巢蛋白蛋白质磷酸化在成人神经干细胞/祖细胞和内皮祖细胞

文摘

一个中间丝蛋白,巢蛋白,称为神经干/祖细胞标记。是显示所需的生存和自我更新显示神经干细胞巢蛋白基因敲除小鼠的表型。巢蛋白表达也被报道在血管内皮细胞中,我们最近报道巢蛋白表达在内皮祖细胞增殖,而不是成熟的内皮细胞。使用分析法定量组织磷酸化蛋白质组,我们研究磷酸化水平差异CNS成人神经干细胞巢蛋白和血管巢蛋白在成人从骨髓内皮祖细胞。我们发现495此处则在成人中枢神经系统的细胞溶解产物干/祖细胞和确定11重要巢蛋白磷酸化氨基酸残基的蛋白质。相比之下,内皮祖细胞显示没有明显的巢蛋白的磷酸化。我们也测量肿瘤内皮细胞的老鼠大脑和确定13巢蛋白磷酸化氨基酸残基的蛋白质。在成人中枢神经系统的11个磷酸化氨基酸巢蛋白,5 (S565, S570, S819、S883 S886)是中枢神经系统Nestin-specific磷酸化网站。CNS-specific磷酸化位点的检测巢蛋白,例如,由phospho-specific巢蛋白抗体,可以使中枢神经系统的表达巢蛋白血管巢蛋白区分开来。

1。介绍

巢蛋白是一个类VI中间丝蛋白表达在中枢神经系统(CNS)细胞未分化的发展。蛋白质被称为神经干细胞/祖细胞标记和所需的生存和自我更新神经干细胞(nsc) [1]。巢蛋白表达下调时,中枢神经系统干细胞/祖细胞分化成神经元或神经胶质细胞2,3),表达式是在成年中枢神经系统干细胞/祖细胞位于前脑神经性的区域(4,5]。巢蛋白表达也被报道在血管内皮细胞(ECs)从各种各样的成人non-CNS组织(6,7]。我们最近报道巢蛋白表达在增殖内皮祖细胞(epc),而不是成熟的ECs (8]。我们利用E/巢蛋白:使用第二intronic EGFP转基因小鼠研究neural-specific增强子元素巢蛋白基因表达(9,10),表明血管巢蛋白表达式是没有激活的CNS-specific增强剂巢蛋白基因(8]。这一发现表明,巢蛋白表达内皮祖细胞的细胞化学的类似于蛋白质表达在中枢神经系统干细胞/祖细胞,但基因表达的调控机制是不同的。

可逆的磷酸化蛋白质的构象变化,改变了它们的功能。许多蛋白质,包括细胞受体、酶和细胞内信号分子,被磷酸化和去磷酸化激活/停用。因此,可逆的磷酸化调节细胞过程中起着重要作用。巢蛋白的蛋白质在细胞质中中枢神经系统干细胞/祖细胞被认为在分配中发挥作用从共聚中间丝的女儿细胞波形蛋白在细胞分裂(11]。巢蛋白磷酸化的提升之外,还需观察有丝分裂重组的巢蛋白不灭的中枢神经前体鼠细胞系(12]。关于老鼠的大脑发展,500多个蛋白质磷酸化网站,包括巢蛋白,发现了phosphoproteomic分析(13]。然而,巢蛋白磷酸化尚未成年nsc的调查。使用分析法定量组织磷酸化蛋白质组,我们在目前的研究表明,不同的磷酸化水平在中枢神经系统发现成人nsc巢蛋白和血管巢蛋白在成人从骨髓内皮祖细胞。

2。材料和方法

2.1。动物

成人(8到10周大)野生型C57BL / 6 j小鼠买来SLC(静冈市,日本)。要解决过程都是通过庆应义塾大学实验动物保健和使用委员会,按照美国国立卫生研究院的指导方针,美国。

2.2。主要神经干细胞/祖细胞培养

Neurospheres生成从成年小鼠前脑如前所述8,10,14,15]。短暂,striata从成年小鼠解剖,孵化与胰蛋白酶解15分钟在37°C,磨碎,然后胰蛋白酶抑制剂方案补充道。分离细胞(5000 /毫升)被播种在neurosphere培养基组成DMEM-F12(1: 1),葡萄糖(0.6%)、谷氨酰胺(2毫米),碳酸氢钠(13.4毫米),玫瑰(5毫米)、胰岛素(25转铁蛋白(100 g / mL)g / mL)、孕酮(20 nM),硒酸钠(30 nM)和腐胺(60海里)补充了重组人表皮生长因子(EGF, 20 ng / mL)和重组人碱性纤维母细胞生长因子(bFGF, 20 ng / mL)。细胞培养7天在体外(DIV)和漂浮细胞集群形成的神经干细胞/祖细胞(neurospheres)。主要收集neurospheres和机械磨碎。分离细胞数和存储−20°C。

2.3。EPC文化

内皮祖细胞从单核细胞培养(跨国公司)在之前报道的文化条件下8]。股骨和胫骨的成年老鼠压碎,悬浮在αMEM (# 11900, Gibco表达载体,卡尔斯巴德,CA)补充10%胎牛血清(青霉素G的边后卫)和1%(10000单位/毫升)硫酸链霉素(10000g / mL) (PS),通过一个70 -过滤过滤器(细胞过滤器# 352350,猎鹰,贝德福德,MA)。跨国公司从骨髓细胞分离的聚蔗糖密度梯度离心(Ficoll-Paque + 1.077 g / mL,通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)。细胞(1×10⁶cell /毫升)镀在fibronectin-coated 6-well板块(Nunc # 140675年,鲁开德、丹麦)内皮基底中补充了5%的边后卫,血管内皮生长因子(VEGF)、bFGF,重组模拟胰岛素样生长因子- 1 (R³-IGF-1)、表皮生长因子、氢化可的松、抗坏血酸和庆大霉素/两性霉素b (EGM-2-MV子弹工具包cc - 3202、Lonza Walkersville, MD)。媒介改变了24小时后删除不依从细胞和每周更新。21岁的DIV,细胞被取消用0.25%胰蛋白酶和孵化1毫米EDTA然后储存在−20°C。

虽然一个独特的EPC标记没有被确认,内皮祖细胞具有细胞具有高增殖潜能的特点,显示典型的内皮特点和分化成ECs在体外(16]。内皮祖细胞获得上述文化条件下增殖标记为正Ki67, EC谱系标记CD31阳性和血管内皮钙粘蛋白的吸收1,1′双酯- 3,3,3′,3′-tetramethylindo-carbocyanine高氯酸盐Ac-LDL (DiI-Ac-LDL),负的成熟EC标记血管性血友病因子(vWF),能够分化为成熟ECs (8]。

2.4。电子商务行

中枢神经系统之间的比较磷酸化巢蛋白和血管内皮巢蛋白进一步增殖细胞,我们准备好的肿瘤ECs。细胞从老鼠大脑内皮瘤细胞系(弯曲。3cells CRL-2299, ATCC, Manassas, VA) were characterized as proliferative endothelial cells expressing vascular Nestin similar to EPCs and positive for mature EC marker vWF [8]。

欧共体是培养根据制造商的指示。短暂,细胞被维护在DMEM (# 12699, Gibco英杰公司)与10%的边后卫和1% PS补充。中重新每3到4天。细胞被孵化用0.25%胰蛋白酶和收获1毫米EDTA和存储−20°C。

2.5。分析法定量组织磷酸化蛋白质组

细胞处理分析基于质谱(MS)法对组织磷酸化蛋白质组加上小型在线液相色谱(LC)。蛋白质从细胞中提取(100000个细胞从成人neurospheres;1000000个细胞内皮祖细胞和肿瘤ECs)用12毫米钠脱氧胆酸盐和钠月桂酰sarcosinate 12毫米,与Lys-C和胰蛋白酶消化17]。此处则丰富了脂肪族羟基酸改性金属氧化物层析与二氧化钛(18),分析了nanoLC-MS / MS使用LTQ-Orbitrap仪器(热费希尔科学、不来梅、德国)。肽和蛋白质被确定使用吉祥物2.3版(矩阵科学、伦敦)SwissProt数据库。Label-free定量进行基于提取离子色谱图的峰面积确定此处则利用大众导航器(三井知识产业、东京、日本)。

3所示。结果

3.1。蛋白质磷酸化的中枢神经系统干细胞/祖细胞,内皮祖细胞,肿瘤ECs

中枢神经系统干细胞/祖细胞获得striata侧脑室外侧壁的成年老鼠大脑和成长为neurospheres在体外。Phosphoproteome分析发现495此处则在细胞溶解产物(表中1)。大约90%的neurosphere细胞磷酸化肽检测。类似比例的此处则以肿瘤ECs。然而,大约60%的肽在非肿瘤的增殖的内皮细胞,内皮祖细胞,被磷酸化,表明细胞内整体neurosphere细胞和细胞膜蛋白被激活而内皮祖细胞。一般来说,在丝氨酸磷酸化发生最常见,其次是苏氨酸。超过80%的磷酸化丝氨酸残基在网站我们的样本,磷酸化氨基酸的比例并没有不同neurosphere细胞,内皮祖细胞,肿瘤ECs(表1)。我们列表及其磷酸化氨基酸残基磷酸化蛋白质补充材料(网上的图1http://dx.doi.org/10.1155/2012/430138)。

3.2。巢蛋白磷酸化的中枢神经系统干细胞/祖细胞,内皮祖细胞,肿瘤ECs

分析识别法定量组织磷酸化蛋白质组10此处则和11个重要磷酸化氨基酸残基(峰面积> 1. e + 04)巢蛋白的蛋白质从成人neurosphere细胞(图1)。相比之下,来自成年小鼠骨髓内皮祖细胞显示没有明显的巢蛋白的磷酸化)。在肿瘤ECs, 13个重大磷酸化氨基酸残基被确定。因此,发现巢蛋白磷酸化在内皮祖细胞是不可能由于ECs的组织特异性。所有磷酸化氨基酸残基中发现neurosphere细胞和肿瘤ECs丝氨酸。尽管phosphothreonine在巢蛋白样品的永生化大鼠细胞系(12)和人类的海拉细胞(宫颈癌)19,20.),我们没有检测到的苏氨酸残基磷酸化巢蛋白蛋白质从我们的样品。五个磷酸化氨基酸残基(S565, S570, S819 S883, S886)被发现在neurosphere细胞,八(S575、S668 S813, S816, S1216, S1562, S1860,和S1861)被发现在肿瘤ECs,和六(S169、S728 S731, S1010, S1565,和S1837)被发现在neurosphere细胞和肿瘤ECs(图1)。

在中枢神经系统干细胞/祖细胞,巢蛋白蛋白质优先和heterotetramers形成各种各样的中间丝蛋白,特别是第三类型波形蛋白和IV型α-Internexin [21,22]。Phosphoproteome分析波形蛋白的磷酸化而不被发现α-Internexin样本的成人neurospheres,内皮祖细胞,肿瘤ECs补充材料(图1)。

4所示。讨论

最近的调查巢蛋白基因敲除小鼠报道,巢蛋白缺乏会导致胚胎神经上皮的杀伤力nsc的发展神经管表现出较低的数字和高水平的细胞凋亡1]。的差别,对这些巢蛋白在使用小干扰rna反对胚胎大脑皮层巢蛋白信使rna导致G1细胞循环逮捕和严重减少神经元的生成(23]。然而,没有数据报告在活的有机体内成人巢蛋白的功能。瞬时转染的巢蛋白-non-expressing细胞表达载体携带的老鼠巢蛋白互补脱氧核糖核酸可以促进磷酸化的拆卸波形蛋白中间丝在细胞质中有丝分裂(11]。分析检测磷酸化波形蛋白在成人neurosphere法我们组织磷酸化蛋白质组样品。因此,巢蛋白在成人nsc可能调解的分布波形蛋白蛋白质在子细胞自我更新和神经发生。

在大鼠神经祖细胞,巢蛋白的有丝分裂重组是伴随着巢蛋白的磷酸化升高,和T316被确认为一个巢蛋白磷酸化的网站12]。磷酸化苏氨酸中没有检测到巢蛋白从成人中枢神经系统干细胞/祖细胞,内皮祖细胞或肿瘤ECs在目前的研究。然而,我们确定了11个重要网站在巢蛋白的丝氨酸残基磷酸化蛋白质从成人中枢神经系统干细胞/祖细胞分析法利用定量组织磷酸化蛋白质组。磷酸化氨基酸的差异和技术进步在磷酸化蛋白质组磷酸化可能是由于网站分析和/或细胞来源的差异。蛋白质磷酸化丝氨酸残基在巢蛋白已报告从小鼠胚胎的大脑13和老鼠的皮肤黑素瘤24),已经被人类海拉细胞类似的数据假设[19,20.]。11中磷酸化丝氨酸残基在巢蛋白的蛋白质,我们确定了只有两个(S565和S1010)据报道之前;另外九名(S169 S570、S728 S731, S819, S883, S886, S1565,和S1837)在目前的研究新发现。

巢蛋白的蛋白质表达不仅在nsc,而且在组织干细胞/祖细胞胚芽层之外,包括间充质干细胞(25),血管内皮细胞(6- - - - - -8],肌肉[26- - - - - -28),睾丸(29日),和牙齿30.]。巢蛋白也在丰富的祖细胞来源于胚胎干细胞有可能发展成neuroectodermal,内胚层、中胚层的血统(31日]。我们最近报道,在增殖ECs巢蛋白表达,可能是有用的作为一个新血管形成的标志(8]。巢蛋白表达已经被报道在癌症的血管内皮32,33]。细胞类型特异的元素的独立巢蛋白在转基因小鼠基因识别;第一内含子指导记者基因表达中胚层体节,和第二个基因内区包含在nsc增强的功能(28]。尽管监管机制巢蛋白基因表达在增生性血管细胞不同于那些在nsc,血管巢蛋白的蛋白表达是细胞化学的类似于CNS巢蛋白(8]。巢蛋白的磷酸化蛋白质从成人neurospheres允许它可以区别在内皮祖细胞巢蛋白。虽然在肿瘤ECs巢蛋白磷酸化也观察到,分析识别法我们组织磷酸化蛋白质组CNS-specific磷酸化网站,暗示phospho-specific巢蛋白抗体可能区分中枢神经系统和血管巢蛋白蛋白的表达。

5。结论

分析发现巢蛋白磷酸化丝氨酸残基法定量组织磷酸化蛋白质组从成年小鼠中枢神经系统干细胞/祖细胞。从内皮祖细胞巢蛋白磷酸化并没有观察到。CNS-specific磷酸化位点的检测巢蛋白,例如,由phospho-specific巢蛋白抗体,可以使中枢神经系统的表达巢蛋白血管巢蛋白区分开来。

承认

本研究支持的科研补助金从日本教育部,文化,科学,体育,和技术J.N.

补充材料

引用

1. d .公园,a . p .香f·f·毛et al .,“巢蛋白需要适当的神经干细胞的自我更新,“干细胞,28卷,不。12日,第2171 - 2162页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. j . Dahlstrand m . Lardelli, Lendahl,“巢蛋白mRNA表达与中枢神经系统在许多祖细胞状态,但不是全部,地区发展中中枢神经系统,”大脑发育的研究,卷84,不。1,第129 - 109页,1995。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. k . Frederikson r·d·g·麦凯,”鼠神经上皮的前体细胞的增殖和分化在活的有机体内”,神经科学杂志》上,8卷,不。4、1144 - 1151年,1988页。视图:谷歌学术搜索
4. c . m . Morshead b·a·雷诺兹c·g·克雷格et al .,“神经干细胞在成年哺乳动物的前脑:相对静止的族群的室细胞,”神经元,13卷,不。5,1071 - 1082年,1994页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. b·a·雷诺兹和s.w”一代的神经元和星形胶质细胞从孤立的成年哺乳动物中枢神经系统的细胞,”科学,卷255,不。5052年,第1710 - 1707页,1992年。视图:谷歌学术搜索
6. t·克莱恩,z, h . Heimberg, o·d·马德森r·s·海勒和p . Serup“巢蛋白表达在成人胰腺血管内皮细胞,”组织化学与细胞化学杂志》上,51卷,不。6,697 - 706年,2003页。视图:谷歌学术搜索
7. j . Mokry d . Cizkova美国菲利普et al .,“由新成立的人类血管巢蛋白表达,“干细胞与发展,13卷,不。6,658 - 664年,2004页。视图:谷歌学术搜索
8. 铃木,j .只柴田先生,y Mastuzaki, h·冈,“神经干细胞/祖细胞标志巢蛋白表达在内皮细胞增殖,但不成熟的血管,”组织化学与细胞化学杂志》上,卷。58岁的没有。8,721 - 730年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. c·b·约翰逊,c·洛锡安,m .等h·冈和Lendahl,“巢蛋白表达增强器要求在正常成人中枢神经系统,伤”神经科学研究杂志,卷69,不。6,784 - 794年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. a .川口Miyata t . k . Sawamoto et al .,“Nestin-EGFP转基因老鼠:可视化的中枢神经干细胞的自我更新和multipotency,”分子和细胞神经科学,17卷,不。2、259 - 273年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 黄懿慧周,s . Khuon h·赫曼和r·d·高盛“巢蛋白促进phosphorylation-dependent拆卸波形蛋白中间丝在有丝分裂期间,“细胞的分子生物学,14卷,不。4、1468 - 1478年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. c . m . Sahlgren a . Mikhailov j·赫尔曼et al .,“有丝分裂巢蛋白中间丝蛋白的重组包括cdc2激酶磷酸化,”《生物化学》杂志上,卷276,不。19日,16456 - 16463年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. b . a . Ballif j . Villen s . a . Beausoleil d·施瓦茨和s . p . Gygi“Phosphoproteomic分析发展中老鼠的大脑,”分子和细胞蛋白质组学,3卷,不。11日,第1101 - 1093页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. a . Murayama y松崎,川口,t . Shimazaki h·冈,“流仪分析开发和成年小鼠神经干细胞的大脑,”神经科学研究杂志,卷69,不。6,837 - 847年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. t . Shimazaki t .取,s.w“纤毛神经营养因子/白血病抑制因子/ gp130受体复杂操作维护的哺乳动物的前脑神经干细胞,”神经科学杂志》上,21卷,不。19日,7642 - 7653年,2001页。视图:谷歌学术搜索
16. f·蒂默曼,j .李子,m . c .尤德d·a·英格拉姆b . Vandekerckhove和j·情况下,内皮祖细胞:定义的身份?”细胞和分子医学杂志》上,13卷,不。1,第102 - 87页,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. t .此外:齐藤,m .获利和y Ishihama,“公正的定量的大肠杆菌膜蛋白质组使用相转移表面活性剂,”分子和细胞蛋白质组学,8卷,不。12日,第2777 - 2770页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. n Sugiyama t .此外,k .信田a .中村m .获利和y Ishihama,“此处则浓缩了脂肪族羟基酸改性金属氧化物层析nano-LC-MS /女士在蛋白质组学的应用程序中,“分子和细胞蛋白质组学》第六卷,没有。6,1103 - 1109年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. j·v·奥尔森,b . Blagoev f . Gnad et al .,“全球,在活的有机体内和位点磷酸化动态信号网络。”细胞,卷127,不。3、635 - 648年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. n . Dephoure c .周j . Villen et al .,“有丝分裂磷酸化定量阿特拉斯,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷105,不。31日,第10767 - 10762页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. k . Michalczyk和m .齐曼巢蛋白在细胞细胞骨架组织结构和预测功能,“组织学和组织病理学,20卷,不。2、665 - 671年,2005页。视图:谷歌学术搜索
22. 贝特c . Eliasson c . Sahlgren c . h . et al .,“中间丝蛋白伙伴关系在星形胶质细胞,”《生物化学》杂志上,卷274,不。34岁,23996 - 24006年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. x j .雪和x元,“巢蛋白mitogen-stimulated增殖的神经祖细胞是至关重要的,”分子和细胞神经科学,45卷,不。1,26-36,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. s . Zanivan f . Gnad s a Wickstrom et al .,“固体肿瘤蛋白质组分析法和组织磷酸化蛋白质组高分辨率质谱,”蛋白质组研究期刊》的研究,7卷,不。12日,第5326 - 5314页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. s . Mendez-Ferrer t . v . Michurina f·费拉罗et al .,“骨髓间充质干细胞和造血的形成一个独特的利基市场,”自然,卷466,不。7308年,第834 - 829页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. a . m . Kachinsky j . a . Dominov和j·b·米勒“心脏肌细胞生成的中间丝:发展中老鼠的心,巢蛋白”组织化学与细胞化学杂志》上,43卷,不。8,843 - 847年,1995页。视图:谷歌学术搜索
27. t . Sejersen和美国Lendahl”,中间丝状体的瞬态表达巢蛋白在骨骼肌的发展过程中,“《细胞科学第4部分,卷。106年,第1300 - 1291页,1993年。视图:谷歌学术搜索
28. l·齐默尔曼帕尔,美国Lendahl et al .,“独立监管元素巢蛋白基因直接转基因表达神经干细胞或肌肉前体细胞,”神经元,12卷,不。1,11-24,1994页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. k . Frojdman l . j . Pelliniemi Lendahl,维尔塔宁,和j·e·埃里克森“巢蛋白中间丝蛋白发生暂时性的区分睾丸的老鼠和老鼠,”分化,卷61,不。4、243 - 249年,1997页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. c·塔林a . ras t . a . Mitsiadis k .油炸Lendahl,和j . Wroblewski”中间丝巢蛋白的表达在啮齿动物牙齿发育期间,“国际发育生物学杂志》上,39卷,不。6,947 - 956年,1995页。视图:谷歌学术搜索
31. c·威斯a . Rolletschek g·卡尼亚et al .,“巢蛋白表达了财产multi-lineage祖细胞?”细胞和分子生命科学,卷61,不。月19日至20日,第2522 - 2510页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. m . Aihara k . i Sugawara s鸟居et al .,“血管生成endothelium-specific巢蛋白表达增强的第一内含子巢蛋白基因,”实验室调查,卷84,不。12日,第1592 - 1581页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. n . Teranishi z Naito, t . Ishiwata et al .,“识别neovasculature使用巢蛋白在结直肠癌,”国际肿瘤学杂志,30卷,不。3、593 - 603年,2007页。视图:谷歌学术搜索

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