体内使用骨半月板撕裂伤愈合骨髓间充质干细胞与纤维蛋白胶

抽象

从患者自身的血液产生纤维蛋白胶可作为一个载体，提供细胞损伤的具体部位。用于优化该输送系统的各种排列的实验模型在活的有机体内在这项研究中进行了测试。收获马半月板切片用纤维蛋白胶或纤维蛋白胶和马的骨髓来源的间充质干细胞（BMSC）reapposed。这些构建物然后在裸鼠皮下植入。构建体在收获后，BMSC含有构建体显示显著血管形成增加，并且组织学显示主观降低修复组织的厚度，增加相比单独纤维蛋白的构建体的总合。这种模式允许不同的半月板的治疗组的直接比较，同时使用少量的动物。这个在活的有机体内该模型在未来可能对优化马半月板损伤的纤维蛋白和细胞治疗有价值，也可能对人类有价值。

1.简介

弯月面是股胫关节内的C形纤维软骨结构[1]。在提供关节的稳定性方面，这是不可或缺的[2]，移动期间的润滑性，与吸收和冲击的耗散[2,3.]。半月板损伤可由多种原因引起，最明显的是慢性磨损、急性损伤和十字韧带或副韧带松弛[4]。随着时间的推移，半月板损伤的负面影响包括关节不稳定和关节软骨变性。内侧半月板损伤占人类半月板损伤的81%，运动是主要原因[5]。在马严重的半月板撕裂导致降低返回功能，尽管手术治疗[6,7]。半月板切除术和严重受损半月板的部分半月板切除不是没有它们在关节长期影响，导致骨关节炎（OA）和关节残疾[8]。在避免半月板切除的同时，治疗或修复半月板可使患者恢复，并减少膝关节或膝关节的长期功能障碍[9,10]。

人工合成半月板的尝试通常会导致植入物性能不佳，并在几周到几个月的时间内导致试验对象的关节退化。11,12虽然最近取得了一些进展[13]。有希望的选择已经出现，使用供体半月板作为生物支架，并将其纳入患者半月板结构，或维持患者的半月板原位并鼓励通过各种方法蜂窝再增殖和血管向内生长[14- - - - - -20]。临床医生已经开始植入的干细胞或富含血小板的血浆进入通过超声检查或关节镜检查可见病变。从患者自身的血液衍生纤维蛋白胶可以用作载体附着在受损区域中的细胞[17,21]。由石村等人对兔子的研究。(22]放置纤维蛋白胶和全骨髓抽吸物进入缺陷弯月面的无血管区。这导致显着更成熟的12周内比纤维蛋白单独或空的缺陷修复。这种细胞/纤维蛋白治疗的一个版本已经由斯科蒂等人首创。(20]使用软骨细胞植入的纤维蛋白胶reappose尸体半月板的部分。他们的研究表明软骨细胞样本与单纯纤维蛋白胶中增加了部分的结合。

上述研究表明，将活细胞纤维蛋白胶直接植入病变可能会促进细胞基础半月板愈合的新进展。近4年来，我们实验室采用关节内注射自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)治疗马半月板病变[23,24，并在半月板严重损伤的马身上看到了令人鼓舞的结果。在一个试验模型和一个人类临床病例中，通过关节内注射骨髓扩张的成体干细胞显示半月板组织显著再生[25,26]。关节内注射BMSCs不是损伤部位特异性的，依赖于炎症归巢机制[21,27,28细胞迁移到受损组织。目前的项目是为了进一步研究以纤维蛋白为载体的更定向位点特异性细胞治疗的效果。利用Scotti等人发表的小鼠模型[20]提供了多种好处，使它成为一个合适的步骤在体外和更大的规模在活的有机体内工作。该模型提供了实验能力，对半月板结构的控制大小，类型，和治疗在足够数量的队列控制，以提供足够的统计力量。这种模式允许在相对较短的时间内测试各种治疗排列。这些因素包括剂量(细胞数量)、纤维蛋白的类型或浓度、多能细胞系的分化程度，以及在受控条件下增加生长因子或其他生物物质在活的有机体内设置。这一结果将使研究人员能够确定在大型动物模型中使用这些模式的最佳治疗策略。当前研究的目的是确定植入BMSCs的纤维蛋白与单独植入纤维蛋白是否能观察到有益的愈合效果。

2.材料和方法

所有涉及活的动物和组织这项研究的收集程序是由科罗拉多州立大学动物护理和使用委员会的批准。

2.1。半月板组织集合

8个内侧半月板来自于4匹因膝关节或其他可能影响研究的不利因素而安乐死的马。半月板收获无菌地从尸体的四肢后6小时内安乐死(一系列6小时30分钟),在磷酸缓冲盐(PBS)(卡尔斯巴德英杰公司集团(总部)、钙、美国),提前在液态氮冷冻,然后储存在−80°C至少1周(范围从1星期8个月)。样品在25℃水浴中解冻，修剪仅保留弯月面轴向2/3的部分，并进一步分割成0.4厘米宽的三角形楔形。切片置于PBS和PSA(青霉素、链霉素和两性霉素B) (Invitrogen公司(总部)，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)中，再经过两次冻解冻循环[29]，改变媒体新鲜的PBS（Invitrogen公司（总部）卡尔斯巴德，CA，USA），每次冻融循环，以保证没有活细胞存在。

2.2。骨髓

骨髓，在CSUVTH（科罗拉多州立大学兽医教学医院）对安乐死的30分钟内不相关的原因与使用无菌技术的8号Jamshidi套管针安乐死马的髂骨采集。约20cc的骨髓抽入注射器2-35cc与3000个单位的肝素（APP制药LLC，Schaumbeurg，IL，USA）的抗凝血剂中的每个注射器中。骨髓间充质干细胞集落通过根据由Kisiday等人所述的技术培养该核细胞级分而获得。(30.]。汇合60-70%后，用胰蛋白酶将BMSCs提升传代(Invitrogen公司(总部)，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)，以10000个细胞/cm重种²，并使BMSCs生长至60-70%融合。骨髓基质细胞在95%自体血清/5% DMSO中冷冻保存(Sigma Aldrich，圣路易斯，美国密苏里州)。

2.3。纤维蛋白

的马静脉血四百毫升从供体的颈静脉进入血液采集组（乔根森实验室）用柠檬酸钠抗凝血剂收集在无菌的方式，并储存在4℃下进行几个小时。Whole blood was centrifuged at 1000 G for 10 minutes and the plasma removed and stored at −80°C until needed. Plasma was thawed at room temperature, and the fibrin extracted per the ethanol precipitation protocol described by Yoshida et al. [31]。

2.4。构建准备

半月板预先制备的部分，骨髓基质干细胞和纤维蛋白解冻前夕结构的创建。对于每个小鼠构建体对（组0和组1）从相同的弯液面为变化控制的部分中创建。对于组1的构建体，解冻的细胞悬浮液沉淀，然后重悬于与纤维蛋白原游离等离子体的最小量的（约50 μL)需要将细胞返回悬浮液中。然后将细胞悬液与225混合μL纤维蛋白原沉淀和额外的无纤维蛋白原血浆(约175μL)直至细胞最终浓度为达到每毫升纤维蛋白原/血浆/细胞混合物的细胞数。将等量(0.02 mL)的纤维蛋白原/血浆/细胞混合物与等量的牛凝血酶(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)混合(0.02 mL)，应用于第1组半月板切片的切面。第二个半月板切片放在纤维蛋白原/血浆/细胞混合物上，让纤维蛋白凝固30分钟。

0组样本使用50创建μPBS的L至更换BMSC /等离子体悬浮液。然后将其用225混合 μ大号纤维蛋白原沉淀和175 μ血浆中纤维蛋白原游离。将等量(0.02 mL)的纤维蛋白原/PBS/血浆混合物与牛凝血酶(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA) (0.02 mL)混合，应用于0组半月板切片的切面。第二个半月板切片放在纤维蛋白/PBS/凝血酶混合物上，让纤维蛋白凝固30分钟。为了覆盖所有构造的外部，纤维蛋白原沉淀(225μL)与游离纤维蛋白原血浆(225)混合μL)与等体积凝血酶混合。这种涂层的应用是为了减少皮下组织的侵犯在活的有机体内(20]。大约0.1 mL的纤维蛋白和凝血酶混合物被用于完全覆盖每个构建物。外部纤维蛋白涂层允许设置30分钟，然后将完成的构建物转移到无菌培养皿中，运送到手术室。在植入前15分钟至45分钟，每个治疗组每组6个构建体组装完成。

2.5。外科手术

Twelve 10-week-old male nude mice were anesthetized, maintained on isoflurane inhalant anesthesia, and administered 5 mg/kg carprofen (Pfizer Animal Health, Madison, NJ, USA) subcutaneously. Mice were placed in sternal recumbency and bilateral paralumbar areas were prepped with 2% Chlorhexidine scrub and sterile water. Surgical procedure was modeled after previously described protocols [20,32]。A 1 cm horizontal cutaneous incision was made in each paralumbar area and a pocket bluntly dissected into the subcutaneous tissue. A meniscal construct was inserted into each pocket, one side randomly receiving a BMSC and fibrin-treated sample and a fibrin only control sample in the other [32]。切口用创口关闭夹(AUTOCLIP) (Becton, Dickson and Co. Franklin Lakes, NJ, USA)封闭。耳朵上的凹槽被用来唯一地识别每只老鼠。手术后，小鼠恢复，每日监测2次，持续3天。小鼠术后皮下注射5 mg/kg卡洛芬，持续3天。三天之后，在接下来的4周的研究中，每天对他们进行一次监测，看他们是否有术后并发症的迹象和总体健康状况。

2.6。收获的构造

手术后4周，小鼠被置于CO₂气室，并与CO的逐渐增加的浓度安乐死₂（用室内空气开始）直至小鼠停止呼吸。缺乏心脏跳动的确认之前，将小鼠完全从室中取出。将构建体取出，立即固定于10％中性缓冲福尔马林（StatLab医疗ProductsMcKinney，TX，USA），和分级为组织粘连，粘附的容器的存在，且所感知的部分之间的粘合强度时直率地探测。二十四总共半月板样品从12只动物收获，用第1和0组从每只动物收集由柏瑞迪等作为建模。（2001年）32]。评分分数和标准见表中的红字1。

2.7。得分

一种改性圈地等。(33使用了计分系统。见表1以获得完整的标题。结果参数“附着血管”按0-2的范围分级，该范围是皮下血管附着在构造表面的程度。结果参数“组织黏附”(0-1级)分级小鼠皮下组织对构建物表面的黏附。沿两段交界处(0-2)轻轻探测时，结果参数“Bond”表示两段之间的表观粘附性。分类“没有债券”的决心,如果用温和的调查两个部分完全分离,“灵活的债券”被确定为一个维护并列,但部分可能略有变化的相互关系,和一个“公司”附件没有运动探测时指出之间的部分。

2.8。组织学

在垂直于键合边缘的平面上，用石蜡包埋构造了5微米的切片。从每个样本的中心区域随机选取两张组织切片，放入两组不同的染色组。组织置于载玻片上，苏木精和伊红染色(H&E);(Anatech有限公司;(Battle Creek, MI, USA)和Safranin O-Fast Green (SOFG)(电子显微镜科学，哈特菲尔德，PA, USA)染色并进行显微镜检查。

结果参数“细胞生长”将细胞浸润沿修复组织界面进行分级，以重新填充脱细胞半月板组织(0-3)。结果参数“主要细胞类型”评估了修复组织中的细胞数量及其相对频率(1-3)。结果参数“纤维组织”将修复组织分为有组织和无组织(0-2分级)。结果参数“节段间纤维组织”对分析时半月板节段间纤维组织的数量进行分级(0-1)。该组织被认为是纤维蛋白胶的残余，纤维蛋白胶是在构建过程中放置在各部分之间的。结果参数“SOFG %阳性染色”评估显示SOFG阳性染色的修复组织的数量(0-3)。结果参数“修复组织的厚度”评估了半月板切片之间修复组织的厚度(0-2)。结果参数“细胞再生”分析了半月板切片中细胞的存在情况(0-2)。

结果参数“总结合率”在20 - 40倍放大率的显微镜上完成，并在载玻片的数字捕获图像上测量(Adobe Photoshop CS Extended Edition 10.0.1)。另外还获得了可供发表的图像(美国Buffalo Grove IL的徕卡DFC 425相机，LAS Core软件)。切片的幻灯片图像测量了修复区域的总长度(切割区域之间的界面面积)。然后在图像上标记出连接的证据(桥接和结合半月板纤维进入修复组织)，沿着修复的长度。粘接测量值被记录下来，并转换成总修理段的百分比。将这些总百分比分为4组，根据表的得分0-31。

2.9。统计分析

对所有数据进行Fishers精确检验和卡方表分析(SAS v.9.2)。， SAS学院股份有限公司，卡里，北卡罗来纳州)。差异有统计学意义和统计趋势定义为。

3.结果

在所有的研究动物中都没有出现疾病或死亡。在3天的术后检查中，通过两只小鼠的皮肤可以看到，两个构造物已经移位，使得切面不再与切面平行(一个是边对边坐着，一个是边对着切面坐着)。这两个样本都属于细胞处理组(第1组)。一旦进行组织学检查，这些样本在切片之间有粘结迹象，并与其他样本一起分级。有关每个示例的评分规则的完整结果，请参见表2。

3.1。总体观察

所有的构建有纤维素涂料剩余，在从小鼠取出指出。有一个统计上显著差异（)在建筑物表面有“附着血管”的情况下。0组4例(4/ 12,33.3%)仅一侧有血管，而1组均为双侧有血管(10/ 12,83.3%)和多侧有血管(2/ 12,16.7%)。请参见表2获取完整的评分结果。参见图1(一)为组1构建体具有多个容器的图像附着在表面和图1 (b)为组0构建物以最小的血管只在一个表面上呈现。无统计学差异(）在治疗组之间的外部“组织粘连”。第1点的构建体没有存在组织粘连在5/12（41.7％）和确实具有在7/12构建体（58.3％）组织粘合的存在。0组也有5/12构建体没有外部的组织粘连的证据和7/12构建体与组织粘合的存在。有没有显著统计学差异（)的主观“结合”水平。虽然有些截面具有弹性粘结，但需要注意的是，所有截面都粘在一起，并且在切割边缘施加压力时比植入前更能抵抗分离，这表明所有结构都发生了粘结。请参见表2这些结果参数的全部结果的崩溃。

3.2。H＆E染色切片

无显著性差异()从修复组织向半月板部分的“细胞长入”。在统计上无显著差异()的“优势细胞类型”存在于修复组织之间的治疗组。一些切片有非常有组织的平行纤维的修复组织;然而，这些平行纤维的取向大多与半月板纤维垂直。虽然从主观上看，治疗组和纤维组织之间似乎存在某种关系，但这在统计学上并不显著()。无统计学差异()，比较两组治疗组修复区纤维组织的剩余量。主观性上，非细胞处理的切片中纤维组织的数量比细胞处理的切片中要多，0组中有7/12(58.3%)具有大量纤维组织，而在1组中只有3/12(25%)。数字2(一个)显示组1的组织学切片，显示无纤维组织，显示血管进入修复组织并在被切切片之间进展。数字2 (b)示出了从0组组织切片示出厚纤维蛋白组织存在。还有一些存在于纤维蛋白组织血管长入。有在治疗组之间的“总键距离”无统计学差异（)。然而，组1(图3(一个)）主观与11/12（91.7％）表现出粘合特性明显，在大于修复面积的50％切片显示整体更好的粘结相比9/12（75.0％）0组（图的3 (b))粘接特性超过50%或修复面积以上的构件。

3.3。SOFG-Stained部分

数据图4（a）和图4（b）显示两个软染色切片的例子。各组间“SOFG %阳性染色”差异无统计学意义(）用0组表现出相同数量相比于第1组（5/12，41.7％）阴性SOFG（即，绿复染）（5/12，41.7％）的构建体。虽然0组有更多的构建体（4/12，33.3％），其表现出50％或更多的正SOFG染色相比第1组（2/12，16.6％），这种差异并不显著。当检查“修复组织的厚度”本和治疗组，有组之间没有统计学差异显著（)。基于主观得分，出现相对于组0（5/12（41.7％）与薄修复组织）是存在（与薄修复组织8/12（66.7％））在第1组的部分之间更少修复组织。最后，在治疗组之间的半月板部分（远离切割边缘）的身体检查“细胞再增殖”的时候（没有统计学差异悉)。

4。讨论

本研究允许的无细胞半月板部分的修复和粘合的差异比较时骨髓基质干细胞以受控的处理和纤维蛋白相比于单独的纤维蛋白在活的有机体内模型。总体而言，结果血管坚持表现出显著上升到BMSC和纤维蛋白处理部分（)。主观上，结果显示，仅在“节间纤维组织”、“修复组织厚度”和“总结合百分比”等结果参数上，干细胞和纤维蛋白处理的构建物与仅用纤维蛋白处理的构建物相比，具有更好的结合和愈合特性。值得注意的是，本研究的统计结果可能受到处理组间细微差异和样本量较小的限制。

当与先前发表的作品相比，粘合的，只有在目前的研究中纤维蛋白处理结构可见度出现了不同。具体而言，斯科蒂等。(20在他们的研究中，只使用纤维蛋白组中没有发现血管粘连的证据，在他们的任何实验结构中也没有报告血管浸润的证据。相比之下，目前的研究显示，仅使用纤维蛋白的治疗组和添加bmsc的组中出现了多种结合的迹象。在目前的研究中，两个治疗组之间都有血管存在。目前尚不清楚是什么导致了这两项研究结果的差异。这可能是由于纤维蛋白来源的不同。Scotti等人[20]使用了商业制备的猪纤维蛋白产品，而目前的研究使用的是现场提取和制备的马纤维蛋白，通常在临床环境中进行。两项研究之间的另一个电位差是纤维蛋白涂层的厚度。图片由Scotti等人发表[20与目前的研究相比，在这些结构的周围显示了更厚的纤维蛋白层。更厚的纤维蛋白层可能会限制血管的侵袭，并改变外源性氧、细胞因子和细胞向构建物的扩散和传递。

在人类中，由于与关节囊相连，外侧三分之一的半月板血管分布良好，而轴向部分基本无血管[34,35]。由于该差异，弯月面的外部部分更可能与一个可行的修复愈合[34,35]。更薄的无血管部分和半月板韧带附件更可能有一个次优的修复，更可能成为reinjured在返回剧烈活动[14,34]。用BMSCs治疗构建体似乎能使构建体组织实现更大、更一致的血运重建。有显著的(）多个容器外部附着到第1点的构建体相比，组0在当前的研究中的构建体。举一个例子，请见图1(一)和1 (b)。可能的是，由骨髓基质细胞释放的血管生长因子[21,36,37]导致在生长在细胞处理过的部分容器的刺激，以及这些生长因子不存在于由斯科蒂等人先前的研究。(20]其中利用软骨细胞在它们的细胞构建体。这也是合理的，这些生长因子可以也影响在同一小鼠植入非BMSC（组0）的部分。具有在同一小鼠二者组0和组1的构建体将允许生长因子全身性吸收或通过皮下空间局部地扩散。这可能占相比斯科蒂等人目前的研究中发现的血管分布增加。(20]。增加血管的形成往往是半月板修复疗法，以提供在半月板修复组织的生理性支持的目标。因此这里看到的血管分布增加可能是在临床使用中受益[38,39]。

斯科蒂等人。(20]报道更线性的纤维修复组织和软骨细胞处理的构建体少纤维蛋白残余。这些结果反映在当前的研究中与BMSC治疗构建体的结果：稀释剂修复组织（第1组的66.6％相比，组0的构建体具有薄修复组织的41.75％）和更少的纤维蛋白的残余（第1组的25％构建体具有大量的部分之间的纤维蛋白的材料相比，在0组58.3％）。造成这种结果的一种解释是在细胞处理的样品产生的修复组织较少外来疤痕组织比那些没有细胞。

成熟半月板含有活的纤维软骨细胞，尽管轴部无血管性质。如果损伤发生，存活的细胞仍然存在，这些细胞可以被招募用于愈合。然而，研究表明，纤维软骨细胞凋亡与半月板损伤密切相关，甚至先于半月板损伤[40]。损伤区域发生的细胞凋亡大大减少了可用于修复的纤维软骨细胞，缺乏血管供应限制了细胞从其他位置迁移的机会[41]。在人类与半月板受伤的大型回顾性研究中，英格兰德等人。(10]研究发现，退行性半月板损伤是不太可能有一个满意的回报，以功能上相比外伤受伤的半月板。大多数构建体在两个组0（9/12）和组1（9/12）在目前的研究已经从切割边缘和修复组织本细胞向内生长。这些细胞可能有助于无血管半月板部分的复育，最终提高愈合。脱细胞半月板组织的再增殖这也将是愈合纤维软骨细胞的存在会为半月板植入物的长期生存能力是必要的关键。这超出了本研究的范围，以确定重新填充细胞的起源。

本文提出的研究有助于进一步描述该模型，并产生了可能具有临床意义的重要结果。利用这个模型可以进一步研究，更好地确定活体动物中纤维蛋白和骨髓间充质干细胞治疗的最佳条件。未发表的研究在体外在我们的实验室表明，纤维蛋白的特定浓度可以骨髓基质干细胞迁移最佳;然而，这些更稀浓度可能不提供尽可能多的支持早期愈合阶段期间保持组织并置。利用该模型和细胞标记物[38,42]以跟踪在不同时间点细胞的迁移可能有助于确定纤维蛋白的最生理有效浓度利用在活的有机体内。每处理表面积细胞的理想剂量可研究为好。与细胞标记技术的进一步研究也将提供确定哪些细胞被重新填充半月板组织参与部分和辅助的修复组织细胞的来源信息。这可以使医务人员能够更好地靶向治疗增加困难半月板损伤积极成果。

致谢

作者要感谢美国夸特马基金会为这个项目提供的资金支持，以及Sushan博士，D.V.M, Ph.D.， DACVP为其拍摄的图像。他们要感谢Jennifer Phillips, Christina Lee, p.h.d.， Susan James, T. K. Pope，以及Gail Holmes马形骨科研究中心和科罗拉多州立大学实验动物资源的工作人员，感谢他们对这个项目不可或缺的帮助。

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