SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 250740年 10.1155 / 2013/250740 250740年 研究文章 牙髓干细胞的分化成Neuron-Like细胞在无血清培养基 http://orcid.org/0000 - 0002 - 5949 - 7862 。Ariffin Shahrul Hisham 1 Kermani Shabnam 1 Zainol Abidin Intan Zarina 1 Megat阿卜杜勒瓦哈卜 一席话激怒 2 山本 Zulham 1 Senafi Sahidan 1 。Ariffin Zaidah 3 阿卜杜勒拉扎克 穆罕默德 4 Bhartiya 的同时 1 生物科学和生物技术学院 科学技术学院 马来西亚Kebangsaan大学 43600年Bangi 雪兰莪州 马来西亚 ukm.my 2 口腔正畸学部门 牙科学院 马来西亚Kebangsaan大学 道路拉穆达阿卜杜勒阿齐兹 50300年吉隆坡 马来西亚 ukm.my 3 学院的生物学 应用科学学院 各种大学玛拉 40450年莎阿南 雪兰莪州 马来西亚 uitm.edu.my 4 Allianze大学医学科学 Waziria医疗方 道路成分2 13200年Kepala巴塔 槟城 马来西亚 allianzeunicollege.edu.my 2013年 18 11 2013年 2013年 13 12 2012年 23 09年 2013年 07年 10 2013年 2013年 版权©2013 Shahrul Hisham。Ariffin et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

牙髓组织包含牙髓干细胞(DPSCs)。牙髓细胞(也称为牙科pulp-derived)间充质干细胞能够分化成multilineage细胞包括neuron-like细胞。本研究的目的是审查的能力DPSCs分化成neuron-like细胞不使用任何试剂或生长因子。DPSCs从6 -从牙齿中提取分离到8-week-old老鼠和维护在完全培养基。第四段的细胞诱导分化培养的培养基没有血清或生长因子。rt - pcr分析显示分子的特点 Cd146+ , 存在+ , Cd31− 在DPSCs,表明这些细胞间充质干细胞而不是造血干细胞。经过5天的神经分化,细胞显示neuron-like形态变化和表达MAP2蛋白质。的激活 巢蛋白之前观察到低层次分化,增加5天后文化在分化培养基中,而 Tub35天之后才被激活的神经元分化。的增殖分化细胞相比,控制细胞的减少。牙髓干细胞诱导分化成neuron-like细胞在——和增长factor-free血清培养基培养。

 1。介绍

牙髓组织包含许多类型的细胞包括细胞(如内皮细胞)和(即未提交的细胞。DPSCs)。DPSCs的间充质干细胞(msc) [ 1]。在老鼠身上,大多数从骨髓msc被孤立 2和外周血 3, 4]。这些msc可以通过特定基因的表达特征标记等 CD44, CD73, CD90, CD105, CD117, 存在( 5, 6]。

DPSCs能够区分成multilineage细胞( 7- - - - - - 9)包括neuron-like细胞( 10]。Neuron-like从msc分化细胞来源于骨髓细胞( 11- - - - - - 13和大脑 14]。然而,msc来源于牙髓,也就是说,DPSCs,也能够区分成neuron-like细胞( 10]。从骨髓msc的特点类似于这些细胞来源于牙髓( 11]。这两种类型的msc表达 Cd44, Cd106, Cd146, 存在( 15- - - - - - 17]。

许多因素参与神经元分化包括巢蛋白( 18),tubulin3 (Tub3) [ 19],MAP2 [ 20.]。巢蛋白参与的径向增长轴突在脊椎动物细胞(神经元分化 19, 21]。因此,巢蛋白被称为神经标记,它的存在可以被认为是一个标准的能力分化成神经元( 18, 22]。然而,巢蛋白表达的是其他类型的细胞,如毛囊干细胞( 23),(周围的周 24),内皮细胞( 25)、myofibroblasts和胰腺成纤维细胞( 26]。因此,分析表达式等特定的神经元标记Tub3 [ 27, 28]和MAP2 [ 29日, 30.对神经元确认并发)已经完成。Tub3和MAP2发挥作用在轴突和神经元细胞体的稳定性 20., 31日]。某些生长因子,如表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子,和视黄酸,用于神经感应( 32- - - - - - 35]。二甲基亚砜(DMSO)也用于诱导msc到neuron-like表型的转换 在体外( 12, 13]。本研究的目的是检查DPSCs成neuron-like细胞定向分化的化学感应的缺失。

 2。材料和方法 2.1。牙髓细胞的隔离

切牙牙齿从6 - 8-week-old老鼠在无菌条件下,放置在中包含1 x PBS(σ,美国)。提取的牙髓被1 x PBS含有1% (v / v) penicillin-streptomycin(美国表达载体)。

牙髓组织在4单元1小时孵化胶原酶I型在37°C,其次是几轮酶解集。细胞在1200 g离心10分钟25°C和组成的完全培养基中培养 αmem(美国表达载体)补充20% (v / v)的边后卫(美国擤鼻涕)和1% (v / v) penicillin-streptomycin。细胞1×105细胞/毫升获得放在T25瓶含有完全培养基和培养在一个孵化器有限公司为5%2大气和95%的湿度在37°C。

24小时后,悬浮细胞从媒介,和瓶洗1 x PBS的解决方案。这些细胞被种植在完全培养基confluency直到80%。0.25% (v / v)的溶液trypsin-EDTA(美国σ)是用于分离瓶表面的牙髓细胞接种在另一个在1×10瓶5细胞/毫升。细胞冷冻保存和存储,在第四段放在cryovials包含冷冻剂组成的 αmem, 10% (v / v) DMSO(美国σ)和50% (v / v)的边后卫和存储在液氮中。在这项研究中,所使用的电池在第四段。

 2.2。牙髓干细胞的分化成神经细胞

约1×105细胞转移到24-well板块包含完全培养基和被允许24小时直到依从性生长。中被丢弃,PBS的细胞被洗。细胞被培养在血清和生长因子组成的自由的媒介 αmem和1% (v / v) penicillin-streptomycin 5天。媒介改变了每2 - 3天在这5天的时间。作为一个控制,相同数量的细胞是在完全培养基培养(包括 αmem, 1% (v / v) penicillin-streptomycin, 15% (v / v)胎牛血清)5天。细胞形态监测天2和5的神经元分化使用奥林巴斯相差显微镜。

 2.3。使用rt - pcr分子分析

控制和分化细胞分离使用0.25% (v / v) trypsin-EDTA和离心机在1400克10分钟。美国总RNA提取使用TRI-reagent(σ)根据制造商的协议。spectrophotometrically评估总RNA的纯度在260和280海里,一个260年:一个280年比1.8 - -2.0被认为是可以接受的。大约300 ng的总RNA样本用于每个rt - pcr反应与访问快速rt - pcr系统工具包(美国Promega)。5.0使用底漆总理的引物设计软件程序基于从NCBI获得的序列。引物是总结在表的信息 1。

引物参与rt - pcr实验。

加入基因/没有。 引物 序列 预期的产品尺寸(bp) 退火温度(°C)
Cd146(NM_023061) 向前 5′-GGACCTTGAGTTTGAGTGG-3′ 479年 60
反向 5′-CAGTGGTTTGGCTGGAGT-3′
存在(NM_009655) 向前 5′-AACATGGCGGCTTCAACG-3′ 630年 61年
反向 5′-GACGACACCAGCAACGAG-3′
巢蛋白(NM_016701) 向前 5′-CGCTCGGGAGAGTCGCTT-3′ 215年 64年
反向 5′-CCAGTTGCTGCCCACCTTC-3′
Gapdh(NM_008084) 向前 5′-CAACGGCACAGTCAAGG-3′ 717年 62年
反向 5′-AAGGTGGAAGAGTGGGAG-3′
Tub3(NM_023279) 向前 5′-ACGCATCTCGGAGCAGTT-3′ 125年 61年
反向 5′-CGGACACCAGGTCATTCA-3′
Cd31(NM_001032378.1) 向前 5′-GGTCTTGTCGCAGTATCAG-3′ 355年 58
反向 5′-ATGGCAATTATCCGCTCT-3′

主要使用lamv逆转录酶互补脱氧核糖核酸合成进行了45分钟45°C紧随其后的失活2分钟94°C。变性的放大由30秒94°C,退火60秒,在68°C和扩展了60秒,执行40周期。最后扩展执行步骤7分钟68°C。放大产品分离使用1% (w / v)琼脂糖凝胶电泳、染色,分析。放大产品受到DNA测序和验证使用从NCBI BLASTN程序。至于表达水平分析,共1 μ克总RNA用于每个放大和强度是决定使用在线ImageJ 1.47程序( http://rsbweb.nih.gov/ij/)。

 2.4。MAP2免疫细胞化学的

诱导神经细胞被洗1 x PBS和固定在4°C和4% (v / v)为2小时多聚甲醛。这些细胞被洗3次0.05% PBS-Tween 20 2% PBS-Triton-X 10分钟紧随其后。然后,细胞被洗3次0.05% PBS-Tween 20。细胞被孵化的37°C和10%的山羊血清稀释0.05% (v / v) PBS-Tween 20 + 0.01毫克/毫升BSA孵化前30分钟主要抗体。这个解决方案和初级抗体中移除1:200稀释为0.05% (v / v) PBS-Tween 20 + 3% (v / v)山羊血清和1毫克/毫升BSA添加24小时在4°C。然后,细胞被洗3次为0.05% (v / v) PBS-Tween 20其次是孵化的二级抗体anti-mouse IgG-FITC 30分钟在室温稀释1:50渐变20 + 3% (v / v)山羊血清和1毫克/毫升BSA。最后,这些细胞被洗3次0.05% (v / v) PBS-Tween 20之前使用荧光显微镜分析。消极的控制使用没有神经诱导未分化的细胞,也就是说,在完全培养基培养。

 2.5。(3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)测定

约1×104细胞被播种在96 -孔板和孵化24小时37°C。两组细胞培养:一个在完全培养基(控制)和其他在血清和增长factor-free媒介。之后,24小时孵化,大约20 μL MTT(5毫克/毫升)被添加到每个样本和样本孵化为另一个4 h 37°C。混合物在慢慢消除,200 μL的DMSO溶液添加到每个好,井测量由ELISA板读者在570海里。每个实验重复一式三份。细胞受到MTT试验第一,第三,第五天的神经感应。确定可行的细胞的数量为每个分析使用标准图形创建前的实验。

 2.6。统计分析

差异化的数据,并使用成对的对照组比较 t 16.0.2以及在SPSS程序版本。差异与 P 值< 0.05被认为是具有统计学意义。获得的数据提出了平均(平均±标准差;从三个独立的实验(标准差) n = 3 )。

 3所示。结果 3.1。间充质干细胞在牙髓组织的识别

的身份分离细胞与牙髓组织证实了使用胶原酶能力形成附着殖民地sphere-like集群的细胞(图组成 1)。平均为6.8×104细胞/厘米2被发现能够获得殖民地在完全培养基培养24小时后。然后,悬浮细胞被丢弃,只有贴壁细胞扩大在中。悬浮细胞可能是细胞无法生存的媒介。殖民地开始改变他们的形状在第二段。假设纤维母细胞形态有着悠久、瘦身在第四段,成为支流后2到3天的 在体外文化在完全培养基。

孤立的特点, 在体外大鼠牙髓干细胞。殖民地来源于牙髓在第一段(a) (b)和24小时后的文化。殖民地之后,开始出现变化形状第二通道(c),后成纤维细胞的细胞形状第四段(d)和融合后2 - 3天的文化完全培养基(e)。

分子分析来验证类型的细胞在第四段。从第四段提取的总RNA的牙髓细胞,并进行rt - pcr分析(图 2)。这一分析显示 Cd146和 存在在这些细胞扩增子,而激活的 Cd31没有观察到。的扩增子 Gapdh被发现在牙髓细胞分化前后。分析的表达水平 Cd146和 存在是可以产生 118.0 ± 16.8 %, 77.5 ± 14.3 分别为%,相比 Gapdh(100%)是用于细胞信使rna水平正常化。

激活的间充质干细胞标记。的激活 Cd146(a)和(~ 479个基点) 存在观察(~ 630个基点)(b)只在细胞分化,表明细胞间充质干细胞。 Cd31是灭活前后神经元分化(c)。 Gapdh管家基因(~ 717个基点),是表示微分(d)之前和之后。面板(i)代表未分化的细胞,也就是说,细胞在神经元分化,而面板(2)代表分化细胞,即神经元分化后细胞。

 3.2。形态变化成Neuron-Like MAP2蛋白质的细胞和表达

经过5天的文化中,大多数的细胞形态改变,瘦身的形状(图 3)。细胞质是简约对细胞核和假定一个多极的形状。显示的细胞小,球形,简约的身体和一个锥形细胞质与分支机构,类似于神经神经元胞体轴突和树突。,在神经元胞体树突和轴突的神经细胞表示,分别由一个白色箭头,一个开放的箭头,一个黑色的箭头。大约60%人口-70%的细胞分化成neuron-like细胞,表明分化发生由于缺乏血清和生长因子,但不是因为自发分化。DPSCs表达特异性神经元蛋白质标记MAP2经过5天的文化,增长factor-free血清培养基(图 3)。然而MAP2并非DPSCs中发现或没有神经诱导未分化的细胞,也就是说,在完全培养基培养(负控制(图) 3)。

分化细胞的特征。Neuron-like细胞出现在牙髓干细胞((a)、(b)) 5天后神经感应,(c),神经元胞体,树突和轴突的神经元表示,分别由白色箭头,打开箭头,黑色的箭头(d)。对神经元标记MAP2免疫荧光染色后进行5天的神经感应((e), (f))。MAP2标记中没有检测到DPSCs没有神经感应,也就是说,消极的控制(g)。

 3.3。激活神经元标记

细胞的表达 Cd146 +, 存在 +, Cd31 −在分化之前。rt - pcr分析显示的存在 巢蛋白在细胞扩增子(~ 215个基点),之前和之后的区别。然而,强度 巢蛋白激活后明显高于分化而分化之前(图 4(一))。的扩增子 Tub3(~ 125 bp)神经分化的观察后第五天(图 4 (b))。 Tub3后被证明是激活神经元分化的5天。 Gapdh作为一个积极的控制前后的区别。一个 Gapdh扩增子(~ 717个基点)被发现在细胞分化,之前和之后都表明 Gapdh在这两种类型的细胞(图保持激活 4 (c))。

激活特定的神经元标记。的激活 巢蛋白(a)和(~ 215个基点) Tub3(~ 125个基点)(b)表明,细胞分化成神经元。 Gapdh管家基因(~ 717个基点),之前和之后的区别(c)被激活。面板(i)代表未分化的细胞,也就是说,细胞在神经元分化,而面板(2)代表分化细胞,即神经元分化后细胞。

 3.4。牙髓干细胞的增殖分化

细胞可行性研究进行了评估的扩散能力分化和未分化细胞在神经元分化。控制和分化细胞的数量明显( P < 0.05 文化)在分化与天相比增加0(图 5)。然而,细胞的增殖能力逐渐开始改变24小时后神经分化的文化,直到第五天,剩下控制细胞的数量更高。这两种类型的细胞保持其增长率在最初24小时内,文化。然而,分化细胞24小时后显示减少的增长率而未分化细胞(控制)保持增长速度,导致一个可行的细胞数量的增加。统计分析显示显著差异( P < 0.05 )细胞两种细胞之间的天数(图3和5的文化 5)。

在定向分化细胞的生存能力。控制的可行性(未分化的细胞培养在完全培养基)与分化细胞在——和增长factor-free血清培养基培养。的数字控制和分化细胞在分化与天相比显著增加0的文化。结果概括为均值±SD。统计学意义16.0.2决心使用SPSS程序版本。*统计分析显示显著差异( P < 0.05 3和5)可行的细胞在天文化比控制。

 4所示。讨论

形成纤维母细胞形态在第四段。分子分析显示 Cd146和 存在扩增子但不 Cd31纤维母细胞被验证,msc,而非造血干细胞。 Cd146和 存在间充质干细胞标记( 36, 37]。 Cd146是一个早期的牙髓组织中表达间充质干细胞标记( 36]。 存在细胞粘附分子,扮演着重要的角色在紧密的细胞间的相互作用和调控msc分化( 38]。而 存在是表达各种各样的组织,它通常局限于细胞参与过程的动态增长的子集和/或迁移,包括神经发育和免疫反应( 39]。的扩增子 Gapdh发现DPSC分化之前和之后都表示 Gapdh在这两种类型的细胞中表达。

确认DPSCs到神经元的分化表型,并证明这种区别并不是一个人工制品,三个分析:形态学变化,表达MAP2,激活神经元标记。经过2天的文化,大多数的细胞像多极神经元。然而,一些纤维母细胞与广泛的形态仍在人群中观察到。我们建议DPSCs改变逐渐分化成neuron-like细胞5天后在——和增长factor-free血清培养基培养。DPSCs从不同组织分化成神经细胞通过显示神经元形态( 40, 41),类似于我们的观察。因此,形态分析表明,DPSCs与牙髓组织分化成神经元。

rt - pcr分析显示的存在 巢蛋白扩增子。 巢蛋白在成年大鼠和人类大脑神经元标记( 42]。这两个 巢蛋白和 Tub3也用作标记探讨在小鼠的海马神经元分化DPSC植入( 43]。的表达式 巢蛋白和 Tub3分化后表明,DPSCs分化成神经细胞。巢蛋白中间丝的发现在脊椎动物细胞的细胞骨架 19, 44]。 巢蛋白表达式是用来跟踪扩散,迁移和神经干细胞的分化。 Tub3是所有真核细胞中表达。它有利于微管稳定在神经细胞和轴突运输中扮演了重要的角色。在目前的研究中, Tub35天的神经分化后被激活。 Gapdh作为一个积极的控制前后的区别。 Gapdh管家基因,一直是所有哺乳动物细胞激活是否由未分化或分化细胞( 45]。这是用来确定RNA孤立DPSCs质量和规范化mrna的水平。一个 Gapdh扩增子被发现在细胞分化,之前和之后都表明 Gapdh在这两种类型的细胞保持激活。

巢蛋白激活神经元分化期间增加。 巢蛋白是纤维牙髓组织内表达,然而,它的表达仍然是被大多数DPSCs后神经感应;的表达 巢蛋白当细胞分化成神经元(提高 28]。MAP2和 Tub3后才表达神经元分化,因此利用成熟的神经元细胞的标记在成长的最后阶段 46- - - - - - 48]。MAP2-positive神经细胞已被证明是成年神经细胞产生的神经感应。不同的表达 巢蛋白在几个细胞类型,如毛囊干细胞,内皮细胞,周围的周myofibroblasts,胰腺成纤维细胞 巢蛋白没有特定的神经元( 23- - - - - - 26]。然而,结合 巢蛋白表达与其他神经标记的表达,也就是说, Tub3MAP2,可以支持神经元分化。此外,描述neuron-like细胞的形态分析还显示一个积极的结果。

而FGF等生长因子和视黄酸曾在以前的研究中,神经感应在目前的研究仅仅通过不含血清诱导和生长因子完全培养基。我们的观察 Tub3和 巢蛋白激活、neuron-like细胞形态学和MAP2表达式提供证据老鼠牙髓干细胞的定向分化成neuron-like细胞——和增长factor-free血清培养基。

的增殖分化细胞继续尽管他们的增长率低于对照组。从理论上讲,增殖,分化的细胞不能同时发生。信号暗示协调这两个过程在很大程度上是未知的。然而,细胞分化和增殖监管独立但同时,通常细胞开始分化之前就停止分裂,并且开始分化并不局限于任何特定的细胞周期( 49, 50]。在目前的研究中,分化的细胞开始分裂缓慢经过24小时的文化,直到结束的分化时期,表明细胞进行分化后神经元分化诱导。虽然细胞的数量增加的诱导分化,减少细胞随后显示增长率和集中在分化过程。

能力的成体干细胞分化成不同生殖细胞层或细胞谱系分化转移。干细胞从骨髓起源于中胚层被证明能够分化成肝、肺、胃肠道和皮肤细胞来源于内胚层、中胚层( 51]。外周血干细胞(造血干细胞)也被发现能够分化成成熟的细胞并非起源于造血细胞如肝、皮肤上皮细胞,胃肠道细胞( 52]。细胞微环境发生的变化,如增加在某些生长或分化的因素 在体外细胞培养被发现能够诱导分化转移( 53]。删除血清也是导致这分化转移,因为增加的血清培养基允许增长和维护细胞和防止胚胎干细胞分化成神经细胞( 54]。在这项研究中,缺乏血清和生长因子在文化可能导致DPSCs分化转化成neuron-like细胞。

 5。结论

牙髓干细胞诱导分化成神经细胞在——和增长factor-free血清培养基培养。

 作者的贡献

Shahrul Hisham。Ariffin是这个项目的主管。他设计了实验和细胞特征线。Shabnam Kermani进行了实验。Intan Zarina Zainol Abidin分析数据和纠正和改写。Megat阿卜杜勒瓦哈卜的一席话激怒设计实验和分析数据。山本Zulham写道。Sahidan Senafi和Zaidah。Ariffin分析数据和纠正。穆罕默德阿卜杜勒拉扎克实验设计和研究方法。所有作者都阅读和批准。

 确认

这个研究项目资助德意志联邦共和国/ 1/2011 / SG / UKM / 02/13和尔格02/5 / 1/2012 / SKK11 / UKM /马来西亚和中国高等教育的UKM - dlp - 2012 - 025, UKM dlp - 2012 - 001,民进党从马来西亚Kebangsaan大学- 2013 - 024。

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