文摘
人类诱导多能干细胞(hiPSCs)的核心属性无限的自我更新和分化潜能,已成为令人兴奋的细胞来源的应用程序在再生医学,药物发现,理解的发展,疾病的病因。关键在许多标准来评估多能性包括在活的有机体内畸胎瘤化验,被广泛作为标准功能试验证明hiPSCs的多能性。然而,缺乏可靠性的方法,缺乏明确的临床意义和相关费用纳入问题使用畸胎瘤化验的“黄金标准”确定多能性。我们建议使用的在体外胚状体的身体(EB)分析作为一种重要的替代畸胎瘤化验。本文总结了方法用于创建从hiPSCs EBs和随后的分析来评估多能性,提出了其使用成本效益,控制,和可再生的方法,可以很容易地用来确定生成的hiPSCs的多能性。
1。介绍
人类诱导多能干细胞(hiPSCs)是发展中令人兴奋的细胞来源在再生医学中的应用(1)和药物发现,主要是基于其广泛的人类胚胎干细胞同行相似之处和共享属性的自我更新和multilineage分化能力。诱导多能性的策略通过激活多功能网络已经被证明是成功的重编程体细胞变成胚胎样(2,3]。然而,有一个关键需要评估的多能功能hiPSCs逐行基础上,一旦发生重新编程来演示这分化的潜能。
提出了多重标准来评估的多能状态生成hiPSCs [4- - - - - -6]。关键在这些标准包括常规的细胞形态分析的存在nuclear-cytoplasmic比率高,细胞表面和多能性基因表达标记,示范的分化能力到衍生品三个发展胚芽层(外胚层、内胚层、中胚层)和专门的功能结果证明发展效力。发达到目前为止包括功能分析在体外分化,形成畸胎瘤,妄想发展,生殖系传播,和四倍体互补7]。最严格的测试,以屏幕为多能性证明生殖系嵌合体后能力发展的能力,一个测试,可以很容易地进行鼠标万能。hiPSCs,生殖系传输和四倍体互补测试是不可能的,畸胎瘤的形成hiPSCs注入免疫力低下小鼠和后续分析的组织形成被广泛的作为一个重要的方法论对生成的hiPSCs发育能力进行调查。
2。多能性的畸胎瘤试验评估
畸胎瘤是固体,定义肿瘤,通常带有派生,由高度有组织的分化细胞和组织包含三层发育生殖的代表,也可以生成人工移植多能干细胞(为其或hiPSCs)在免疫缺陷小鼠(8]。畸胎瘤是显著的组织病理学,他们可以作为一个重要工具观察早期形态发生组织组织。数量的细胞移植到免疫缺陷动物模型,以生成完全分化的畸胎瘤在活的有机体内范围可以在一百年到一百万年之间细胞或更多9]。作为这种方法的一部分,移植生成的hiPSCs通常在以下网站:肌肉、皮下、睾丸胶囊,或在免疫缺陷小鼠肾胶囊。经过一段时间的至少三个星期,成熟畸胎瘤是切除的动物是评估细胞的存在三个胚芽层。畸胎瘤的分析提出了最严格的方式来评估hiPSCs的多能性10),但没有严格的四倍体互补和生殖系传输可以用鼠标进行万能(11]。此外,与试验相关的成本高,使用数十或数百个动物,缺乏一个明确的能力形成畸胎瘤的临床或生物相关的特定细胞类型随后来源于hiPSCs,和nonsystematic这种分析方式采用带质疑畸胎瘤的使用试验的“黄金标准”(4,6,8,11]。
最近的报告强调了需要标准化的协议生成和检查的畸胎瘤诱导免疫缺陷小鼠模型,如果他们被用作评估多能性的黄金标准生成hiPSCs [8,10]。研究表明,一些hiPSC行没有成功地形成三个胚芽层畸胎瘤但已成功地推导特定细胞类型可能有临床意义12]。其他研究人员也发现,部分重组hiPSCs能形成畸胎瘤,即使他们不符合其他标准为多能性,导致许多问题的整体意义畸胎瘤试验(6]。代的系统协议为畸胎瘤生成和分析,可以采用不同的实验室也仍然是一个挑战8]。
3所示。拟胚体作为一种手段来评估hiPSCs的多能性
一个重要的畸胎瘤试验是一种替代方法在体外方法涉及代拟胚体从hiPSCs (EBs)。EBs是细胞的三维聚合物的混合物的三个发展胚芽层(7]。在这种方法中,未分化hiPSCs放置在悬挂,促进随机分化成三个生殖细胞层。EBs的形成是一种常规的方法用于hiPSCs的分化成不同的细胞谱系(13]。这种方法的主要优势之一就是它执行在体外与标准的组织培养方法和材料,这样就避免了监管问题和广泛的费用与维护相关免疫缺损老鼠。可以轻松地生长在EBs在实验室培养皿中悬浮培养,可以毫无困难地扩大一次扩大建立适当的条件(14]。与畸胎瘤化验中hiPSCs还通过其他多能性测试失败形成畸胎瘤,原因不明(12),hiPSCs容易形成EBs的方法提供演示trilineage分化的能力和分析控制变量的可重现性。众多方法开发生成EBs连同多能评估使用的分析建立在以下部分中进行了总结。
4所示。方法论的形成hiPSC拟胚体
有几种方法发展为各种各样的目的,创建拟胚体随机生成的特定的组织类型在体外胚层分化,说明能力的候选人多能干细胞(13,15- - - - - -17(总结表1)。为特定组织血统,EBs已被证明是有益的起始的分化和提高向特定的谱系分化18)如造血(15,19,神经20.,21),和心脏组织(22- - - - - -25]。方法开发EBs不同大小一致的形式聚集的能力和维护他们的长期生存能力。通常,它有利于控制EBs的统一大小的可再生的特定的组织类型的分化;然而,形成不同大小的EBs的能力扩展文化时期促进多元化组织的形成代表三个胚芽层来演示分化潜能。这两种类型的技术可用于评估多能干细胞(hESC hiPSC)质量。
4.1。异构胚状体的形成方法
方法建立随机EBs是最简单和有用的一代不同胚层代表随后演示的多能性16]。液体悬浮培养(LSC, (15])是一种常见的方法来创建EBs,取决于细胞生长能力的总量没有附件组织培养容器(图1(一))。典型的组织培养器皿为此从nontissue culture-treated petridishes专门治疗超低附件表面可以通过几个供应商。这些low-attachment组织培养容器通常涂层提供一个中立的、亲水表面,以防止蛋白质吸附和随后的细胞附件(26]。水凝胶,如天然的琼脂糖,定义或化学合成材料,如polyhydroxyethylmethacrylate(水凝胶)涂容器表面,防止附件创建的目的细胞的悬浮细胞聚集体(26]。虽然这些表面处理防止细胞对组织培养容器导致聚合,最初播种密度需要优化,以促进形成适当大小的EBs所需的信息交互。播种密度太低导致可怜的聚合从而导致差建立EB的文化。因此,典型的播种密度都很高在最初的聚合(最少106细胞每2毫升媒体在一个50毫米板(16]或6-well板)。在多能hESC和hiPSC文化的情况下,通常需要促进殖民地的初始聚合一步转移孤立的部分低依恋船只,因为这些文化倾向于负面影响在单个细胞悬液导致贫穷的生存能力的细胞凋亡(35]。一旦形成,悬挂EBs文化通常在低附件容器培养一段时间,通常从28到35天用新鲜媒介交换每2 - 3天,但是更长的文化时间可能是可取的。介质条件被证明有重要影响的可行性和胚层分化EBs暂停。例如,研究表明,文化的EBs生理血糖浓度(5.5毫米,而不是25毫米高葡萄糖hESC和hiPSC扩张的典型配方中)的碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)延长了生存能力和组织的复杂性增加的EBs显示代表所有三个胚芽层文化可以保持105天(36]。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
虽然静态悬浮EBs是使用最广泛的文化由于其简单性和最小成本low-attachment治疗标准容器(天线和多井板块),最新进展在生物反应器悬浮培养具有实用性的技术优化,规范,扩大EBs的形成(17,28,29日]。与静态悬浮文化不同的是,这些系统需要专门的文化设备如搅拌烧瓶或最近的旋转式细胞培养系统(信用社),由美国国家航空航天局(NASA)慢转侧血管(STLV)或大容量高方面旋转容器(哈里)[37- - - - - -39]。典型的搅拌瓶方法涉及播种hESC或hiPSC悬浮液在专门的瓶利用磁力搅拌棒不断旋转的文化以便于聚合细胞持续细胞聚集和比静态系统提供更好的气体交换(27)(图1 (b))。该方法被用来推导EBs,可修正的扩大更大的收益率(27]。与这些搅拌瓶悬浮系统允许EBs烦躁/文化时间允许更大的气体交换,减少缺氧,集聚低于静态悬挂系统(27),信用社系统大大减少剪切力,出现在了瓶系统,可以极大地损害EBs (40,41]。通常称为“微重力细胞培养,信用社系统允许连续水平旋转导致非常低的剪切应力对细胞活性膜基气体扩散,防止缺氧和同样分发氧气和过期废气,并可以通过调节转速和部分控制EB大小初始播种密度(图1 (c))。信用社使用这些系统,特别是STLV以其高膜表面积到中等体积大哈里相比,它已经证明了EBs培养以这种方式展示更高的生存能力,更复杂的组织分化,而且,在一个特定的例子,神经感应,增强的神经祖细胞分化[42]。
4.2。同质的身体胚状体的形成方法
与EB的异构方法形成,导致三个胚芽层随机的代表文化,更是频繁,控制EB形成增加的再现性和尺寸控制方法可以促进分化向特定的组织类型。特别是,EB大小的控制已被证实能影响生存能力,增殖,分化潜能(26)心肌细胞(22,25,30.,43),内皮组织(43],以及指导造血作用[19]。
几种方法已经发展为了EBs的形式定义的大小。这些方法分享方法隔离方法定义数量的细胞为了让他们总之前收集进一步的文化。悬滴法利用20 - 25μL滴定义包含一个细胞的数量(通常是1000 - 10000年)在单个细胞悬液13,30.,31日]。液滴被放置在底部的翻转100 mm细胞培养板盖,通常最多96滴,如果使用多通道吸管滴(图1 (d))。一旦放置,盖子仔细翻允许滴保持连接到盖子,盖子被放置在一个buffer-filled板防止挂滴的蒸发。这种技术是有限的大小上限的初始细胞聚合由于有限体积的悬滴要求允许液体张力坚持下盖(20到25μL)。初始细胞聚集体的形成通常需要1 - 2天,之后EBs单独手动收集并放置在粘附力减小板进行进一步的文化和成熟。挂掉的变异使用圆底超低attachment-treated多层钢板也被开发出来,允许派生的EBs比悬滴法,在大量的细胞(即可以放在每个好。,100 - 200μL的细胞悬液在96孔圆底板块(图)1 (e))[14]。最近,使用硅wafer-based精密加工技术包含成百上千的测微计每厘米大小的井2坚持油井底部的一个标准的多层板,形成大量的研究已经证明了能力统一和同步定义大小的人类EBs (32商业上可用的格式(AggreWell]TM干细胞技术)(图1 (f))。虽然这些技术允许控制聚合为hiPSCs,都需要形成的单一细胞悬浊液暴露的细胞生存能力低,穷人EB的形成,在板的情况下建立系统中,离心,以武力解决细胞到井的底部。是很常见的,因此,保护剂,如添加Rho-associated激酶抑制剂(岩石),y - 27632,需要这些方法(35]。
4.3。其他身体胚状体的形成方法
前面所讨论的EB形成方法代表的目的最常用的评估hESC和hiPSC多能性在体外。其他更具体的方法存在利基应用,如封装技术利用水凝胶,如甲基纤维素(15,33]或透明质酸(HA) (34]。这些技术允许单个细胞的截留悬浮和随后的细胞总量的增长(图1 (g))。这些技术主要是利用了更具体的目标比如当细胞多能性评估集群源自单细胞克隆是可取的。这些技术经常遭受非常低的收益率(15)由于长期单一的内在不稳定的细胞培养多能干细胞以及复杂的隔离EBs下游水凝胶的后续分析。
5。分析胚层形成hiPSC-Derived拟胚体
为了评估hiPSCs的多能性在体外方法推导EBs,必须有明确的下游形成代表化验,证明能力的三个发展胚芽层,从而展示其分化能力增加重组。有几种方法来展示这个少,从严格的(显示生殖分层的基因的表达)更严格和明确示范tissue-similar结构(组织学和免疫组织化学)类似于早期的胚胎发育以及随之而来的表达的标记。本节将简要回顾一下典型的此类分析的要求。
5.1。胚芽分层的基因的表达
也许最严格的测试EBs的多能性的示范胚芽分层的生化基因表达的意思。降低紧张的原因是,这只代表的能力来检测这些基因表达没有知识组织结构内的高阶结构或颞表达式可以看出通过更广泛的组织学和免疫组织化学检查(见下面)。输入细胞,然而,很明显,经常向hiPSCs成纤维细胞在其推导过程,这些基因不表达,可以作为指标,获得组织特定的表达式(61年(即。,neural-specific genes being expressed). Gene expression analysis is also often used to demonstrate the lack of pluripotency genes upon EB differentiation, thus demonstrating the completeness of differentiation. This is of particular concern with hiPSCs, in order to demonstrate that the factors used to reprogram in the case of integrating retroviruses are in fact silenced [62年]。有几个多能和胚芽分层的标记用于确定分化在EBs(表的目的2)。
5.2。组织学分析拟胚体
虽然基因表达分析可以用来识别微生物的存在分层的标记和随之而来的失去多能标记,一个更明确的评估组织分化是基于分段EBs其次是评估组织的组织学评估组织、细胞形态、和本地化的蛋白表达16,28,29日,36,63年]。通常,EBs首先颗粒状和嵌入式(即。,low-melting point agarose) in order to concentrate the EBs for subsequent paraffin embedding and sectioning for mounting on microscope slides [63年]。然后将这些slide-mounted部分沾hematoxylin-eosin()),以提高组织和细胞(图之间的对比2)。使用这些技术,可以普遍公认的各种组织,如神经圆花饰(ectoderm-Figures2(一个),2 (d),2 (g),2 (j))、结缔组织(mesoderm-Figures2 (b),2 (e),2 (h),2 (k)),假定的内胚层(数字2 (c),2 (f),2(我),2(左))。尽管这种技术通常用于EBs和畸胎瘤确定胚层的存在代表一旦他们的组织形态学鉴定,可以主观的评估,可能需要进一步的免疫组织化学分析,以确认使用特定的抗体(表解释2和图3在部分毗邻)彩色部分)。假定的内胚层尤其如此,这并不普遍,通常不成熟胚状体体内比简单的识别的神经和结缔组织。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
(左)
(一)
(b)
(c)
6。结论
虽然hiPSCs重组从人类体细胞已经有据可查的多能干细胞与众多与为其共同的相似之处,许多新成立的增加hiPSC线需要使用多个化验和广泛的资源来逐行基础上展示他们的多能性。关键在这些化验证明效力对形成的三个发展胚芽层和随后推导特定分化的细胞类型,以展示他们的治疗潜力。最近,有巨大的争论在国际干细胞社区的可行性和使用在活的有机体内畸胎瘤试验证明派生hiPSCs的多能性(4,6,8- - - - - -11]。我们提出了胚状体体(EB)作为一个有用的分析在体外,具有成本效益的替代来演示派生hiPSCs的分化潜能。EBs的生成方法和后续生化和组织学分析经历了稳定和巨大的改进,允许其使用在不同的实验室。拟议的方法进一步改进和自动化提供了的机会应用EB试验作为评估的金标准生成的hiPSCs的多能性。
承认
部分赞助提供的工作是NSF-CAREER 074556 (r . Rao)。