药物发现模式和毒性测试使用胚胎干细胞和诱导性多功能Stem-Cell-Derived心脏和神经细胞

文摘

诱导多能干细胞的发展(万能)使用强制特定的转录因子的表达改变了干细胞研究领域广泛。两个重要的局限性研究胚胎干细胞的应用(ESCs),即道德和免疫问题,可以使用万能规避。自第一个万能的发展,巨大的努力已经指向方法的发展提高流程的效率,降低的程度与重组过程相关的基因修改。ESCs的lineage-specific建立差异化协议开发被应用于万能,因为他们有很大的潜力在再生医学细胞治疗,疾病建模对药物开发或基础科学,,最后但并非最不重要,毒性测试。综述努力旨在实用发展iPSC分化神经/心脏血统和进一步使用这些iPSCs-derived细胞进行药物开发和毒性测试。

1。介绍

诱导多能性/细胞重新编程的历史可以追溯到1950年代,当布里格斯和王了核移植技术(NT)测试后晚期囊胚细胞转移的发展潜力为阐明非洲爪蟾蜍卵母细胞(1]。后来实验(2,3]和分化细胞的细胞核转移到两栖动物的卵母细胞导致的生产生活后代暗示分化的遗传和表观遗传重编程细胞全能/多能性状态。在哺乳动物中,第一个adult-cell-derived动物,多利羊,是使用SCNT直到1997年(4),加强差异化的哺乳动物细胞的表观遗传重编程的概念全能/多能状态由卵质。几个报告后证明了卵母细胞包含某些因素负责转移基因的重组(5,6]。

此外的融合体细胞胚胎性癌等多能干细胞的细胞(ECCs)源自畸胎癌7,8)能够诱导多能性的体细胞(9]。这表明,多能细胞包含某些因素负责体细胞的转换到多能性状态。胚胎干细胞(ESCs)来自老鼠的内细胞团10),随后从人类囊胚(11)被认为是多能。鼠标的ESCs能够导致各种各样的组织生活的后代后注入到胚泡。ESCs的多能性的人类和小鼠体内已经被证明通过畸胎瘤的形成和体外胚状体体分化分析形成组织的三个胚芽层(内胚层、外胚层和中胚层)[12]。OCT4等关键转录因子的表达,SOX2, NANOG是强制性的让这些细胞自我更新和多潜能。与体细胞融合ESCs导致转换的体细胞分化多能性状态。

上述的观察结论是多能细胞有一定的监管途径包括强大的转录因子,足以恢复体细胞多能性状态。24种不同转录因子的筛选实验:集团(13)出人意料地证明代诱导多能干细胞(万能)要求只有四个转录因子的结合:OCT4、SOX2, KLF4,原癌基因(OSKM) [13]。这些细胞则是几乎相同的ESCs在分子以及形态学水平。代万能干细胞研究已经从根本上改变了很多。的情况则来源于体细胞,引发的伦理问题和immunocompatibility问题使用的ESCs细胞疗法是可以避免的。老鼠和人类细胞则因此可以用于研究早期发育过程中,疾病机制,细胞疗法,药物发现和毒性测试化验。方法开发生产没有/更少的基因改造的细胞则是在考试的鲁棒性和易用性。

2。方法生产万能

自描述的第一万能鼠标(13和人类14),几种优化方法已经开发生产万能各种组织和物种(15- - - - - -20.]。从原始OSKM原癌基因因素被认为负责致瘤性(21),从而影响细胞的潜在临床应用。因此,屏幕是努力更多的转录因子,则是用一组转录因子OCT4、SOX2, NANOG, LIN28建议选择影响因素重组所需的路径(22- - - - - -24]。也可以生成的细胞则用更少的转录因子(25]。最初的技术涉及使用逆转录病毒、慢病毒载体的转导重组因子。这种技术会导致病毒载体的整合基因组中引起插入突变,这些细胞是不可能接受的临床用途。这个问题部分克服了单个多顺反子的使用慢病毒载体携带所有OSKM因素减少插入在基因组的数量26,27]。此外,使用nonintegrative病毒载体也被建议(28]。

选项对交付重组因子较低或没有基因改造包括使用LoxP网站和Cre-induced切除的transgenes-this取得时成功的transposon-mediated基因转移的建议切除转座酶的综合矢量序列从未发表(29日- - - - - -31日]。

蛋白质转导可以完全取代需要代万能干细胞基因传递。蛋白质的结合的短肽负责细胞渗透可以用于蛋白进入细胞的交付。老鼠和人类用这种方法生成的细胞则使用纯化polyarginine-tagged OCT4、SOX2, KLF4,原癌基因蛋白(32- - - - - -34]。Yamanaka因素也被引入了一个mRNA-transfection方法,据报道,尽管这种方法更有效率,而不是基于整合到宿主基因组中,仍然有一个非常低的但不是微不足道的风险基因改变的外生物质引入细胞核酸(35]。

但直到最近,蛋白质则被认为是最好的方法,使用小分子核糖核酸(microrna)有或没有转录因子已被证明是一种有效的方法来生成这些细胞(36,37]。的生成则只使用microrna没有转录因子提供了一个有趣的难题关于重组的机制37]。尽管miRNA-mediated重组背后的神秘的机制,目前这种方法提供了发表收益率最高的“重编程”的细胞,不修改的基因组cells-qualifying miRNA-reprogrammed细胞潜在的临床应用。然而,进一步评估和确认由独立的团队将需要证明任何给定的优越性方法虽然都成为商用(和专利保护)的几个月第一次出版,通常没有独立的验证。

3所示。ESCs和万能药物发现和毒性测试

开发可靠的系统研究开发新药物毒性是一个主要的挑战和人类安全的药物治疗。目前,毒理学测试是基于建立不朽的癌细胞系含有染色体异常,主要外植体细胞,和实验室动物。永生化细胞系,显示一些特性让人想起癌症,模拟正常的生理状态和生物体内的病变。主要外植体文化的异质性导致不一致的结果和低毒性测试的重现性。利用活体动物模型对毒性测试可能不模仿人体生理学,可以提高道德/动物福利问题,相当昂贵。ESCs的研究,则承诺提高药物发现和开发通过提供简单,重现性好,且经济有效的药物毒性测试工具开发,另一方面,研究疾病机制和途径(38- - - - - -40]。模拟人类疾病在标准化的细胞培养和高通量药物筛选的机会是使用万能[的潜在优势38]。针对病人的细胞则能提高药物发现的效率,帮助药物有效的识别特定的患者群体。

ESCs的,在某种程度上则分化成心脏或为神经细胞已经被广泛用于药物发现和毒性测试。这个应用程序是最先进和实用的多能细胞;然而,大型制药公司的验收采用新方法和替换完善和fda批准的测试方法是一个相当缓慢的过程40- - - - - -43]。因此,疾病模型由细胞则没有被用于药物的发展已经达到了临床试验。一些实验和持续的努力将本文的其余部分的重点。

4所示。ESC -在药物发现和iPSC-Derived神经元

神经退行性疾病包括帕金森病(PD),阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病(HD)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)对社会构成越来越大的负担。神经障碍的机制如AD和PD并不广为人知,由于有限的可访问性的病变组织。几个iPSC行来自脊髓性肌萎缩(SMA) [44,精神分裂症45),家族性神经异常(FD) [46],Friedreichs共济失调(FA)患者(47研究疾病进展。ESCs的分化潜能和万能的功能神经元和神经胶质是已知的,和特定的文化条件所需ESCs的分化和细胞则为神经沿袭优化药物发现模式或多或少建立虽然需要进一步细化。

ALS的体外模型的建立差异化的ESCs的运动神经元是开创性的一个例子48- - - - - -50神经系统疾病的建模。转基因老鼠携带人类超氧化物歧化酶基因突变(G93A)负责ALS用于ESC隔离。本研究主要观察由G93A-positive运动神经元的死亡更迅速比野生型同行。此外,G93A-positive文化参与的星形胶质细胞分泌的有毒因素导致选择性和增加运动神经元的死亡没有对中间神经元产生影响。人类ESC-derived运动神经元也被变异老鼠astrocyte-conditioned介质(49,51]。这项工作表明潜在的成功的疾病astroglial建模使用ESC-derived神经元细胞。

一群神经发育缺陷相关的自闭症谱系障碍(ASD)也一直在研究使用万能[52),包括Rett综合症引起的x染色体MeCP-2突变有关。这种突变导致神经发育受损后一年的年龄和受影响的个体表现出类似于其他自闭症的症状。则产生的影响人分化成gaba ergic抑制性和glutamatergic兴奋性神经元。有趣的是,抹去X-inactivation MeCP-2分化神经元在重组被重建,观察强调在疾病建模存在的巨大潜力的多能细胞,并产生一致的需要程控的分化多能细胞疾病建模的目的。2个月后文化MeCP-2神经元的生存是没有显著影响。然而,glutamatergic突触的数量显著降低Rett综合症中观察到。有趣的是,治疗这些神经元文化与胰岛素样生长因子1 (igf - 1)表明增加神经突触的数目,确定救助实验可以成功地设计基于文化的神经元窝藏针对疾病的突变。总的来说,这表明患者特定的能力则在帮助理解复杂的神经退行性疾病和作为模型药物发现。

另一个主要的神经紊乱症,帕金森病,影响中脑多巴胺神经元的一个子集,是零星的,晚发性疾病。最常见的几个确定突变PD相关突变在富亮氨酸重复kinase-2 (LRKK2)。LRKK2突变携带者的万能干细胞生成神经谱系分化,生理活性多巴胺神经元生产(53]。由微阵列基因表达谱的比较分析表明,神经元产生的病人则有更高的氧化应激基因的表达,而病人则控制。此外,蛋白质α-核蛋白,负责形成特征聚合在PD高度表达54]。这些神经元被发现是容易过氧化氢和6-hydroxydopamine喜欢压力。这个实验表明,病人具体iPSC-derived神经元可用于神经系统疾病建模。

FD,最近由突变引起的遗传性疾病,我κB蛋白激酶复杂联系(IKBKAP)研究了李et al ., (46]。这种疾病导致死亡的神经嵴派生的感官和自主神经节神经元。生成的细胞则从受影响的个人和受到神经元分化。神经嵴前体细胞来源于这些细胞则显示低水平的IKBKAP蛋白质以及有缺陷的迁移和神经分化。治疗这些文化与激动素、植物激素导致了相对强劲的纠正对FD神经细胞的影响,证明iPSC-based药物发现方法具有良好的预测value-although完整临床概念仍然遥远。

因此,针对病人的细胞则提供了一个独特的机会学习和建模的影响特定基因缺陷对人类神经发展体外检测小分子或其他潜在的治疗相关的神经系统遗传病。

5。ESC和iPSC-Derived心肌细胞在药物发现

心血管疾病被认为是一个主要的和死亡的主要原因。因为成人心肌细胞再生能力有限,他们的损失永久损伤心肌收缩功能导致心功能和心脏衰竭。正在努力开发不同的方法治疗心血管疾病,包括不仅完善immunocompatible心肌细胞的生产还建立更复杂的细胞药物发现和测试系统。

啮齿动物模型无法模拟的基本生理功能的心由于他们拥有比人类更快的心跳;因此他们不可靠的动物模型来测试人类心律失常的药物。代万能先天性心脏病病人及其分化成心肌细胞已被作为模型预测系统研究疾病发病机制和药物发现(55]。ESC - iPSC-derived功能cardiomycytes可以提高药物发现和筛选过程的效率56- - - - - -58]。尽管不成熟sarcomeric和肌纤维组织超微结构和形态相似性的体外心肌细胞和成年心脏心肌细胞使其药物发现的更好的选择模型(58- - - - - -61年]。鉴于多能细胞可以分化成心肌细胞,形成一个功能合胞体体外的动作电位传播是同步的,以前没有模型可以设计为研究潜在的影响作用于心脏的药物在人类心脏组织(导电62年]。建立这样的模型,这可能替代动物实验,分化的细胞必须生长在表面多极阵列(量)63年]。使用体外分化cardiomycytes的优点包括能力保持收缩函数从而提供同质细胞培养筛选最终有助于改善高通量药物发现过程。ESCs,万能干细胞体外分化成心肌细胞正被制药公司筛选化合物参与多个生物过程。

6。ESCs和iPSC-Derived神经元毒性测试

有毒化合物的影响、环境变化和自然产生的物质会导致神经毒性,反过来,导致暂时或永久性损害中枢或周围神经系统。会,一个特定形式的神经毒性,过度刺激神经元由于脊髓损伤,发生中风、创伤性脑损伤中神经递质谷氨酸和类似物质负责神经细胞的损伤和死亡。环境毒物或药物代理可以影响这种excitotoxic流程和夸大他们的有害影响。因此,它是至关重要的发展更预测细胞模型和强大的筛查工具来评估化合物的神经毒性,药物的候选人,和环境代理。人类神经元来自ESCs和则可以有吸引力的模型来研究神经毒性。ESC和iPSC-derived神经元表现出成熟神经元的功能和行为和大量可用。可以培养活细胞化验,允许表征的神经元和神经网络对健康和连通性的程度。神经毒性的测试模型将允许为研究一方面药物候选人的负面影响在神经细胞,另一方面在化验一般的神经毒性,非常适合筛选的铅化合物和潜在重要的减少动物实验和临床前开发的成本。

一个变量可以用于神经毒性测试,可以很容易地变成一个化验端点的数量和改变细胞内钙。一些毒物已经被证明能够影响细胞内钙稳态,这是一种神经健康的可靠指标和不受干扰的功能。开发一个系统可视化胞内钙含量可能阐明类似以前无特征物质的毒性作用。目前,细胞系PC12等通常用于钙信号的分析与确定的目的引发的复杂细胞变化环境和药物神经中毒(64年]。然而,科学共识存在这永生化细胞系不概括表型特性的神经元。小鼠原代神经元培养可以更充分的解决这些问题,但不幸的是这种文化的寿命通常是2 - 3周,和他们建立需要牺牲怀孕的老鼠和解剖他们的胚胎。几项研究已经证明钙的有效性测量评估各种化合物的毒性。例如,观察depolarization-elicited钙海拔下降伴随特定的释放神经递质合成由给定的神经元可以提供宝贵的信息无特征化合物的毒性。类似的方法被用来揭示六溴环十二烷的毒性作用(HBCD),一种物质,在有氧条件下不能生物降解和很对水生生物有毒64年]。钙信号也可以揭示excitotoxic以前无特征的物质可能影响。会伴随着异常高水平的神经细胞内钙激活和相应增加,例如,被发现是三丁基锡毒害神经的影响,一种物质作为热稳定剂,农药和组件的防污漆(65年]。钙测量环境毒性的相关性以精美的一项研究显示神经中毒,如锰、铅、苯并(a)芘(不完全燃烧的产物)改变细胞内钙波的属性(66年]。

神经毒性的屏幕使用测试系统(TSs)等二维神经文化定义神经元亚型的百分比或三维文化(67年,68年]从多能细胞分化正在发展中。TSs研究了测试方法(TMs)定义一组变量(例如神经突长度)来衡量的变化发生在应对测试物质。参考化合物通常从列表中选择推荐化合物的发育神经毒性测试验证(69年]。比较给定的化合物的细胞毒性或apoptosis-triggering效应在神经元分化的不同阶段,对具体的发育神经毒性(也可以提供有用的信息70年]。

7所示。ESC和iPSC-Derived心肌细胞毒性测试

多能干细胞可以自发分化为击败cardiomyocyte-like细胞。当前的心脏从多能干细胞谱系分化系统包括使用自发形成胚状体的身体(EB)在悬浮培养,coculture老鼠endoderm-like细胞的多能干细胞(END-2细胞),对心脏和定向分化谱系定义使用生长因子(如BMP-4或苯丙酸诺龙)在暂停或单层培养(参考文献)。

毒性可导致活性氧簇(ROS)的形成,细胞凋亡,改变了收缩,心脏节律的变化,和心脏基因表达改变,可以危及生命或可能导致长期的心血管功能的改变。40%的药物在临床试验失败的71年,72年),19%停药观察到由于cardiotoxicities-thus是非常重要的测试药物的安全性和效率使用一个适当的模型系统73年]。高通量技术的发展(超过100个分子可以测试)药物筛选、评价和毒性测试可以帮助识别最好的化合物,和提高药物发现的效率,节省经济损失(71年]。

在许多毒性情况下,药物的直接互动与特定离子通道表达的心肌细胞导致变更的离子通过这些特定渠道传导。药物影响钾电流可能导致QT-prolongation,致命的心律失常,有时cardiomuscular损坏不影响离子通道(42,74年]。癌症化疗可能会导致心肌细胞凋亡和障碍;然而,不同的化疗可能有不同的毒性机制75年,76年]。在制药行业,毒性测试模型是基于细胞系,动物心肌细胞和小/大动物模型(40,41]。动物组织模型系统未能应对药物在人体组织类似的方式回应了动机的一些制药公司使用ESCs人类和万能派生心肌细胞毒性测试(40- - - - - -42];预计,随着时间的推移,其他公司将遵循这个例子。

一些协议和策略已经报道了体外分化的心肌细胞的ESCs和万能。这些心肌细胞体外功能,在同样的方式回应药物胎儿心肌细胞(77年]。通常,药物与已知的一个子集,接受arrhythmogenic属性可以用于治疗ESC -和iPSC-derived心肌细胞的功能特性。取得了令人鼓舞的结果使用电生理学研究ESC - iPSC-derived心肌细胞的反应药物治疗。然而,这些结果有限制由于不同的实验装置和药物的数量在每个研究。

人类多能stem-cell-derived心肌细胞已被用于研究药物引起QT间隔延长(41,78年]。药物包括奎尼丁D, L-sotalol cisapride, terfenadine用于本研究与QT延长和/或带条de同构。此外,药物,如酮康唑和异搏定作为负控制演示特异性(41]。详细的剂量反应分析中,预期效果与延长QT间隔重叠领域潜在的时间证明了一个很好的起点,但获得更高层次的信心在这个系统,并赢得了业界的认可,一个更大的集合的药物需要评估,和细胞必须在标准操作程序(sop)由一个行业标准的质量保证和质量控制体系。另外,比较的药物影响,最近的两项研究[79年,80年)展示了hiPSC-derived心肌细胞和传统之间的一致性,有效的,兔子和狗体外浦肯野纤维模型,这是常用的作为后续分析。ESC的跨膜动作电位,iPSC-derived心肌细胞研究了使用微电极[80年]。药物引起的心律不齐的事件被使用反向使用依赖评估,动作电位的三角测量,和短期复极化参数的变异性。结果表明,兔浦肯野纤维和ventricular-like ESC - iPSC-derived心肌细胞以类似的方式回应关于早期after-depolarization的发病率,增加了三角,短期可变性的复极化响应人类ether-a-go-go-related基因hERG通道阻塞复合e - 4031。

另一项研究表明,ESC - iPSC-derived心肌细胞动作电位提供特殊药物敏感性试验相比,兔子和狗浦肯野纤维(79年]。此外,这些心肌细胞导致化合物减少能耗、节省成本和时间比传统的浦肯野纤维化验。研究还报告说,这些心肌细胞是好的探测器proarrhythmic事件和去极化后不久被参考化合物诱导terfenadine,心得怡,cisapride和e - 4031。众所周知,不会干扰离子通道功能的化合物也能引起cardiotoxic侮辱。ESC和iPSC-derived心肌细胞被认为是适合研究化合物的影响都不会干扰离子通道功能,但仍造成毒性,产生影响,不能显示通过使用传统的细胞系和受体overexpression-based方法(41]。

ESC和iPSC-derived心肌细胞最近被用于研究doxorubicin-triggered毒性(81年]。两个决定性的心脏损伤的生物标志物临床doxorubicin-induced毒性敏感指标进行了研究。ESC和iPSC-derived心肌细胞释放检测心肌肌钙蛋白T水平和脂肪酸结合蛋白3在阿霉素诱导后剂量依赖性的方式(82年]。基于非常敏感和快速分析工具的可用性对于这些生物标记,分析适合实现小型化和高通量的格式。这一战略表明,药物治疗后毒性的分子机制可以研究。

8。未来的挑战和观点

ESCs的一个重要的任务在使用万能药物发现和较低的毒性测试是产生大量的细胞异质性,以一致的方式。ESCs的机器人和悬浮培养方法(83年,84年ESC)提供一个广泛的评估和标准化系统文化。虽然推导则被认为是有趣的和优越的模型系统发展的药物发现和毒性测试模型系统,一些障碍与重组过程必须被克服。增加的产量重新编程细胞,细胞重新编程的选择尤为重要,鉴于不同的细胞类型的变量reprogrammability [24,85年- - - - - -87年)(乙et al。20.])。此外重组因子和基因传递方法的选择将为每一个药物发现构成基础或毒性测试应用程序。

下一个挑战将是优化ESCs的协议的分化和成神经和心脏的细胞则血统,尽管一些协议已经用于生产功能性神经元和心肌细胞的ESCs和万能的,虽然有不同的效率。理解不同的信号通路和因素负责心脏和神经分化的细胞将有助于提高差异化协议。发展更多的同质细胞表型分化后的发展是必要的可靠的药物发现和标准化模型系统和毒性测试。此外,生产更成熟的细胞类型的多能干细胞可以有利于使用作为一个模型系统为成年人体器官在药理学和毒理学研究。文化分化神经元和心肌细胞可能有助于产生更多适合测试药物化合物的细胞类型。

总之,ESC -和iPSC-derived神经元和心肌细胞对药物发现和毒性测试构成一个非常有前途的工具时更加成熟,高效和可再生的分化和扩大的方法。早期的“概念验证”的例子提出了突出的趋势和方法的潜力;然而当前工业和医疗实践仍然是基于正确验证“旧”技术。进一步主要努力和承诺将需要满足预期对多能干细胞系统国际公司的努力包括最近欧盟第七框架计划”创新医药倡议”呼吁人类iPSC-based药物和毒性测试系统适用承诺等金融和刺激发展。

确认

支持赠款是欧盟FP6 (CLONET mrtn - ct - 2006 - 035468),欧盟FP7(之下PluriSys、健康- 2007 b - 223485;合作伙伴,piap - ga - 2008 - 218205;Industem piap - ga - 2008 - 230675;EpiHealth fp7 -健康- 2011 - 278418之下;决心,fp7 -健康- f4之下2008 - 202047),和NKFP_07_1-ES2HEART-HU奖金hu_08/2 - 2009 - 0008,奖金hu_08/2 - 2009 - 0002。

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