SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 430138年 10.1155 / 2012/430138 430138年 研究文章 巢蛋白蛋白质磷酸化在成人神经干细胞/祖细胞和内皮祖细胞 只 小君 1 铃木 百合 1 那一定很有意思 武 2 Ishihama 靖先生 2、3 冈野 称 4 Gonzalez-Perez 奥斯卡 1 部门的紧急和危重病医学 庆应义塾大学医学院 Shinanomachi 35岁,新宿 东京160 - 8582 日本 keio.ac.jp 2 先进的生物科学研究所 庆应义塾大学 403 - 1 Daihoji,鹤冈 山形997 - 0017 日本 keio.ac.jp 3 制药科学研究生院 京都大学 《京都议定书》606 - 8501 日本 kyoto-u.ac.jp 4 生理学系 庆应义塾大学医学院 Shinanomachi 35岁,新宿 东京160 - 8582 日本 keio.ac.jp 2012年 13 9 2012年 2012年 01 07年 2012年 03 08年 2012年 2012年 版权©2012只小君的et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

一个中间丝蛋白,巢蛋白,称为神经干/祖细胞标记。是显示所需的生存和自我更新显示神经干细胞巢蛋白基因敲除小鼠的表型。巢蛋白表达也被报道在血管内皮细胞中,我们最近报道巢蛋白表达在内皮祖细胞增殖,而不是成熟的内皮细胞。使用分析法定量组织磷酸化蛋白质组,我们研究磷酸化水平差异CNS成人神经干细胞巢蛋白和血管巢蛋白在成人从骨髓内皮祖细胞。我们发现495此处则在成人中枢神经系统的细胞溶解产物干/祖细胞和确定11重要巢蛋白磷酸化氨基酸残基的蛋白质。相比之下,内皮祖细胞显示没有明显的巢蛋白的磷酸化。我们也测量肿瘤内皮细胞的老鼠大脑和确定13巢蛋白磷酸化氨基酸残基的蛋白质。在成人中枢神经系统的11个磷酸化氨基酸巢蛋白,5 (S565, S570, S819、S883 S886)是中枢神经系统Nestin-specific磷酸化网站。CNS-specific磷酸化位点的检测巢蛋白,例如,由phospho-specific巢蛋白抗体,可以使中枢神经系统的表达巢蛋白血管巢蛋白区分开来。

 1。介绍

巢蛋白是一个类VI中间丝蛋白表达在中枢神经系统(CNS)细胞未分化的发展。蛋白质被称为神经干细胞/祖细胞标记和所需的生存和自我更新神经干细胞(nsc) [ 1]。巢蛋白表达下调时,中枢神经系统干细胞/祖细胞分化成神经元或神经胶质细胞 2, 3),表达式是在成年中枢神经系统干细胞/祖细胞位于前脑神经性的区域( 4, 5]。巢蛋白表达也被报道在血管内皮细胞(ECs)从各种各样的成人non-CNS组织( 6, 7]。我们最近报道巢蛋白表达在增殖内皮祖细胞(epc),而不是成熟的ECs ( 8]。我们利用E /巢蛋白:使用第二intronic EGFP转基因小鼠研究neural-specific增强子元素 巢蛋白基因表达( 9, 10),表明血管 巢蛋白表达式是没有激活的CNS-specific增强剂 巢蛋白基因( 8]。这一发现表明,巢蛋白表达内皮祖细胞的细胞化学的类似于蛋白质表达在中枢神经系统干细胞/祖细胞,但基因表达的调控机制是不同的。

可逆的磷酸化蛋白质的构象变化,改变了它们的功能。许多蛋白质,包括细胞受体、酶和细胞内信号分子,被磷酸化和去磷酸化激活/停用。因此,可逆的磷酸化调节细胞过程中起着重要作用。巢蛋白的蛋白质在细胞质中中枢神经系统干细胞/祖细胞被认为在分配中发挥作用从共聚中间丝的女儿细胞波形蛋白在细胞分裂( 11]。巢蛋白磷酸化的提升之外,还需观察有丝分裂重组的巢蛋白不灭的中枢神经前体鼠细胞系( 12]。关于老鼠的大脑发展,500多个蛋白质磷酸化网站,包括巢蛋白,发现了phosphoproteomic分析( 13]。然而,巢蛋白磷酸化尚未成年nsc的调查。使用分析法定量组织磷酸化蛋白质组,我们在目前的研究表明,不同的磷酸化水平在中枢神经系统发现成人nsc巢蛋白和血管巢蛋白在成人从骨髓内皮祖细胞。

 2。材料和方法 2.1。动物

成人(8到10周大)野生型C57BL / 6 j小鼠买来SLC(静冈市,日本)。要解决过程都是通过庆应义塾大学实验动物保健和使用委员会,按照美国国立卫生研究院的指导方针,美国。

 2.2。主要神经干细胞/祖细胞培养

Neurospheres生成从成年小鼠前脑如前所述 8, 10, 14, 15]。短暂,striata从成年小鼠解剖,孵化与胰蛋白酶解15分钟在37°C,磨碎,然后胰蛋白酶抑制剂方案补充道。分离细胞(5000 /毫升)被播种在neurosphere培养基组成DMEM-F12(1: 1),葡萄糖(0.6%)、谷氨酰胺(2毫米),碳酸氢钠(13.4毫米),玫瑰(5毫米)、胰岛素(25 μ 转铁蛋白(100 g / mL) μ g / mL)、孕酮(20 nM),硒酸钠(30 nM)和腐胺(60海里)补充了重组人表皮生长因子(EGF, 20 ng / mL)和重组人碱性纤维母细胞生长因子(bFGF, 20 ng / mL)。细胞培养7天 在体外(DIV)和漂浮细胞集群形成的神经干细胞/祖细胞(neurospheres)。主要收集neurospheres和机械磨碎。分离细胞数和存储−20°C。

 2.3。EPC文化

内皮祖细胞从单核细胞培养(跨国公司)在之前报道的文化条件下 8]。股骨和胫骨的成年老鼠压碎,悬浮在 αMEM (# 11900, Gibco表达载体,卡尔斯巴德,CA)补充10%胎牛血清(青霉素G的边后卫)和1%(10000单位/毫升)硫酸链霉素(10000 μ g / mL) (PS),通过一个70 -过滤 μ 过滤器(细胞过滤器# 352350,猎鹰,贝德福德,MA)。跨国公司从骨髓细胞分离的聚蔗糖密度梯度离心(Ficoll-Paque + 1.077 g / mL,通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)。细胞(1×106cell /毫升)镀在fibronectin-coated 6-well板块(Nunc # 140675年,鲁开德、丹麦)内皮基底中补充了5%的边后卫,血管内皮生长因子(VEGF)、bFGF,重组模拟胰岛素样生长因子- 1 (R3-IGF-1)、表皮生长因子、氢化可的松、抗坏血酸和庆大霉素/两性霉素b (EGM-2-MV子弹工具包cc - 3202、Lonza Walkersville, MD)。媒介改变了24小时后删除不依从细胞和每周更新。21岁的DIV,细胞被取消用0.25%胰蛋白酶和孵化1毫米EDTA然后储存在−20°C。

虽然一个独特的EPC标记没有被确认,内皮祖细胞具有细胞具有高增殖潜能的特点,显示典型的内皮特点和分化成ECs 在体外( 16]。内皮祖细胞获得上述文化条件下增殖标记为正Ki67, EC谱系标记CD31阳性和血管内皮钙粘蛋白的吸收1,1′双酯- 3,3,3′,3′-tetramethylindo-carbocyanine高氯酸盐Ac-LDL (DiI-Ac-LDL),负的成熟EC标记血管性血友病因子(vWF),能够分化为成熟ECs ( 8]。

 2.4。电子商务行

中枢神经系统之间的比较磷酸化巢蛋白和血管内皮巢蛋白进一步增殖细胞,我们准备好的肿瘤ECs。细胞从老鼠大脑内皮瘤细胞系(弯曲。3cells CRL-2299, ATCC, Manassas, VA) were characterized as proliferative endothelial cells expressing vascular Nestin similar to EPCs and positive for mature EC marker vWF [ 8]。

欧共体是培养根据制造商的指示。短暂,细胞被维护在DMEM (# 12699, Gibco英杰公司)与10%的边后卫和1% PS补充。中重新每3到4天。细胞被孵化用0.25%胰蛋白酶和收获1毫米EDTA和存储−20°C。

 2.5。分析法定量组织磷酸化蛋白质组

细胞处理分析基于质谱(MS)法对组织磷酸化蛋白质组加上小型在线液相色谱(LC)。蛋白质从细胞中提取(100000个细胞从成人neurospheres;1000000个细胞内皮祖细胞和肿瘤ECs)用12毫米钠脱氧胆酸盐和钠月桂酰sarcosinate 12毫米,与Lys-C和胰蛋白酶消化 17]。此处则丰富了脂肪族羟基酸改性金属氧化物层析与二氧化钛( 18),分析了nanoLC-MS / MS使用LTQ-Orbitrap仪器(热费希尔科学、不来梅、德国)。肽和蛋白质被确定使用吉祥物2.3版(矩阵科学、伦敦)SwissProt数据库。Label-free定量进行基于提取离子色谱图的峰面积确定此处则利用大众导航器(三井知识产业、东京、日本)。

 3所示。结果 3.1。蛋白质磷酸化的中枢神经系统干细胞/祖细胞,内皮祖细胞,肿瘤ECs

中枢神经系统干细胞/祖细胞获得striata侧脑室外侧壁的成年老鼠大脑和成长为neurospheres 在体外。Phosphoproteome分析发现495此处则在细胞溶解产物(表中 1)。大约90%的neurosphere细胞磷酸化肽检测。类似比例的此处则以肿瘤ECs。然而,大约60%的肽在非肿瘤的增殖的内皮细胞,内皮祖细胞,被磷酸化,表明细胞内整体neurosphere细胞和细胞膜蛋白被激活而内皮祖细胞。一般来说,在丝氨酸磷酸化发生最常见,其次是苏氨酸。超过80%的磷酸化丝氨酸残基在网站我们的样本,磷酸化氨基酸的比例并没有不同neurosphere细胞,内皮祖细胞,肿瘤ECs(表 1)。我们列表及其磷酸化氨基酸残基磷酸化蛋白在图1补充材料(网上,doi: 10.1155 / 2012/430138)。

蛋白质磷酸化的成年中枢神经系统干细胞/祖细胞,内皮祖细胞,肿瘤ECs。

pPeptides(pPeptides /总肽) pSites Multi-pPeptides
(pSite /总pSites) (单或multi-pSite肽/总pPeptides)
丝氨酸 苏氨酸 酪氨酸 1便士 2 p > 2 p
Neurospheres 495例(91.2%) 443例(84.2%) 71例(13.5%) 12 (2.3%) 401例(81.0%) 74例(14.9%) 20 (4.0%)
内皮祖细胞 250±5 (59.7%) 194±8 (87.4%) 20±3 (9.0%) 8±0 (3.6%) 228±6 (91.0%) 19±0 (7.4%) 4±0 (1.6%)
肿瘤ECs 980例(97.8%) 896例(88.1%) 103例(10.1%) 18 (1.8%) 675例(68.9%) 256例(26.1%) 49 (5.0%)

pPeptides,此处则;pSites磷酸化网站;multi-pPeptides multi-phosphorylated肽;1 p, single-phosphorylated网站;2 p,两个磷酸化网站。数据平均值±标准偏差。

 3.2。巢蛋白磷酸化的中枢神经系统干细胞/祖细胞,内皮祖细胞,肿瘤ECs

分析识别法定量组织磷酸化蛋白质组10此处则和11个重要磷酸化氨基酸残基(峰面积> 1. e + 04)巢蛋白的蛋白质从成人neurosphere细胞(图 1)。相比之下,来自成年小鼠骨髓内皮祖细胞显示没有明显的巢蛋白的磷酸化 n = 2 )。在肿瘤ECs, 13个重大磷酸化氨基酸残基被确定。因此,发现巢蛋白磷酸化在内皮祖细胞是不可能由于ECs的组织特异性。所有磷酸化氨基酸残基中发现neurosphere细胞和肿瘤ECs丝氨酸。尽管phosphothreonine在巢蛋白样品的永生化大鼠细胞系( 12)和人类的海拉细胞(宫颈癌) 19, 20.),我们没有检测到的苏氨酸残基磷酸化巢蛋白蛋白质从我们的样品。五个磷酸化氨基酸残基(S565, S570, S819 S883, S886)被发现在neurosphere细胞,八(S575、S668 S813, S816, S1216, S1562, S1860,和S1861)被发现在肿瘤ECs,和六(S169、S728 S731, S1010, S1565,和S1837)被发现在neurosphere细胞和肿瘤ECs(图 1)。

巢蛋白分析法定量组织磷酸化蛋白质组。以上的峰面积 1 。 E + 04 显示重要的磷酸化检测到MS / MS。pSites,磷酸化的氨基酸残基。

在中枢神经系统干细胞/祖细胞,巢蛋白蛋白质优先和heterotetramers形成各种各样的中间丝蛋白,特别是第三类型波形蛋白和IV型 α-Internexin [ 21, 22]。Phosphoproteome分析波形蛋白的磷酸化而不被发现 α-Internexin样本的成人neurospheres,内皮祖细胞,肿瘤ECs补充材料(图1)。

 4所示。讨论

最近的调查 巢蛋白基因敲除小鼠报道,巢蛋白缺乏会导致胚胎神经上皮的杀伤力nsc的发展神经管表现出较低的数字和高水平的细胞凋亡 1]。的差别,对这些 巢蛋白在使用小干扰rna反对胚胎大脑皮层 巢蛋白信使rna导致G1细胞循环逮捕和严重减少神经元的生成( 23]。然而,没有数据报告 在活的有机体内成人巢蛋白的功能。瞬时转染的 巢蛋白-non-expressing细胞表达载体携带的老鼠 巢蛋白互补脱氧核糖核酸可以促进磷酸化的拆卸波形蛋白中间丝在细胞质中有丝分裂( 11]。分析检测磷酸化波形蛋白在成人neurosphere法我们组织磷酸化蛋白质组样品。因此,巢蛋白在成人nsc可能调解的分布波形蛋白蛋白质在子细胞自我更新和神经发生。

在大鼠神经祖细胞,巢蛋白的有丝分裂重组是伴随着巢蛋白的磷酸化升高,和T316被确认为一个巢蛋白磷酸化的网站 12]。磷酸化苏氨酸中没有检测到巢蛋白从成人中枢神经系统干细胞/祖细胞,内皮祖细胞或肿瘤ECs在目前的研究。然而,我们确定了11个重要网站在巢蛋白的丝氨酸残基磷酸化蛋白质从成人中枢神经系统干细胞/祖细胞分析法利用定量组织磷酸化蛋白质组。磷酸化氨基酸的差异和技术进步在磷酸化蛋白质组磷酸化可能是由于网站分析和/或细胞来源的差异。蛋白质磷酸化丝氨酸残基在巢蛋白已报告从小鼠胚胎的大脑 13和老鼠的皮肤黑素瘤 24),已经被人类海拉细胞类似的数据假设[ 19, 20.]。11中磷酸化丝氨酸残基在巢蛋白的蛋白质,我们确定了只有两个(S565和S1010)据报道之前;另外九名(S169 S570、S728 S731, S819, S883, S886, S1565,和S1837)在目前的研究新发现。

巢蛋白的蛋白质表达不仅在nsc,而且在组织干细胞/祖细胞胚芽层之外,包括间充质干细胞( 25),血管内皮细胞( 6- - - - - - 8],肌肉[ 26- - - - - - 28),睾丸( 29日),和牙齿 30.]。巢蛋白也在丰富的祖细胞来源于胚胎干细胞有可能发展成neuroectodermal,内胚层、中胚层的血统( 31日]。我们最近报道,在增殖ECs巢蛋白表达,可能是有用的作为一个新血管形成的标志( 8]。巢蛋白表达已经被报道在癌症的血管内皮 32, 33]。细胞类型特异的元素的独立 巢蛋白在转基因小鼠基因识别;第一内含子指导记者基因表达中胚层体节,和第二个基因内区包含在nsc增强的功能( 28]。尽管监管机制 巢蛋白基因表达在增生性血管细胞不同于那些在nsc,血管巢蛋白的蛋白表达是细胞化学的类似于CNS巢蛋白( 8]。巢蛋白的磷酸化蛋白质从成人neurospheres允许它可以区别在内皮祖细胞巢蛋白。虽然在肿瘤ECs巢蛋白磷酸化也观察到,分析识别法我们组织磷酸化蛋白质组CNS-specific磷酸化网站,暗示phospho-specific巢蛋白抗体可能区分中枢神经系统和血管巢蛋白蛋白的表达。

 5。结论

分析发现巢蛋白磷酸化丝氨酸残基法定量组织磷酸化蛋白质组从成年小鼠中枢神经系统干细胞/祖细胞。从内皮祖细胞巢蛋白磷酸化并没有观察到。CNS-specific磷酸化位点的检测巢蛋白,例如,由phospho-specific巢蛋白抗体,可以使中枢神经系统的表达巢蛋白血管巢蛋白区分开来。

 承认

本研究支持的科研补助金从日本教育部,文化,科学,体育,和技术J.N.

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