SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 946090年 10.1155 / 2012/946090 946090年 研究文章 的影响 在体外AMD的皮质类固醇药物,通常用于治疗,间充质干细胞 Nuzzi 拉斐尔 1 Gunetti 莫妮卡 2 Rustichelli 黛博拉 2 Roagna 芭芭拉 1 Fronticelli Bardelli 弗朗西斯卡 1 Fagioli 语言 2 费列罗 伊凡娜 2、3 比亚吉 埃托雷• 1 部门的临床病理生理学 眼科节 都灵大学10126年都灵 意大利 unito.it 2 儿科Onco-Hematology 干细胞移植和细胞疗法 Regina玛儿童医院 10126年都灵 意大利 unito.it 3 儿科 都灵大学 广场波罗尼亚94年 10126年都灵 意大利 unito.it 2012年 7 4 2012年 2012年 21 02 2012年 25 03 2012年 2012年 版权©2012拉斐尔Nuzzi et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

年龄相关性黄斑变性(AMD)的一个主要原因是合法的失明的人超过60岁,表现为视网膜色素上皮细胞的功能障碍,特别是在黄斑区。尽管一些治疗方案,AMD疗法仍然是困难的,尤其是对渗出性老年性黄斑病变。多能间充质干细胞(msc),以极大的可塑性和immunomodulant属性,是一种很有前途的细胞治疗和组织工程的细胞来源。我们评估的影响类固醇药物,通常用于治疗AMD,与msc,在视图的应用程序对AMD。形态、生存、生长动力学,immunophenotype评估健康捐献者msc、去炎松醋酸酯处理,不含酒精去炎松醋酸酯,微缩intravitreal去炎松和地塞米松在不同浓度,而在人类视网膜色素上皮细胞系上层清液(ARPE-19)。msc在标准媒介的形态分析与药物浓度呈负相关,由于大量晶体。地塞米松是至少在这项研究中使用的有毒皮质类固醇。ARPE-19似乎帮助细胞保护典型的MSC形态。总之,这 在体外研究表明,高剂量的类固醇药物对msc有负面影响,减少在媒体的存在条件。

 1。介绍

年龄相关性黄斑变性(AMD)是法定失明的主要原因在发达国家在个人超过60岁 1]。它的特点是视网膜色素上皮(RPE)细胞的功能障碍,特别是在黄斑区。因此,碎片聚集在这些细胞并形成黄斑,离散的蛋白质和脂质布鲁赫膜和RPE之间,( 2]。其次,感光细胞退化,由于RPE的损失函数和营养支持。两种类型的AMD是已知的。干或non-exudative形式占所有病例的90%,它的特点是一个逐渐的进步和损失的视觉功能的发展地理萎缩。湿或渗出性形式与脉络膜新生血管(CNV)的发展导致突然戏剧性的中央视觉活动的损失。

很少有治疗方案的干燥的形式,主要包括大剂量的口服抗氧化剂抗坏血酸(维生素C)的组合,生育酚(维生素E)和β-胡萝卜素,除了铜和锌。因此,AMD的治疗方法几乎完全集中在渗出性形式和对大多数病人只有有限的好处。尽管最近出现的一些治疗方法,AMD的治疗仍然是困难的,尤其是对渗出性老年性黄斑病变。

光动力治疗利用选择性细胞毒性效应导致的生产非热能的photo-thrombosis病理血管( 3, 4]。糖皮质激素有许多积极作用治疗新生血管性病变,有强大的抗炎、抗增殖、antiangiogenetic行动 5),也可能是有用的限制一些光动力治疗引起的不良事件。在眼科,尽管治疗好处,副作用,包括眼部毒性,特别是当观察到眼内交付使用。

传统类固醇等药物去炎松醋酸酯(9 a-fluoro-16a-hydroxyprednisolone, TA),合成晶体皮质类固醇与强大的抗炎作用,内部Vitreal去炎松(溶),手术使用的粉末配方批准,和Ozurdex(爱力根公司欧文、钙、美国),制药配方0.7毫克的地塞米松,用于眼科治疗眶周的注入,今天代表的辅助治疗渗出性AMD和增生性玻璃体( 6- - - - - - 9]。

除了标准的治疗AMD、新等新兴疗法干细胞疗法正在研制。干细胞移植是一种很有前途的方法色素性视网膜炎等退化性疾病,黄斑变性疾病,AMD和其他视网膜变性,在大多数情况下仍是无法治愈的。

多能间充质干细胞(msc)是一个有前途的细胞来源细胞治疗和组织工程,因为他们的伟大的可塑性 10, 11),能够提供给宿主组织生长因子或调节宿主免疫系统( 12]。msc可以很容易地从骨髓中分离由于他们坚持和增殖能力,扩大文化,同时保持其immunophenotypical特点和功能的多功能细胞( 13]。他们还可以产生多种细胞因子、生长因子和粘附分子,所有重要的造血微环境因素的影响。

msc也起到免疫抑制作用,分泌神经营养因子( 14),有抗炎和抗增殖影响小胶质细胞和星形胶质细胞,导致神经微环境的诱导( 15]。他们可以安全地培养 在体外没有恶性转化的风险( 16]。

在体外和 在活的有机体内研究表明,msc能分化成视网膜神经元( 17),sub-retinal移植msc延迟视网膜变性和保护视网膜功能的 18]。井上证明MSC移植到sub-retinal空间的RCS大鼠视网膜变性(模型)延迟视网膜变性和保留在RCS大鼠视网膜功能,表明MSC是一个有用的细胞来源替代疗法对于某些形式的视网膜变性( 19]。此外,umbilical-derived间充质干细胞维持视觉功能实验证明有效的几个月后注入的sub-retinal空间RCS大鼠( 20.]。

由于缺乏治疗干性AMD,治疗湿性AMD的耗时和昂贵的性质,AMD是一个完美的候选人干细胞疗法的应用。以前的研究为其他nonocular疾病检测干细胞结合糖皮质激素的使用,指出积极的对细胞粘附的影响,增殖和生存能力。糖皮质激素可以诱导细胞分化命运和瀑布,强有力的证据在临床和基础科学的经验。这些药物可能会因此刺激msc的增殖和分化根据复杂环境条件( 21),在诱导细胞命运起着关键作用的干细胞和分化瀑布文化。探索这些药物的影响在msc承诺在揭示干细胞生物学的重要细节和可能的治疗寻找新的领域的应用。

为了评估的可能性将AMD msc与传统的类固醇,在这项研究中,我们评估的影响类固醇药物,很常见的药物通常用于治疗AMD,与msc。我们测试了形态、生存、生长动力学和immunophenotype。

 2。材料和方法 2.1。隔离和msc的扩张

msc是孤立的从骨髓(BM)收集健康的捐赠者的骨髓(BM)收获髂骨的成年人或儿童白种人捐赠者进行了骨髓后收集相关病人书面知情同意。整个BM分层Percoll(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)梯度(密度:1.073克/毫升)和离心机在1100 g 30分钟。细胞的间期与PBS1X洗两次10分钟(200克)和播种密度800000 /厘米2在MSC介质(Lonza、巴塞尔、瑞士)的10%胎牛血清(75年的边后卫,Lonza)或150厘米2T-flasks (Falcon)和维持在37°C和5%公司的氛围2。3天后,不依从细胞被移除和文化re-feeded每3 - 4天。融合,大约15天之后,坚持单层是分离与胰蛋白酶/ EDTA (Lonza) 5分钟37°C,和胰蛋白酶的行动被胰蛋白酶中和解决方案(Lonza) 5分钟37°C。细胞被播种密度的8000 /厘米22 - 3段和分离每7天为了扩大孤立的细胞。

msc是根据国际社会特征的细胞治疗(ISCT)指导行 13]。测试MSC分化潜力,MSC在成骨的培养,脂肪形成的,chondrogenic媒体先前报道得和分析( 22]。

 2.2。药物

去炎松醋酸酯(TA, Kenacort、施贵宝公司),不含酒精去炎松醋酸酯(AF-TA,通过微量过滤TA和稀释在生理溶液),微缩intravitreal去炎松(早期,意大利Sooft)、地塞米松21-fosfato disodico(敏捷、Decadron磷酸盐,默克公司& Dohme)进行了测试 在体外在不同浓度(0.01毫克/毫升,0.1毫克/毫升,和1.0毫克/毫升)。

 2.3。药物评价msc

msc被播种后与不同浓度的药物4文化通道。72小时后,24日,5天,形态学,可行性,immunophenotype被cytofluorimetric分析评估。

 2.4。药物评价msc的视网膜细胞

人类视网膜色素上皮细胞系ARPE-19 [ 23)(写明ATCC LGC标准;意大利米兰)是维护在杜尔贝科修改鹰的介质在火腿的F12 (DMEM / F12)。这些细胞被分离每隔5 - 7天与胰蛋白酶/ EDTA (Lonza) 5分钟37°C,和上层清液(SN)收集、过滤和储存−20°C。

msc在2 - 4通道培养有50%或100% ARPE-19 SN和维护文化改变介质每3 - 4天。

我们评估在不同浓度的类固醇药物的毒性msc有或没有的上层的视网膜细胞培养ARPE-19浓度为50%或100%。72小时后,24日,5天,形态学,可行性,immunophenotype被cytofluorimetric分析评估。

 2.5。MSC分析

immunophenotype分析msc是由200000个细胞流式细胞术,是孵化20分钟在4°C与荧光素- (FITC)或phycoerytrin (PE)共轭单克隆抗体anti-CD45, CD14(美国加利福尼亚州圣何塞,正欲),CD90、CD29, CD73,和CD105 (Caltag实验室、伯林盖姆、钙、美国),作为ISCT指南建议( 13]。在PBS 1 x 1洗后,这些细胞被resuspended在200年 μL PBS 1 x和分析Epics-XL血细胞计数器(美国贝克曼库尔特,CA)。使用细胞染色阳性细胞百分比计算Ig FITC /聚乙烯作为一个消极的控制。

 2.6。免疫荧光

msc培养存在的ARPE-19 SN RPE65视网膜考核通过免疫荧光标记,视蛋白,和PKC在7和14天。

这些细胞被固定和permeabilized acetone-methanol(1: 1) 20分钟−20°C。固定细胞用PBS 1 x (Cambrex、比利时)和非特异性结合被0.1%白蛋白(HSA) PBS, 1小时在室温下(RT)。这些细胞被孵化与主抗体抗RPE65(鼠标),Opsine(兔),和PKC(兔),然后CY3 anti-rabbit(免疫科学、罗马、意大利;1:1000),或AlexaFluor 488 -耦合anti-mouse(1: 500年,南方生物技术,伯明翰,美国)。阳性细胞数和总细胞数的标签相比4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI、分子探针)。下的细胞进行显微数字化(Axiovert 200年,卡尔蔡司、AG)、德国)和分析AxioVision Rel 4.2(卡尔蔡司、AG)、德国)。放大20×40×e。

 3所示。结果

msc - BM中分离的特征根据ISCT引导线(图 1)。为了评估的可能性将AMD msc与传统的类固醇,我们测试了形态、生存能力,生长动力学和immunophenotype然后评估在msc与不同的药物治疗,(TA, AF-TA、溶和敏捷)。

根据ISCT指南描述的msc。面板1:纺锤状细胞典型的msc后24小时,72小时,5天从播种。面板2:immunophenotypic msc的分析显示CD34的消极,CD45和CD14表达的积极性CD90、CD73, CD105、CD29。小组3:代表MSC分化潜能:存在钙ossalates观察范Kossa成骨诱导后染色(a);存在的脂质胞浆内空泡沾油红O (b)后脂肪形成的诱导和hjaluronic酸的存在后,阿尔新蓝染色(c) chondrogenic归纳。原来放大40×20×(a、c)和(b)。

 3.1。形态

相衬显微镜显示TA晶体的聚集。MSC在MSC媒介的形态分析显示高水平的毒性与药物浓度相关,因为大量的晶体的存在,特别是在细胞治疗1毫克/毫升AF-TA。明显有同样的现象与助教酒精溶液中72个小时,5天之后,在一个更明显的方法1毫克/毫升的配方(有或没有酒精)。1毫克/毫升行,最重要的是,敏捷,形态是更好的保存和更少的沉淀,而TA(图 2)。

形态分析msc的药物在1毫克/毫升的浓度。基底msc在24小时,72小时,5天(f, k);TA在24 h、72 hs和5天(b, g, l);AF-TA 24 h, 72小时,5天(c, h, m);溶在24小时,72小时,5天(d,我,n);敏捷在24小时,72小时,5天(e, j o)。原始放大20×。

msc保持用药物和ARPE-19 SN时,药物晶体的形态分析显示一个较小的存在(图 3)。

形态分析msc的药物在1毫克/毫升浓度和ARPE-19 SN。面板1:msc在24小时与助教1毫克/毫升(a, b, c), 72小时(g、h、i),和5天(m, n, o);AF-TA 1毫克/毫升在24小时(d, e, f), 72小时(j, k, l)和5天(p, q, r);面板2:诊断和1毫克/毫升在24小时(a, b, c), 72 (g、h、i),和5天(m, n, o);敏捷1毫克/毫升在24小时(d, e, f), 72小时(j, k, l)和5天(p, q, r)。原始放大20×。

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 3.2。生存能力

助教没有毒性作用在0.01毫克/毫升:生存能力为94.20%,97.10%,和98.50%,24岁,72个小时,和5天。助教0.1毫克/毫升涉及生存能力的下降(65.50%)和24小时后恢复文化72小时(91%)和5天(93%)。

AF-TA涉及轻微下降0.01毫克/毫升的生存能力在0.1毫克/毫升生存能力下降到76.50%和77% 24和72小时后,分别与恢复后5天。

溶毒性只有5天后文化在0.1和1毫克/毫升。

地塞米松是非常有毒的1毫克/毫升24和72小时后,在0.01毫克/毫升和0.1毫克/毫升的细胞仍然可行的在每个时间分析。所有这些数据都显示在图 4。

在不同浓度的可行性条件去炎松醋酸酯(a),不含酒精去炎松(b),诊断和(c)和地塞米松(d)。

 3.3。生长动力学

msc的细胞膨胀增长速度是评价细胞计数在每个通道和伯克室表示成倍增加。

所有药物对细胞生长有负面影响。地塞米松抑制MSC增长率特别是在0.1和1毫克/毫升后5天的文化( P < 0.05 )(图 5)。

增长率在不同浓度的去炎松醋酸酯(a),不含酒精去炎松(b),诊断和(c)和地塞米松(d)。经过5天的文化细胞增长下降0.1和1毫克/毫升地塞米松( P = 0.02 , P = 0.03 职责)。

 3.4。Immunophenotype

在实验中,msc被负面的造血的抗原(CD34、CD45和CD14),并表示CD90百分比高,CD105, CD29, CD73(数据没有显示)。Immunophenotype分析显示一个负面影响,24小时后的助教和AF-TA间叶细胞抗原表达,大多在0.1毫克/毫升。然而,经过72小时和5天的文化有一个恢复抗原表达,与第五天轻微的减少。行1毫克/毫升博览会诱导MSC抗原的表达下降后24小时( P < 0.05 ),72小时后5天。地塞米松没有显示抗原表达的负面影响。所有药物1毫克/毫升,然而,诱导细胞形态学的改变不允许cytofluorimetric分析,即使24小时。

 3.5。免疫荧光

msc培养与ARPE-19 SN被免疫荧光分析评估视网膜的表达标记RPE65视蛋白,和PKC在7和14天。图 6表明,14天后,基底msc的表达水平与视网膜标志ARPE 19细胞,用于控制。

免疫荧光分析的msc (a)视网膜标记视蛋白的表达(b), RPE65 (c)和PKC (d),经过14天的文化,ARPE 19细胞相比,用作控制(e, f, g, h)。原始放大20×(a、d、e、h)和40×(b, c, f, g)。

 3.6。药物评价msc的视网膜细胞

基地的以前的结果我们决定测试,如果在一个“视网膜像微环境”有可能观察体液物质对msc的保护作用。这些目的我们测试了前面描述的msc的文化条件和类固醇药物,使用条件培养基从视网膜细胞行ARPE-19获得。我们还测试了不同比例的条件培养基。在ARPE-19 SN可行性是更好的药物。助教,ARPE-19 SN的效果是明显的在0.1毫克/毫升后24小时内,在0.01毫克/毫升AF-TA 24和72小时之后。没有影响溶和地塞米松,但是,在1毫克/毫升,毒性作用后24 - 72小时后减轻retinic SN曝光(图 7)。SN的效果是明显的,这是50%的SN比SN的100%。

生存条件在不同浓度的药物ARPE-19 SN的存在。(a1)助教0.01毫克/毫升;(a2)助教0.1毫克/毫升;(b1) AF-TA 0.01毫克/毫升;(b2) AF-TA 0.1毫克/毫升;(c1)诊断和0.01毫克/毫升;(c2)诊断和0.1毫克/毫升;(c3)诊断和1毫克/毫升;(d1)敏捷0.01毫克/毫升;(d2)敏捷0.1毫克/毫升; (d3) DEX 1 mg/mL.

细胞增长而言,在助教的存在,最有利的条件是在0.1毫克/毫升50%的SN。AF-TA 0.01毫克/毫升SN的影响是积极的SN的100%,而在0.1毫克/毫升SN最好的效果是50%。早期,细胞增长是有利的(0,1,0,1毫克/毫升的SN 50%, SN和1毫克/毫升100%。地塞米松的50% SN对文化的影响是积极的(0,1,0,1毫克/毫升(图 8)。MSC的增长存在的早期或地塞米松似乎更与文化微环境(MSC介质对ARPE-19 SN), SN的50%更有利。

增长率在不同浓度的药物ARPE-19 SN的存在。(a1)助教0.01毫克/毫升;(a2)助教0.1毫克/毫升;(b1) AF-TA 0.01毫克/毫升;(b2) AF-TA 0.1毫克/毫升;(c1)诊断和0.01毫克/毫升;(c2)诊断和0.1毫克/毫升;(c3)诊断和1毫克/毫升;(d1)敏捷0.01毫克/毫升;(d2)敏捷0.1毫克/毫升; (d3) DEX 1 mg/mL.

msc抗原的表达在ARPE-19 SN的存在并没有改变。

 4所示。讨论

利用msc再生医学是一个有前途的治疗疾病的方法,其特征是视网膜色素上皮细胞和感光细胞的损失,如AMD。很少有治疗方案对于AMD的干燥形式,而对于渗出性形式费时,昂贵的,只有有限的大多数病人。因此,细胞治疗的可能范围相当广阔。AMD是一个完美的候选人的应用干细胞疗法,以取代缺失的细胞或推迟他们的退化。本研究旨在观察msc的行为在不同的文化媒体,结合皮质类固醇药物在临床实践中,常用来评估毒性,然后强调了有益的剂量。以前的研究为其他nonocular疾病检测干细胞结合糖皮质激素的使用,指出积极的对细胞粘附的影响,增殖和生存能力。

因此,这些药物可能刺激MSC的增殖和分化根据复杂环境条件( 21]。然而,很少有人了解的初始事件由糖皮质激素组在运动过程。因此,探索这些药物对msc的前景的影响,揭示重要细节的干细胞生物学和可能的治疗寻找新领域的应用。

在这个工作我们毒性评价曲安奈德,有或没有酒精,微缩intravitreal去炎松,和在不同浓度地塞米松msc有或没有视网膜细胞培养上清液ARPE-19,研究其形态、生存能力,细胞增长,immunophenotype。

数据表明,msc培养用皮质类固醇药物维持其特有的特征,尽管生存能力大打折扣。这些数据与谢赫的ARPE-19细胞,研究报告TA浓度之间的相关性和细胞的损失( 8],哦的研究表明,即使是很短的接触TA抑制成纤维细胞的增殖和RPE细胞,产生显著的毒性汇合的RPE细胞( 7]。

我们的形态学研究,可行性的评估数据,细胞生长,和msc immunophenotype表现出不同的行为的存在三种药物使用,测试在同一浓度和在相同的培养条件。数据显示毒性作用的药物,主要是由于浓度越高。

比较所有的药物,地塞米松是至少在这项研究中使用的有毒皮质类固醇。地塞米松经常是一种人工合成的糖皮质激素用于治疗严重的炎性疾病具有积极影响的间叶细胞祖细胞分化成成骨细胞。在我们的研究中,在低浓度地塞米松是最有毒的药物,根据歌曲的数据和丹尼斯的研究( 24),这表明地塞米松可减少或消除细胞density-related细胞凋亡在msc。

的微环境也很重要。使用ARPE-19视网膜细胞培养SN试图创建一个特定的微环境中研究MSC的特点和药物的影响而控制在MSC媒介文化。皮质类固醇药物和缺乏培养基的典型的msc (SN 100%),是第一,抑制细胞生长,但也促进分化的因素。5天后,MSC增长的最有利的条件是文化与视网膜SN 50%,不管所使用的药物。最有益的效果50% SN比100% SN可能被考虑到缺乏解释的标准培养基msc、可能会限制细胞生长但促进视网膜方向的分化,青睐的组织环境的存在。我们的研究似乎证实,一个特定的细胞外环境可以保护药物毒性的msc。

ARPE-19细胞系的SN 50%和100%,然后发布的视网膜细胞营养因素的存在,似乎帮助细胞更好地保护典型的形态,和沉淀是低于标准的文化媒体。

免疫荧光染色法的使用使我们能够识别特定的标记的表达表达的视网膜色素上皮细胞(RPE65,视蛋白和PKC)在msc培养视网膜SN,证明有实际向视网膜谱系分化潜力有一个合适的环境。研究msc的分化潜能是有争议的。尽管一项研究发现,msc分化成细胞类似小胶质细胞而不是视网膜神经元( 17),其他研究已经表明,msc分化成视网膜神经元 在活的有机体内和 在体外( 18]。此外,动物实验也证明了sub-retinal移植msc延迟视网膜变性和保护视网膜功能的 19]。

msc在细胞疗法可能是有用的,特别是慢下来的损失函数通过神经营养因子,促进生产感光细胞的生存。msc似乎证实了一个角色在支持细胞扩张,细胞活化的免疫抑制和神经保护。所有这些特性可能支持的同时使用特定的药物,如皮质激素。

皮质类固醇药物测试在这项研究只在高浓度诱导细胞死亡。细胞生长、生存能力和msc的功能性质是在低浓度药物的存在。

最近,一些报告显示的临床可行性intravitreal管理是自体了从骨髓中萃取出来的单核细胞在晚期退行性视网膜病变患者( 25, 26]。Siqueira未来的第一阶段试验进行调查的安全intravitreal ABMC RP患者或遗传性锥体杆体营养不良,和有前景的结果( 27]。

我们的 在体外研究表明,高剂量的类固醇药物对msc有负面影响。这种效应在药理剂量低,降低了媒体的存在条件。还需要进一步的研究来改善我们的 在体外研究和新药需要测试,了解msc和视网膜细胞之间的相互作用的机制。最后,对于未来的临床应用的目的, 在活的有机体内研究是必要的研究msc治疗AMD的潜在作用。

 利益冲突

作者没有任何实际的潜在的利益冲突。

 确认

作者也感谢安德鲁·马丁Garvey BA(荣誉),LTCL (TESOL), PGCPolSci,社论援助。这项工作是支持Regione皮埃蒙特。

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