在无血清培养基中将牙髓干细胞分化为神经元样细胞

摘要

牙髓组织含有牙髓干细胞（DPSC）。牙髓细胞（也称为牙髓衍生的间充质干细胞）能够区分为包括神经元样细胞的多线粒细胞。本研究的目的是检查DPSCs在不使用任何试剂或生长因子的情况下分化为神经元样细胞的能力。DPSC与从6-8周龄小鼠提取的牙齿分离，并保持在完整培养基中。通过在没有血清或生长因子的培养基中培养来诱导来自第四通道的细胞。RT-PCR分子分析显示特征CD146.⁺那CD166⁺， 和Cd31^-在DPSC中，表明这些细胞是间充质干细胞而不是造血干细胞。在神经元分化5天后，细胞显示出神经元样形态变化并表达MAP2蛋白。激活依偎在分化之前在低水平下观察并在分化培养基中培养5天后增加，而Tub3仅在神经元分化5天后被激活。与对照细胞的相比，分化细胞的增殖降低。当在无血清和生长因子培养基中培养时，诱导牙科纸浆干细胞分化为神经元样细胞。

1.介绍

牙髓组织包含许多类型的细胞，包括犯罪细胞（例如，内皮细胞）和未提交的细胞（即，DPSC）。DPSCS是间充质干细胞（MSCs）[1］．在小鼠中，大多数MSCs与骨髓分离[2]和外周血[3.那4.］．这些间充质干细胞可以通过表达特定的基因标记，如CD44那CD73那CD90.那CD105那CD117.， 和CD166[5.那6.］．

DPSCs能够分化为多系细胞[7.-9.包括神经元样细胞[10.］．与源自骨髓细胞的MSCs的神经元样细胞分化[11-13脑[14］．然而，牙髓来源的间充质干细胞，即DPSCs，也具有向神经元样细胞分化的能力[10.］．骨髓间充质干细胞的特征与牙髓间充质干细胞相似[11］．两种类型的间充质干细胞都有表达Cd44那CD106.那CD146.， 和CD166[15-17］．

许多因素涉及神经元分化，包括巢蛋白[18[管蛋白3（TUB3）[19]和map2 [20.］．Nestin参与脊椎动物细胞中神经元分化期间轴突的径向生长[19那21］．因此，巢蛋白被称为神经标记物，并且其存在可以被认为是分化为神经元的能力的标准[18那22］．然而，Nestin已被证明是由其他类型的细胞表达的，如毛囊干细胞[23),(周围的周24]内皮细胞[25]，肌纤维细胞和胰腺成纤维细胞[26］．因此，对Tub3等特异性神经元标志物的表达进行分析[27那28]和map2 [29那30.]已经同时进行了神经元确认。TUB3和MAP2在轴突和神经元细胞体的稳定性中起作用[20.那31］．某些生长因子，如表皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子和视黄酸，用于神经元感应[32-35］．二甲基亚砜(DMSO)也用于诱导MSCs向神经元样表型的转化体外[12那13］．本研究的目的是在没有化学诱导的情况下观察DPSCs向神经元样细胞的定向分化。

2。材料和方法

２.１.牙髓细胞的分离

在无菌条件下从6- 8周龄的小鼠中提取门牙，并将其置于含1X PBS的培养基中(Sigma，美国)。用1X含1% (v/v)青霉素-链霉素(Invitrogen公司，美国)的PBS清洗提取的牙髓。

在37℃下在4单元胶原蛋白酶I型中孵育牙髓组织1小时，然后在几轮酶解聚物中孵育1小时。将细胞在25℃下以1200g离心10分钟并以完全培养基培养α-mem（Invitrogen，USA）补充了20％（v / v）fbs（Biowest，USA）和1％（v / v）青霉素 - 链霉素。细胞1×10^5. cells/mL obtained were put in a T25 flask containing complete medium and cultured in an incubator with 5% CO₂空气和95%的湿度在37°C。

24小时后，将悬浮细胞从培养基中除去，用1x PBS溶液洗涤烧瓶。细胞在完全培养基中生长，直至80％汇合。使用0.25％（v / v）胰蛋白酶-EDTA（Sigma，USA）的溶液从烧瓶表面脱离烧瓶表面，以使另一个烧瓶中培养为1×10^5.细胞/毫升。为了超低温保存和储存，在第四传代的细胞被放置在含有由α-mem，10％（v / v）DMSO（Sigma，USA）和50％（v / v）FBS并储存在液氮中。在该研究中，使用的细胞位于第四段。

2.2。牙髓干细胞的分化为神经元细胞

大约1 × 10^5. cells were transferred into 24-well plates containing complete medium and were allowed to grow for 24 hours until adherence. The medium was discarded, and the cells were washed with PBS. The cells were then cultured in serum- and growth factor free-medium consisting ofα-MEM和1% (v/v)青霉素-链霉素5天。在这5天期间，培养基每2-3天更换一次。作为对照，在完全培养基中培养相同数量的细胞(由α-mem，1％（v / v）青霉素 - 链霉素，15％（v / v）胎牛血清）5天。在使用奥林巴斯相位对比显微镜的日期分化的日期和5天和5时监测细胞形态。

２.３.利用RT-PCR进行分子分析

使用0.25％（v / v）胰蛋白酶-EDTA分离对照和分化的细胞，并以1400g离心10分钟。根据制造商的方案，使用三试剂（Sigma，USA）提取总RNA。在260和280nm的分光光度法评估总RNA的纯度，用a₂₆₀ : A₂₈₀比例为1.8-2.0可接受。对于每种RT-PCR反应，大约300ng总RNA样品与ACCEST RT-PCR系统试剂盒（Promega，USA）使用。使用基于从NCBI获得的序列使用Primer Premier 5.0软件程序设计了引物。关于引物的信息总结在表中1。

使用AMV逆转录酶在45℃下进行45分钟进行初级cDNA合成，然后在94℃下停用2分钟。扩增由94℃的变性30秒，退火60秒，并在68℃下延伸60秒，进行40个循环。在68℃下进行最终延伸步骤7分钟。使用1％（w / v）琼脂糖凝胶电泳，染色和分析分离扩增的产物。将扩增的产物进行DNA测序并使用NCBI使用BLASTN程序进行验证。至于表达水平分析，共1 μ使用在线Imagej 1.47程序确定每次扩增的总RNA总体，强度（http://rsbweb.nih.gov/ij/)．

2.4。MAP2的免疫细胞化学

用1X PBS洗涤神经元细胞，用4% (v/v)多聚甲醛在4℃下固定2小时。用0.05% PBS-Tween 20洗涤3次，然后用2% PBS-Triton-X洗涤10分钟。然后用0.05% PBS-Tween 20再次洗涤3次。在一抗孵育前，细胞在37℃下用0.05% (v/v) PBS-Tween 20稀释的10%山羊血清加0.01 mg/mL BSA孵育30分钟。去除该溶液，一抗1:200，用0.05% (v/v) pbs -吐温20加3% (v/v)山羊血清稀释，加入1 mg/mL BSA，在4℃下孵育24小时。然后用0.05% (v/v) PBS-Tween 20洗涤3次，然后用Tween 20 + 3% (v/v)山羊血清和1mg /mL BSA，室温1:50稀释二抗抗小鼠IgG-FITC孵育30 min。最后用0.05% (v/v) PBS-Tween 20洗涤3次，然后用荧光显微镜分析。阴性对照为未分化细胞，无神经元诱导，即完全培养基培养。

2.5。3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑鎓溴（MTT）测定

大约1 × 10^4.96孔板培养，37℃孵育24小时。培养两组细胞:一组在完全培养基中(对照)，另一组在血清和无生长因子培养基中。经过24小时的孵育大约20分钟μ将L MTT（5mg / ml）加入每个样品中，并将样品在37℃下孵育另外4小时。混合物缓慢除去，200 μ将L的DMSO加入每个孔中，并且通过ELISA板读数器在570nm处测量孔。每个实验一式三份重复。在神经元诱导的第一，第三和第五天对细胞进行MTT测定。使用在实验之前创建的标准图来确定每个分析的可行细胞数。

2.6。统计分析

使用配对进行比较来自差异化和对照组的数据-test在SPSS程序版本16.0.2。差异与值< 0.05认为有统计学意义。数据以平均值表示(平均值±SD;标准差)，由三个独立实验()．

结果

3.1。牙髓组织中间充质干细胞的鉴定

使用胶原酶用胶原蛋白酶分离的解离细胞的同一性通过它们的能力确认形成由球形细胞簇组成的粘附菌落（图1)．平均为6.8×10^4. cells/cm²发现能够在完整培养基中培养24小时后获得菌落。然后，弃去悬浮细胞，并且在培养基中仅膨胀粘附细胞。悬浮细胞可能是在培养基中不能存活的细胞。殖民地在第二段中开始改变它们的形状。该细胞在第四通道期间假设具有长，薄的身体的成纤维细胞样形态，并且在2至3天后变得融合体外完整培养基中的文化。

第四代进行了分子分析以验证细胞类型。从第四传代牙髓细胞中提取总RNA，进行RT-PCR分析(图)2)．这个分析显示CD146.和CD166在这些细胞中的扩增子，而激活Cd31没有观察到。扩增子GAPDH.在分化前后的牙髓细胞中均有。分析表达水平为CD146.和CD166被证明了生产％ 和%，与GAPDH.(100%)用于使细胞mRNA水平正常化。

3.2。形态学变为神经元样细胞和MAP2蛋白的表达

经过5天的培养后，大多数细胞显示形态变化到长而瘦身（图3.)．细胞质向细胞核收缩，呈多极状。细胞呈小的、球形的和收缩的小体，胞浆呈圆锥形，胞浆中有类似神经元核周、轴突和树突的分支。白色箭头、开口箭头和黑色箭头分别表示神经元细胞的核周、树突和轴突。大约60%-70%的细胞群分化为神经元样细胞，表明分化是由于缺乏血清和生长因子而发生的，而不是由于自发分化。DPSCs在无血清和无生长因子培养基中培养5天后表达神经元特异性蛋白标记物MAP2(图)3.)．然而，在没有神经元诱导的情况下，在DPSC或未分化的细胞中未检测到MAP2，即在完全培养基中培养（阴性对照）（图3.)．

３．3.神经元标记物的激活

细胞显示表达CD146.⁺那CD166⁺， 和Cd31^-在差异化之前。RT-PCR分析显示存在a依偎分化之前和之后细胞中的扩增子（〜215bp）。但是，强度依偎与分化之前的分化后，激活显着提高（图4（a）)．一个扩增子Tub3(~125 bp)神经元分化第5天4（b）)．Tub3显示在神经元分化的5天后被激活。GAPDH.用作分化前后的阳性控制。一种GAPDH.在分化之前和之后的细胞中发现扩增子（〜717bp），表明这一点GAPDH.在两种类型的细胞中保持活化（图4（c）)．

3.4。分化期间牙科纸浆干细胞的增殖

在神经细胞分化过程中进行细胞活力研究，以评估分化细胞和未分化细胞的增殖能力。对照组和分化细胞数量显著(）与培养的第0天相比，在分化时增加（图5.)．然而，细胞的增殖能力在培养24小时后逐渐变化，直到神经元分化的第5天，其对照细胞的数量较高。两种类型的细胞在最初的24小时内保持其生长速度，培养。然而，分化细胞在24小时后表现出生长速率的降低，而未分化的（对照）细胞保持其生长速率，导致活细胞数量增加。统计分析显示出显着差异（）在培养的第3天和第5天之间的两种细胞之间的细胞数（图5.)．

4.讨论

细胞在第四通道期间形成成纤维细胞样形态。分子分析显示CD146.和CD166扩增子但没有Cd31证实成纤维细胞样细胞是MSCs而不是造血干细胞。CD146.和CD166是间充质干细胞标记物[36那37］．CD146.是在牙髓组织中表达的早期间充质干细胞标记物[36］．CD166是一种细胞粘附分子，在细胞间紧密相互作用和调控MSCs分化中发挥重要作用[38］．尽管CD166在各种组织中表达，通常仅限于涉及动态生长和/或迁移过程中涉及的细胞的子集，包括神经发育和免疫反应[39］．扩增子GAPDH.在差异化之前和之后在DPSC中发现表明GAPDH.以两种类型的细胞表达。

为了确认DPSCs对神经元表型的分化，并证明这种分化不是人工制品，进行了三种分析：形态学变化，MAP2的表达和神经元标记的激活。经过2天的培养后，大多数细胞类似于多极神经元。然而，在群体中仍观察到一些具有散布形态的成纤维细胞样细胞。我们认为DPSC在血清和生长因子培养基中培养后5天后逐渐变化为神经元样细胞。通过显示神经元形态分化为神经元细胞的各种组织的DPSC [40那41，与我们的观察结果相似。形态分析表明，牙髓组织中分离的DPSCs可分化为神经元。

RT-PCR分析显示存在a依偎扩增子。依偎是成人大鼠和人脑中的神经元标记[42］．这两个依偎和Tub3还用作在DPSC植入后调查小鼠海马中神经元分化的标记[43］．两者的表达依偎和Tub3分化后表明DPSC分化为神经元细胞。巢蛋白是脊椎动物细胞的细胞骨架中的中间细丝之一[19那44］．依偎通过表达来跟踪神经元干细胞的增殖、迁移和分化。Tub3在所有真核细胞中表达。它有助于神经元细胞微管的稳定，并在轴突运输中发挥作用。在本研究中，Tub3在神经元分化5天后被激活。GAPDH.用作分化前后的阳性控制。GAPDH.是一种管家基因，始终被哺乳动物细胞始终由未分化的或分化细胞激活[45］．它用于确定分离DPSC的RNA质量，并使MRNA的水平正常化。一种GAPDH.分化之前和之后的细胞中发现扩增子，表明这一点GAPDH.在两种类型的细胞中保持活化。

依偎在神经元分化期间激活增加。依偎已知在纤维牙髓组织中表达，然而，在神经元感应之后的大多数DPSC中，其表达继续检测到;也就是说，表达了依偎当细胞分化为神经元时增加[28］．MAP2和Tub3仅在神经元分化后表达，因此在生长的最后阶段作为成熟神经元细胞的标志物[46-48］．MAP2阳性神经元细胞已被证明是神经元诱导产生的成年神经元细胞。不同的表达依偎在几种细胞类型中，如毛囊干细胞，周细胞，内皮细胞，肌纤维细胞和胰腺成纤维细胞依偎没有特异性神经元[23-26］．然而,结合依偎以及其他神经标记的表达，也就是说，Tub3和MAP2，可支持神经元分化。此外，神经元样细胞的形态学分析也显示阳性结果。

虽然在以前的研究中使用了生长因子如FGF和维甲酸，但在本研究中仅通过从完全培养基中排除血清和生长因子来诱导神经元。我们的观察Tub3和依偎激活，神经元样细胞形态，以及MAP2表达提供了小鼠牙髓干细胞定向分化到无血清和生长因子的无神经元样细胞中的证据。

虽然它们的生长速率低于对照组的生长速率，但仍在持续分化细胞的增殖。理论上，细胞的增殖和分化不能同时发生。协调这两个过程的信令提示在很大程度上是未知的。然而，细胞分化和增殖同时但独立调节，细胞通常在它们停止分割之前开始差异，并且分化的开始不限于细胞周期的任何特定区段[49那50］．在本研究中，分化细胞在培养24小时后开始缓慢分裂，并持续直至分化期结束，表明细胞在诱导神经元分化后立即进行分化。尽管细胞的数量增加在分化的诱导时，但随后细胞显示出生长速率降低并重点关注分化过程。

成体干细胞的能力分化为来自不同胚层或细胞谱系的细胞被称为转染细胞。来自骨髓的干细胞源自中胚层的骨髓被显示为能够分为肝，肺，胃肠道和衍生自内胚层和中胚层的皮肤细胞[51］．发现外周血干细胞（造血干细胞）也能够区分成未源于造血细胞，如肝，皮肤上皮和胃肠道细胞[52］．细胞微环境发生的变化，例如在中添加某些生长或分化因子体外发现细胞培养物能够诱导转染液[53］．血清缺失也有助于这种转移引起的，因为在培养基中添加血清允许细胞的生长和维持并防止胚胎干细胞分化为神经元细胞[54］．在该研究中，培养过程中没有血清和生长因子可能导致DPSCS转化为神经元样细胞。

5.结论

在无血清和生长因子培养基中培养时，诱导牙科纸浆干细胞分化为神经元细胞。

作者的贡献

Shahrul Hisham Zainal Ariffin是这个项目的负责人。他设计了实验并表征了细胞系。Shabnam Kermani进行了实验。Intan Zarina Zainol Abidin分析了数据并纠正并重写了纸张。Rohaya Megat Abdul Wahab设计了实验并分析了数据。Zulham Yamamoto写了这篇论文。Sahidan Senafi和Zaidah Zainal Ariffin分析了数据并纠正了论文。Mohamad Abdul Razak设计了实验和研究方法。所有作者均已读并批准本文。

致谢

本研究项目由GRANTS FRGS / 1/2011 / SG / UKM / 02/13和ERGS / 1/2012 / SKK11 / UKM / 02/5资助的Malaysia和UKM-DLP-2012-025资助，来自Kebangsaan Malaysia大学的UKM-DLP-2012-001和DPP-2013-024。

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