的影响在体外常用于AMD治疗的皮质类固醇药物对间充质干细胞的影响

抽象

年龄相关性黄斑变性（AMD）是在个人超过60岁，其特点是视网膜色素上皮细胞的功能障碍法定失明的主要原因，特别是在黄斑区。尽管几个治疗方案，AMD治疗仍然困难，特别是渗出性AMD。多能间充质干细胞（MSC），具有很大的塑性和immunomodulant特性，是用于细胞治疗和组织工程的有前途的细胞来源。我们评估的类固醇药物的效果，通常用于治疗AMD，联想在利用MSC，鉴于可能的应用程序一起治疗AMD。形态学，viability, growth kinetics, and immunophenotype were evaluated on healthy donors’ MSCs, treated with triamcinolone acetonide, alcohol-free triamcinolone acetonide, micronized intravitreal triamcinolone and dexamethasone at different concentrations, and in a human retinal pigment epithelial cell line supernatant (ARPE-19). The morphological analysis of MSCs in their standard medium showed a negative correlation with drug concentrations, due to the numerous crystals. Dexamethasone was the least toxic corticosteroid used in this study. ARPE-19 seemed to help cells preserve the typical MSC morphology. In conclusion, this在体外研究表明，高剂量的皮质类固醇药物对间充质干细胞有负面影响，在条件培养基中会降低。

1.简介

在发达国家，年龄相关性黄斑变性(AMD)是导致60岁以上人群合法失明的主要原因[1]。它的特征是视网膜色素上皮(RPE)细胞的功能障碍，特别是在黄斑区域。结果，碎片在这些细胞内聚集并形成drusen，即Bruch膜和RPE之间的蛋白质和脂质的分离沉积，[2]。其次，感光细胞退化，由于RPE功能及营养支持的损失。两种类型的AMD是已知的。干性或非渗出形式占所有病例的大约90％，并且它的特点是视觉功能的渐进性损失高达地图状萎缩的发展。湿或渗出形式与脉络膜新生血管的发展（CNV），导致突然和剧烈的中央视觉活动丧失有关。

干燥型的治疗方法很少，主要包括高剂量的抗氧化剂抗坏血酸(维生素C)、生育酚(维生素E)和-胡萝卜素的口服组合，以及铜和锌。因此，AMD的治疗方法几乎都集中在渗出型，对大多数患者的疗效有限。尽管最近出现了几种治疗方法，AMD的治疗仍然很困难，尤其是渗出性AMD。

光动力疗法利用了产生的选择性细胞毒性作用引起的病理上的血管非热光血栓形成[3，4]。皮质类固醇在治疗新生血管病变方面有许多积极作用，具有很强的抗炎、抗增殖和抗血管生成作用[五可能还有助于限制光动力疗法引起的一些不良事件。在眼科，尽管它们的治疗好处，副作用，包括眼毒性，已经观察到，特别是当眼内分娩使用。

常规类固醇药物，如曲安奈德(9a-fluoro-16a-羟基强的松龙，TA)，一种具有强效抗炎特性的合成晶体类固醇，Vitreal内曲安奈德(IVT)，一种批准用于外科手术的微化制剂，以及Ozurdex (Allergan, Inc.)。(美国加州尔湾)，一种含有0.7 mg地塞米松的药物配方，通过眶周注射用于眼科治疗，现在是渗出性AMD和增殖性玻璃体视网膜病变的辅助治疗[6-9]。

除了为AMD的标准治疗，新兴的疗法，例如干细胞疗法正在开发中。干细胞移植是治疗退行性疾病，如视网膜色素变性，斯特格氏病，AMD和其他视网膜变性仍处于大多数情况下无法治愈的有前途的方法。

多能间充质干细胞(MSCs)可塑性强，是一种很有希望用于细胞治疗和组织工程的细胞来源[10，11以及向宿主组织提供生长因子或调节宿主免疫系统的能力[12]。的MSC可以很容易地从骨髓分离归功于它们的容量粘附和增殖并在培养扩大，同时保持他们的免疫表型特征和功能作为多能细胞[13]。它们还可以产生多种细胞因子，生长因子和粘附分子，其影响造血微环境的重要因素。

MSCs还具有免疫抑制作用，并分泌神经营养因子[14，对小胶质细胞和星形胶质细胞具有抗炎、抗增殖作用，诱导形成神经保护微环境[15]。他们可以安全地培养在体外没有恶性转化的风险[16]。

在体外和在活的有机体内研究表明，可分化为视网膜神经元[17]， MSCs的视网膜下移植可以延缓视网膜变性，保持视网膜功能[18]。Inoue证实，MSC移植到RCS大鼠视网膜下间隙(一种视网膜变性模型)可以延缓视网膜变性并保留RCS大鼠的视网膜功能，提示MSCs是一种有用的细胞来源，可用于某些形式的视网膜变性的细胞替代治疗[19]。此外，在将脐带间充质干细胞注射到RCS大鼠视网膜下间隙后，证明其可有效维持视觉功能数月[20]。

由于缺乏对干性AMD的治疗，和治疗湿性AMD的耗时和昂贵的性质，AMD是干细胞治疗应用的一个完美的候选人。以前对其他nonocular疾病的研究已经测试了与皮质类固醇组合使用的干细胞，指向上的细胞粘附，增殖，生存力和积极效果。皮质类固醇可诱导细胞命运和分化级联，在临床和基础科学经验的有力证据。因此，这些药物可以根据复杂的环境条件刺激MSCs的增殖和分化[21，在诱导细胞命运和干细胞分化级联培养中发挥重要作用。探索这些药物对间充质干细胞的影响有望揭示干细胞生物学的重要细节，并在寻找可能的治疗应用的新领域。

为了评估与常规类固醇相关的MSCs的可能性治疗AMD，在这项研究中，我们评估的类固醇药物的效果，很常见的药物通常用于治疗AMD，在与MSC关联。我们测试的形态，活力，生长动力学和免疫。

2.材料和方法

2.1。骨髓间充质干细胞的分离与扩增

骨髓(BM)取自健康捐赠者的骨髓(BM)成人或儿童高加索捐赠者的髂骨骨髓(BM)，这些捐赠者在知情同意的情况下为相关患者采集骨髓。整个BM在Percoll (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)梯度(密度:1.073 g/mL)上分层，1100 g离心30分钟。间期细胞用PBS1X洗涤2次(200 g, 10分钟)，以800,000/cm密度接种²以胎牛血清(胎牛血清，Lonza，瑞士巴塞尔)的10%在75或150 cm的间充质干细胞培养基中(Lonza, Basel, Switzerland)²t型烧瓶(猎鹰型)，在5% CO的大气中保持37℃₂。3天后，去除非贴壁细胞，每3-4天重新培养一次。汇合后约15天，37℃用胰蛋白酶/EDTA (Lonza)分离粘附的单层，分离5分钟，37℃用胰蛋白酶中和液(Lonza)阻断胰蛋白酶作用5分钟。然后细胞以8000 /cm的密度被播种²每7天分离2-3次，使离体细胞扩大。

根据国际学会细胞治疗（ISCT）引导线[的MSC进行表征13]。为了测试间充质干细胞的分化潜能，我们将间充质干细胞培养在成骨、成脂和成软骨介质中，并按照之前的报道进行分析[22]。

2.2。毒品

测试曲安奈德(TA、Kenacort、Bristol-Meyers Squibb)、无酒精曲安奈德(AF-TA, TA微滤和生理溶液稀释获得)、玻璃体内微化曲安奈德(IVT, Sooft Italia)、地塞米松21-福斯福二氧嘧啶(Dex, Decadron磷酸盐，Merck Sharp & Dohme)在体外at different concentrations (0.01 mg/mL, 0.1 mg/mL, and 1.0 mg/mL).

2.3。药品评价对MSCs

间充质干用后4传代培养的药物在不同浓度的种子。24，72小时，5天，形态，活力和免疫后，通过细胞荧光分析来评价。

2.4。视网膜细胞存在时间充质干细胞的药物评价

的人视网膜色素上皮细胞株ARPE-19 [23) (ATCC, LGC标准;(意大利米兰)在火腿的F12 (DMEM/F12)中保留了Dulbecco改良的Eagle 's medium。37℃条件下，胰蛋白酶/EDTA (Lonza)每5 - 7天将细胞分离5分钟，收集上清液(SN)，过滤后储存于−20℃。

用50%或100%的ARPE-19 SN培养2-4代间充质干细胞，每3-4天更换培养基培养。

我们评估的类固醇药物的毒性不同浓度的MSC上具有或不具有视网膜细胞培养ARPE-19的50％或100％的浓度的上清。24，72小时，5天，形态，活力和免疫后，通过细胞荧光分析来评价。

2.5。MSC分析

immunophenotype分析msc是由200000个细胞流式细胞术,是孵化20分钟在4°C与荧光素- (FITC)或phycoerytrin (PE)共轭单克隆抗体anti-CD45, CD14(美国加利福尼亚州圣何塞,正欲),CD90、CD29, CD73,和CD105 (Caltag实验室、伯林盖姆、钙、美国),作为ISCT指南建议(13]。PBS 1X洗涤1次，重悬200次μPBS 1X的L和上的Epics-XL流式细胞仪（Beckman Coulter公司，CA，USA）进行分析。阳性细胞的百分比是使用与Ig的FITC / PE染色作为阴性对照的细胞来计算。

2.6。免疫荧光

在ARPE-19 SN培养液中培养的骨髓间充质干细胞在7天和14天后，用免疫荧光法对视网膜标记物RPE65、视蛋白和PKC进行评估。

在−20℃条件下，用丙酮-甲醇(1:1)固定并渗透细胞20分钟。PBS 1X(比利时Cambrex)洗涤固定细胞，0.1%人白蛋白(HSA)在PBS中室温(RT)抑制非特异性结合1小时。将细胞与抗RPE65(小鼠)、抗opsin(兔)和PKC(兔)一抗孵育，然后与抗CY3(免疫科学，罗马，意大利;或AlexaFluor 488偶联抗小鼠(1:500,Southern Biotechnology, AL, USA)。计数阳性细胞并与4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI，分子探针)标记的总细胞计数进行比较。细胞在epifluorescence显微镜下检查(Axiovert 200, Carl Zeiss, AG，德国)，AxioVision Rel 4.2 (Carl Zeiss, AG，德国)分析。放大20倍e 40倍。

3.结果

从BM中分离骨髓间充质干细胞，根据ISCT导联进行鉴定(图)1)。为了通过与常规的类固醇相关的MSC，以评估可能性治疗AMD，我们测试了形态，生存能力，生长动力学和免疫表型，然后将其上用不同药物处理的MSC评估，（TA，AF-TA，IVT，和地塞米松）。

3.1。形态学

相衬显微镜显示了TA晶体的结块。对间充质干细胞培养基中的间充质干细胞的形态学分析显示，其毒性与药物浓度有关，这是因为细胞中存在大量晶体，特别是当细胞被1 mg/mL AF-TA处理时。同样的现象在酒精溶液中72小时5天后也很明显，在1mg /mL的剂型(含和不含酒精)中表现得更为明显。与TA相比，1mg /mL IVT，尤其是Dex，形态得到了更好的保存，析出物也更少(图)2)。

当的MSC维持药物和ARPE-19 SN，形态学分析揭示药物结晶的一个较小的存在（图3)。

3.2。可行性

TA showed no toxic effects at 0.01 mg/mL: viability was 94.20%, 97.10%, and 98.50% after 24, 72 hours, and 5 days, respectively. TA 0.1 mg/mL involves a fall of viability at 24 hours (65.50%) and a restoration of cultures after 72 hours (91%) and 5 days (93%).

在0.01 mg/mL时，AF-TA的存活率略有下降，而在0.1 mg/mL时，24小时和72小时后存活率分别下降到76.50%和77%，5天后恢复。

IVT在0.1和1 mg/mL培养5天后才有毒性。

地塞米松在1 mg/mL浓度下，24和72小时后毒性很强，而在0.01 mg/mL和0.1 mg/mL浓度下，每次分析时细胞仍能存活。所有这些数据都显示在图中4。

3.3。生长动力学

MSC的细胞扩增的生长速率通过细胞计数在每个通道中的BURKER室评估和的倍数增加表示。

所有药物对细胞生长产生负面影响。Dexamethasone inhibits MSC growth rate especially at 0.1 and 1 mg/mL after 5 days’ culture ()(图五)。

3.4。免疫表型

在实验过程中，间充质干者为造血抗原（CD34，CD45和CD14）阴性，并且表达CD90，CD105，CD29高百分比，和CD73（数据未示出）。免疫表型analysis showed a negative effect, after 24 hours of TA and AF-TA on mesenchymal antigen expression, mostly at 0.1 mg/mL. However, after 72 hours and 5 days of culture there is a restoration of antigen expression, with slight decreases on the fifth day. IVT at 1 mg/mL exposition induced a decreased expression of MSC antigens after 24 hours ()，以及72小时零5天后。地塞米松对抗原的表达没有负面影响。然而，即使在24小时后，1 mg/mL的药物也会导致细胞形态的改变，无法进行细胞荧光分析。

3.5。免疫荧光

培养的MSC与ARPE-19 SN通过免疫荧光分析视网膜标记RPE65，视蛋白，和PKC的表达进行评价，之后第7和14天。数字6示出，在14天后，基底的MSC表达视网膜标志物水平相媲美ARPE 19细胞的，用作对照。

3.6。视网膜细胞存在时间充质干细胞的药物评价

在以前的结果，我们决定测试的基础，如果在“视网膜像微环境”就有可能观察到的体液物质对MSCs的保护作用。到这些目的，我们测试了MSC和类固醇药物的先前描述的培养条件，使用从所述视网膜细胞系ARPE-19获得的条件培养基。我们还测试条件培养基的不同百分比。在ARPE-19 SN的存在，存活率与所有药物更好。With TA, the effect of ARPE-19 SN was evident at 0.1 mg/mL after 24 hours, with AF-TA at 0.01 mg/mL after 24 and 72 hours. There was no effect on IVT and dexamethasone, but, at 1 mg/mL, the toxic effect after 24 and 72 hours was mitigated after retinic SN exposure (Figure7)。当SN的效果是明显的，这是SN高50％，比SN的100％。

As far as cellular growth is concerned, in the presence of TA, the most advantageous condition was at 0.1 mg/mL with 50% of SN. With AF-TA 0.01 mg/mL the effect of SN was positive in the presence of 100% SN, while at 0.1 mg/mL the best effect was with 50% SN. With IVT, the cellular growth was advantageous at 0,01 and 0,1 mg/mL in the presence of SN 50%, and at 1 mg/mL with 100% SN. The effect of 50% SN on cultures with Dexamethasone was positive at 0,01 and 0,1 mg/mL (Figure8)。骨髓间充质干细胞在IVT或地塞米松存在下的生长似乎与培养微环境(骨髓间充质干细胞培养基与ARPE-19 SN相比)更相关，有50% SN的存在更有利。

骨髓间充质干细胞抗原的表达在ARPE-19 SN存在时没有变化。

4.讨论

在再生医学中使用间充质干细胞是一种很有前途的治疗方法，用于治疗以视网膜上皮色素沉着细胞和光感受器缺失为特征的疾病，如AMD。干燥型AMD的治疗方法很少，而渗出型AMD的治疗方法耗时、昂贵，而且对大多数患者的疗效有限。因此，以细胞为基础的治疗的可能范围是相当大的。AMD是一个理想的候选干细胞治疗应用，以取代缺失的细胞或延迟其退化。本研究旨在观察骨髓间充质干细胞在不同培养基中的行为，并结合临床常用皮质类固醇药物，评估其毒性，进而突出其有益剂量。之前对其他非眼部疾病的研究测试了干细胞与皮质类固醇的联合使用，指出了对细胞粘附、增殖和生存能力的积极作用。

这些药物可能会根据复杂的环境条件刺激间充质干细胞的增殖和分化[21]。然而，我们对皮质类固醇引导的启动这一过程的最初事件知之甚少。因此，探索这些药物对间充质干细胞的影响有希望揭示干细胞生物学的重要细节，并发现可能的治疗应用的新领域。

在本研究中，我们评估了不同浓度的曲安奈德(含或不含酒精)、微化玻璃体腔曲安奈德和地塞米松在伴有或不伴有视网膜细胞培养上清ARPE-19的间质干细胞上的毒性，研究了它们的形态、生存能力、细胞生长和免疫表型。

数据表明，皮质类固醇药物培养的间充质干细胞保持其特有的特性，尽管生存能力受到损害。这些数据与Shaikh对ARPE-19细胞的研究相吻合，报告了TA浓度和细胞损失之间的相关性[8，以及Oh的研究表明，即使短时间暴露于TA也会抑制成纤维细胞和RPE细胞的增殖，对融合的RPE细胞产生明显的毒性[7]。

我们对形态、生存能力、细胞生长和免疫表型研究的数据评估显示，在相同浓度和相同培养条件下，三种药物的存在下，MSCs表现出不同的行为。数据显示，药物的毒性作用，主要是由于较高的浓度。

所有的药物相比，地塞米松是在这个研究中使用的毒性最小的皮质类固醇。地塞米松是在严重的炎症性疾病与间充质祖细胞分化成成骨细胞的积极影响的治疗中频繁使用的糖皮质激素的合成。在我们的研究中，地塞米松在低浓度是毒性最小的药物，根据从宋和丹尼斯的研究数据[24，表明地塞米松可以减少或消除间充质干细胞上与细胞密度相关的凋亡。

微环境也很重要。使用ARPE-19视网膜细胞培养的SN是企图创建在其中，研究MSC的特性和药物在MSC培养基的对照培养物相比较的效果的特定微环境。的皮质激素类药物的存在和缺乏的培养基典型的MSC（100％SN）的，是第一个，对细胞生长的制动器，而且还促进分化的因子。5天后，对生长的MSC的最有利的条件是培养视网膜SN 50％，不考虑所使用的药物。与100％相比SN 50％SN的最有益的作用可能通过考虑一个缺乏的MSC，可能会限制细胞生长的标准培养基中，但促进分化视网膜方向进行说明，通过组织特异性环境的存在有利于。我们的研究似乎也证实了特定细胞外的环境能保护的MSCs药物中毒。

ARPE-19细胞系SN的存在50％和100％，那么由视网膜细胞释放营养因子的存在，似乎帮助细胞以更好地保留典型形态，并与标准培养基中的沉淀物均较低。

免疫荧光染色法的使用使我们能够识别特定的标记的表达表达的视网膜色素上皮细胞(RPE65,视蛋白和PKC)在msc培养视网膜SN,证明有实际向视网膜谱系分化潜力有一个合适的环境。关于间充质干细胞分化潜能的研究存在争议。尽管有一项研究发现间充质干细胞分化成类似小胶质细胞的细胞，而不是视网膜神经元[17，其他研究表明间充质干细胞分化为视网膜神经元在活的有机体内和在体外[18]。此外，动物研究也表明，MSCs视网膜下移植可以延缓视网膜变性，保持视网膜功能[19]。

间充质干可能是在细胞治疗有用，特别是通过生产的神经营养因子的功能丧失减缓和促进感光生存。间充质干似乎证实在支持细胞扩增，免疫和神经细胞激活作用。所有这些功能可能会被同时使用的具体药物，如糖皮质激素的支持。

在这项研究中测试的皮质激素类药物诱导细胞死亡，仅在高浓度。细胞生长，生存力和MSC的功能特性是在低浓度的药物的存在下良好。

近日，有报道证明自体骨髓单个核细胞的玻璃体内给药的临床可行性治疗晚期退行性视网膜病变[25，26]。Siqueira进行了一项前瞻性I期试验，研究玻璃体腔ABMC对RP或锥棒型营养不良患者的安全性，结果很有希望[27]。

我们的在体外研究表明，高剂量皮质类固醇药物对间充质干细胞有负面影响。在低药理学剂量和条件培养基存在的情况下，这种效应被降低。我们需要进一步的研究来改进我们的在体外要了解间充质干细胞与视网膜细胞相互作用的机制，还需要进行研究和新药试验。最后，为了将来的临床应用，在活的有机体内研究是研究MSC用于治疗AMD的潜在作用需要。

利益冲突

作者没有任何利益的实际潜在的冲突。

致谢

作者也感谢Andrew Martin Garvey, BA (Hons)， LTCL (TESOL)， PGCPolSci的编辑协助。这项工作是由雷金·皮埃蒙特支持的。

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