶原蛋白2型表达式可以解释由于缺乏地塞米松或由于微分GFP-tagged融合蛋白的表达而独自GDF5(没有GFP)。先前的研究已经证明刺激效应
在体外椎间盘细胞(
20.,
36]。类似的方法也由王et al。
16),但使用腺病毒作为一个向量。我们还检测了质粒pZS2GDF5,王et al。
16之前使用。相对基因表达结果(数据未显示)与GFP-tagged质粒RG207105相似。有趣的是呕吐的生产增加了3 d文化比单层培养。GDF5基因疗法是一个有趣的候选人椎间盘,因为它已被证明在一只兔子annulus-puncture退化模型(
21]。
hMSCs利用在我们的研究主要从女性捐赠者(表
1),它应该提到捐助变异可能是偏见的结果。它最近报道原发性椎间盘细胞(
37只有男性髓核细胞(NPC)对睾丸激素培养基中。然而,在hMSCs Bertolo et al。
37没有发现任何sex-dependent捐献者变异的影响。此外,sex-dependent多态性的雌激素受体αPvuII限制网站最近与更高的msc(基底成骨细胞分化的能力
38]。
器官培养可行性研究的结果显示,转染细胞可能有一些潜在的呕吐/ DNA比率(图中恢复过来
6),特别是在内部房颤,地区椎间盘退化模型中创建一个空腔。目前还不清楚如何注射的表现型hMSCs是测试进展挂钩水凝胶和阀瓣环境。由于问题提取足够的核糖核酸rt - pcr反应和/或问题挂钩水凝胶我们无法证明的实际表现型hMSCs后三维器官的“coculture”细胞。然而,我们推测以来的表型可能是改善呕吐/ DNA比率从9.0到55.2(图大大增加
6)。
4.2。GDF5的作用在肌肉骨骼发育
已经有许多研究研究GDF5的功能执行到骨骼系统的发展。
在野生型小鼠的表型brachypodism出现在E12.5胚胎发育的状态。此时第一个软骨密集的形成,从而减少在brachypod (bp)鼠标和软骨分化也推迟了。然而过度GDF5的鼠标(
39和鸡
40)导致软骨冷凝增加二次增厚软骨间叶原基。这些研究表明,GDF5调节细胞粘附的启动与诱导软骨形成和冷凝的间充质细胞向软骨细胞分化紧随其后。在发展的过程中GDF5控制软骨膜软骨细胞的增殖,因此影响了增长和发展中骨骼的形状。GDF5也表示在未来关节区,它有一个高影响关节的发展(
41,
42]。
基本GDF5如何发展的四肢可以很容易地看到在GDF5患者失去功能。一个杂合的损失函数GDF5的突变会导致畸形的手,指过短类型C [
43]。突变纯合子GDF5的损失函数会导致一个更复杂的骨架的改变也被称为群acromesomelic软骨发育异常。它们在临床上分为水鸟类型,Hunter-Thompson类型和DuPan类型。水鸟类型显示患者最严重形式的改变骨架的高度侏儒症,极短的四肢和基本的手指间叶原基
44]。然而Hunter-Thompson类型患者功能类似的表型与不太严重的表现(
45]。DuPan类型称为最温和的类型acromesomelic软骨发育异常。这意味着作为临床特征腓骨的发育不全,导致严重残疾的正常行走(
46]。
5。结论
本研究可以复制部分的刺激影响overexpressing GDF5的呕吐/ DNA比获得在先前的研究中使用髓核adenoviral交付系统(NP)细胞或NP外植体(
16,
20.,
40]。这里,我们进一步表明,过度GDF5的开关但不一定能2型胶原的表达没有地塞米松的媒介。然而,这种特定的基因表达谱,诱导的女朋友,可能使GDF5目标候选人治疗细胞生长的生产扩大hMSCs采集卵子并种植的退化盘下腰痛病人。即将到来的研究将调查病毒的基因转移效率(即多个基因。,GDF5结合TGF -
β)和联合基因治疗的效果和可溶性GFs或缺氧等环境条件。