文摘

间充质干细胞(msc)是一个诱人的治疗资源,因为他们的可塑性,免疫调节能力和缓解的可用性。人类BM-derived msc增殖能力有限,因此,它是具有挑战性的用于组织工程和再生医学应用。因此,胎盘msc的起源,这是富有的msc的来源之一是选择建立长期文化的子叶足月胎盘。流分析建立bonafied msc表型特征、染色积极CD29, CD73, CD90、CD105和消极CD14、CD34、CD45标记。培养的msc的多能性是评估在体外分化不仅intralineage细胞和脂肪细胞,骨细胞、软骨细胞、和myotubules细胞还translineage对胰腺祖细胞分化,神经细胞和视网膜细胞显示可塑性。这些细胞没有明显改变细胞周期和细胞凋亡模式,同时保持正常核型;他们也有有限的表达mhc ii抗原,天真的刺激因素CD80和CD 86。进一步软琼脂化验表明,胎盘msc没有殖民地形成入侵的能力。结合这些特点考虑,它表明,胎盘msc可以作为适合使用基于干细胞疗法的发展和进步。

1。介绍

间充质干细胞(msc)这个术语是在1991年由卡普兰(1]。msc被定义为类的干细胞自我更新和分化成多种细胞谱系的潜力(2,3]。在骨髓间充质干细胞的存在被Cohnheim假设在1860年代4]。在1920年代,Maximow假设的重要性骨髓间质组织支持的开发和维护血液和造血器官5]。在1960年代,Friedenstein是第一个证明骨髓基质细胞可以隔绝整个吸入基于分化粘连组织培养塑料盘子(6]。此外,msc分泌proangiogenic [7和凋亡细胞因子和具有免疫抑制特性8]。骨髓msc是最常用和msc的主要来源9]。然而,由于骨髓的侵袭性的愿望和有限的增殖能力,正在努力确定丰富和可靠的临床应用(msc的来源9]。间充质干细胞可以大致分为两个不同的子组成人msc和胎儿msc。成年msc与骨髓、外周血。胎儿msc孤立于胎盘、羊水、脐带及脐带血(10]。胎盘提供了一个最可靠的和丰富的msc(来源11]。出生后胎盘组织被丢弃,因此这些组织可以有效地用于研究以及临床应用没有多少道德问题。在这篇文章中,我们系统地描述术语胎盘MSC与子叶和验证,孤立的MSC满足基因型和功能标准制定一个合适的MSC (11,12]。我们已经表明,这些msc甚至有能力迅速扩大到25 - 30段落不影响染色体数,细胞周期和细胞凋亡的模式,表型特征,pluripotency-associated内源性基因表达谱,和分化能力。胎盘msc能够transdifferentiate成其他细胞谱系从而表现出其固有的可塑性。

2。材料和方法

2.1。收集人类胎盘的样本

基督教医学院伦理委员会(CMC), Vellore,批准了这项研究。后书面同意一项选择性剖腹产后胎盘从捐赠者收集的样本。

2.2。细胞隔离

项人类胎盘msc隔绝子叶对胎盘母性的一面。胎盘从母体胎盘膜的一面被割开,约80克的子叶被很好地执行。PBS和子叶是彻底洗干净切成小块。血凝块出现在子叶是机械移除。切碎的胎盘是再次用生理盐水洗净并受顺序与胰蛋白酶、胶原酶消化即组织孵化与0.25%胰蛋白酶为1小时37°C。胰蛋白酶消化后,样品被过滤到250年μ米金属筛。滞留物被收集并受到第二胶原酶消化with12.5 U /毫升我1小时37°C。我胶原酶消化组织样本是250年第一次通过μ米金属筛和滤液收集在100年通过μm细胞的过滤器。双重过滤后的滤液含有细胞悬液阶段受到在300 g离心10分钟。细胞颗粒在红细胞裂解缓冲和离心机resuspended 300克10分钟。最后,在间充质细胞颗粒resuspended扩张介质(αMEM + 10%的边后卫50 + 50 u /毫升青霉素+μ谷酰胺)和g / mL链霉素+ 1毫米镀成两个75厘米²烧瓶。

2.3。抗体

主要和次要的信息抗体用于流式细胞术和免疫染色实验中提供了补充表1是网上doi: 10.1155 / 2012/174328。

2.4。流式细胞术

细胞后胰蛋白酶化也同样能整除(1×10⁵每个反应细胞)在活细胞流式细胞仪管和染色与相应的抗体。无污点的抗体和细胞染色同形像抗体作为对照组。抗体被添加到细胞在黑暗避免漂白。的抗体后,样品在室温下孵化在黑暗的20分钟。细胞被洗1毫升DPBS没有钙、镁和离心机在300 g 5分钟。300年的颗粒状细胞resuspendedμL DPBS w / o钙、镁和分析流式细胞分析仪(流式细胞仪石中剑;正欲)。至少10⁴封闭的收购事件使用细胞从每个样本进行分析探索。

2.5。细胞遗传学分析

人类胎盘msc进行核型分析段落5和25来验证染色体的完整性。中期染色体准备进行根据标准程序在400 - 550年GTG乐队的水平。蔡司axioplan显微镜是用来识别和分析染色体。图像分析与光度电荷耦合装置摄像机和控制和智能捕捉成像软件。

2.6。疣状

细胞培养与PBS 6-well盘子被封锁(没有Ca^{2 +}和毫克^{2 +}包含0.1% BSA),固定使用0.2%与4%多聚甲醛和permeabilized Triton x - 100。如果使用非结合的抗体,样本第一次孵化主要抗体,阻止了PBS包含0.1% BSA,随后孵化与荧光染料结合二级抗体。所有的细胞样本与赫斯特33342年另外复染色。图像被使用徕卡DMI6000B(莱卡)配备DFC360FX数码相机与Lecia AF成像和分析软件(莱卡)。

2.7。总RNA隔离和逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)

总RNA进行了隔离使用试剂盒(表达载体)。互补脱氧核糖核酸制备上标逆转录酶III。引物序列和各自的退火温度提出了补充entary表2。PCR条件初始变性在94°C 2分钟,其次是变性为1分钟在94°C,退火1分钟,在72°C扩展2分钟35周期,和最终的扩展进行了5分钟的72°C。3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) RNA被用作控制RNA正常化。PCR分析了产品使用溴化乙锭染色2%琼脂糖凝胶。凝胶图像分析(补充表2)。

2.8。QPCR

总RNA提取试剂盒(英杰公司)根据制造商的协议。互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用上标三世第一链合成系统(表达载体)。存在进行SYBR绿色主人混合和AB实时thermocycler (AB 7500)。引物序列为内生多能性基因表达的分析中提到下面的表。单个基因的表达水平正常化β肌动蛋白(补充表2)。

2.9。细胞周期分析

细胞周期分析(13),细胞被固定用冷甲醇,核糖核酸酶处理10μ50 g / mL,沾Propidium碘μ由flowcytometer g / mL,和分析。

2.10。细胞凋亡分析

细胞凋亡分析是按照制造商的指示(BD Pharmingen膜联蛋白V)。这些细胞受到生活染色膜联蛋白V并通过flowcytometer 7-AAD和分析细胞。

2.11。Oligo-Lineage分化分析

胎盘msc在不同段落受到内部和translineage差异化协议来分析细胞的可塑性。分化后,细胞染色与适当的污渍和徕卡显微镜下检查显微镜下。

2.12。脂肪形成的分化

胎盘在5×10 msc⁴细胞被播种到24-well板(康宁)含有脂肪形成的分化培养基(表达载体)30天,新鲜培养基添加每48小时。油红O染色进行了可视化的存在脂肪滴。细胞用4%多聚甲醛固定,与无菌水清洗,孵化在室温下以60%异丙醇。固定细胞沾油红O 0.5%异丙醇在室温下20分钟。染色后,细胞首先用60%异丙醇洗净后用无菌水冲洗之前观察显微镜下的成像。

2.13。Chondrogenic分化

使用falcon25 Chondrogenic分化进行了静态细胞培养系统(特别在我们实验室制造的软骨细胞分化)。细胞受到micromass细胞培养条件下的软骨细胞分化诱导软骨细胞分化培养基(表达载体)30天。一百万年msc在300 g和颗粒状软骨细胞分化中添加没有令人不安的小球。媒体改变了每48小时。分化后细胞与10%福尔马林固定,沾染了merchrome,嵌入在石蜡。染色deparaffinized 5μm蛋白聚糖部分染色是使用阿尔新蓝saffranin O和3%。染色后,部分被用蒸馏水冲洗,风干在室温下,沉浸在二甲苯,安装使用DPX在显微镜下观察。

2.14。成骨分化

成骨分化,5×10⁴细胞被播种在24-well每板包含成骨诱导介质(表达载体)30天,与媒体改变每48小时。分化后的细胞外钙VonKossa染色证实了。vonkossa染色,细胞被固定在pre-cooled甲醇。修复后,细胞被洗DPBS (W / O Ca^{2 +}和毫克^{2 +}),用5%的硝酸银溶液水,暴露于紫外线层流罩下1小时。染色细胞用水洗和5%的硫代硫酸钠在水中孵化在室温下2分钟。最后,样本用无菌水冲洗,在显微镜下观察到的成像。

2.15。Myotubule分化

myotubule分化[14),5×10⁴胎盘msc被播种在25厘米²包含间充质膨胀介质与3瓶μM 5-azacytidine。21天的细胞培养与媒体变化每7天。这些细胞被沾染了赫斯特33342 (5μg / mL),在37°C的环境之前30分钟观察显微镜下的成像。

2.16。管式分析

基底膜基质(BD)解冻一夜之间在4°C。50μL(基底膜基质是整除/ 96板使用预冷的技巧。板是在300 g离心5分钟,4°C。允许聚合在37°C为30分钟。在1×10 msc⁵/被播种在间充质细胞扩张中。细胞在37°C在缺氧条件下孵化前6小时在显微镜下观察成像(15]。

2.17。神经分化

诱导神经细胞分化[16),5×10⁵胎盘msc被播种到无血清αmem包含5毫米β巯基乙醇和培养6 - 9小时。诱导后的细胞被固定为疣状分析。

2.18。视网膜细胞分化

视网膜分化[17),1×10⁵含有间质细胞被播种到媒体扩张中补充了50μBeta-mercaptoethanol M牛磺酸与1毫米。细胞,培养了与媒体变化每4天4天。收集后视网膜诱导细胞免疫染色试剂盒进行rt - pcr分析或固定。

2.19。胰腺祖细胞分化

胰腺分化[12,18,19),25厘米²烧瓶用明胶和治疗5×10⁵细胞被播种到糊化菜含有间质膨胀介质与10毫米烟酰胺和1毫米β巯基乙醇24小时。入伍前的后,细胞间质对待扩张中不包含10毫米的边后卫,但烟酰胺和1毫米β巯基乙醇为6小时,18小时后细胞诱导处理媒体包含的边后卫。分化后,细胞被收集在试剂盒,为疣状进行rt - pcr分析或固定。

2.20。软琼脂试验

软琼脂试验(20.),0.6%琼脂表面含有MEM分层35毫米盘在层流罩(康宁)和孵化了30分钟。之后,2×10⁴msc与0.3%琼脂混合包含MEM和显示在顶部的0.6%琼脂层。板在罩孵化20分钟。孵化后,500μL的间叶细胞扩张中添加和孵化21天。的菜,500μL新的媒体每7天添加一次。海拉细胞被用作一个积极的控制。

2.21。双硫腙染色

双硫腙(STZ)染色,细胞与戴德梁行孵化100解决方案μ克/毫升αmem媒体20分钟37°C。染色后,细胞被冲洗与PBS和显微镜下检查两次21]。

2.22。细胞群体倍增时间(Gt)

人口倍增时间显示胎盘msc的增长率(22),人口翻倍(PD) ln =自然对数,Nf =最终细胞计数,倪等于初始细胞计数 =时间在小时后细胞播种。

平均Gt值被添加了Gt值获得不同的实验除以数量的实验。

3所示。结果

3.1。推导附着纤维母细胞的间充质干细胞(msc)人类胎盘和母性的一面Immunophenotypic人类胎盘msc的表征

酶促反应而引起人类称为胎盘导致细胞壁的分馏推导的纤维母细胞,这是一般术语placenta-derived多能间充质干细胞(PD-MSCs)。选择msc经典粘连方法依赖于组织培养的塑料。胎盘msc从8项胎盘从母体侧小叶已建立的样本的人类胎盘后胰蛋白酶消化和collagenase-I样本通过100后治疗μ过滤和被播种αmem包含10%的边后卫,然后粘附细胞人口特征的扩散能力,细胞周期,细胞死亡模式,immunophenotypic特性,和分化能力。孤立的msc形成附着纤维母细胞纺锤状的同质单层。协议被证明是成功的8 8胎盘组织的集合。电镀的细胞悬浮液从第一个用胰蛋白酶消化不产生任何殖民地,但我最后细胞悬浊液产生胶原酶消化的胎盘组织碎片通常产生可变大小的MSC殖民地包含:纤维母细胞。细胞的初始镀后,殖民地7天之后变得可见。这些MSC殖民地开始稳步增多,瓶差不多60 - 70%汇合的,第14天准备分裂。通常,大约5 - 6×10⁴细胞被镀后12 - 14天内获得。在烧瓶的起始过程受到胰蛋白酶化在1:2或1:3比率。75厘米²1:2分裂subconfluent第三天,表明这些孤立的细胞快速增殖能力。:细胞收获和山肩高稀释迅速形成二次殖民地从单个细胞(数字1(一)和1 (b))。PD-MSCs被扩展到通过25 - 30(据我们培养)形态特征(数据没有任何变化1 (c)和1 (d)),适合常规冷冻保存,解冻和差异化协议。msc的特点使用flow-cytometry-based CD29间叶细胞谱系表面标记阳性反应⁺,CD73⁺,CD90⁺CD105,⁺;和消极的CD34造血标志⁻、CD45⁻,也CD14的负面言论⁻,HLA DR⁻;被用来定义msc(数据吗1 (c),1 (d),1 (e))。流式细胞仪显示很少散射之间的表型标记placenta-derived隔离的8例,同时人口倍增时间计算没有显著改变。的表达谱证实标准通常定义为多功能间充质干细胞(23]。

3.2。msc的可塑性

与PD-MSCs特定诱导分化研究,早期,中期,和一个通道8位受试者从末。这证实,间充质具备干细胞概要PD-MSC人口的确与生成不同的中胚层的谱系细胞类型的能力在他们接触溶性生长和分化的因素在体外。同时,当受到translineage MSC分化显示显著的可塑性分化成外胚层的(神经细胞、视网膜细胞)和内胚层的血统(胰腺β细胞)。Subconfluent文化被发现至关重要的维护期间PD-MSCs扩张的具备干细胞表型。的表型特征PD-MSCs亚文化50 - 70%时细胞密度依然不受影响,同时保持他们的初始标记的曝光率和分化的能力。msc可以分化成细胞从所有三个合适的补充条件下微生物层在体外。数据显示代表脂肪形成的结果(图2(一)),成骨的(图2(b))和chondrogenic(数字2(c),2(d))差异化分析、可视化大的脂质空泡,矿化骨钙沉积和saffranin O积极胶原蛋白矩阵分别。这些脂肪形成、骨和软骨形成和myotubule形成(图2(e))和内皮细胞管试验(图2(f))表示的能力MSC分化为中胚层细胞谱系。此外,报告可在MSC文化存在血管生成生长因子VEGF诱导的CD34的表达,这是造血的标记,以及内皮细胞前体(35]。图还显示了神经发生(数字2(g),2(h),2(我),2(j),2(k)(图)和视网膜细胞2(左))分化展品msc的外胚层的分化能力。此外,在胰腺β细胞分化表示(图2(m))胎盘msc的内胚层的分化能力。同时,rt - pcr扩增calbindin2和recoverin基因显示(图2(n))视网膜(外胚层的血统)分化,胰淀粉酶基因(图2(n)胰腺β细胞诱导后)也被放大。

3.3。广泛通过Placenta-Derived MSC不显著改变细胞周期和凋亡模式,同时保持正常核型

在第二组实验中propidium碘染色后,我们测试了MSC细胞周期状态;图3(一个)显示在早期和晚期使细胞循环过程中没有明显的变化。详细的图3 (b),分析正常的46,XX在所有测试样本。染色体数目正常被发现在所有分析PD-MSC隔离()。看着母亲的起源,我们发现PD-MSC隔离了与我们隔离过程总是孕产妇起源。同时,细胞死亡模式的文档很重要每个通道扩散MSC;Annexin-V和7 aad染色不显示(图3 (c)在凋亡细胞百分比显著变化(~ 5 - 7%的细胞)。

3.4。胎盘MSC显示更高的Oct4内源性基因表达,Sox2和Nanog BM-Derived MSC

流式细胞仪分析Oct3/4, Stro-1抗体显示阳性反应。接下来,我们想分析PD MSC的pluripotency-associated内源性基因表达谱和从骨髓MSC (BM-MSC)。图4从比较实时qPCR显示数据,显示Oct4表达水平升高,Sox2, nanog BM-MSC相比。报告也可以流式细胞术和免疫细胞化学,这显示PD-MSCs stage-specific胚胎抗原阳性SSEA-3但不利于SSEA-4 (11]。

3.5。体外相信检测试验

胎盘msc当受到软琼脂试验没有收益率tumoroids甚至4周后体外软琼脂试验(图文化5)。然而,海拉细胞开始形成聚集在7天内,和许多大的殖民地(图21天结束时形成的5)。

4所示。讨论

人类胚胎干细胞(ESCs)有可能分化成所有三个细胞谱系(24]。然而,一些实际的和伦理问题呈现在用于日常的临床应用。然而,额外的胚胎组织可以有效地用于隔离多能干细胞。胎盘是一个额外的胚胎器官祖或干细胞来源丰富25]。胎盘具有两面性;一个是胎儿侧由羊膜和绒毛膜和其他是母性的一面由蜕膜(24]。间充质干细胞(msc)隔绝产妇人力term-placenta代表一个重要的细胞类型的干细胞研究和临床治疗不仅因为他们分化为中胚层细胞谱系的能力,如骨细胞、软骨细胞、肌肉,或内皮细胞(2),但也为他们的非凡translineage像神经细胞分化能力,视网膜细胞(外胚层的),和胰腺β细胞(内胚层的血统)。此外,他们分泌大量proangiogenic和凋亡细胞因子(26)和具有显著的免疫抑制特性(27]。msc被来自许多不同的器官和组织(28]。证据的不同部分人类胎盘,脐带和羊膜,港口以及脐血MSC (29日- - - - - -32]。这些组织通常出生后丢弃,避免道德问题(23机械,以及酶的方法MSC隔绝不同地区不同妊娠年龄的人类胎盘已报告在文献[29日,33- - - - - -47]。知识的生命力,平均人口倍增时间,核型稳定,细胞周期和细胞凋亡模式,表型,和可扩展性placenta-derived MSC隔离治疗应用的先决条件;然而,系统的可靠性调查这MSC源和表型稳定没有得到太多的关注。此外,报告placenta-derived msc往往缺乏信息的细胞周期,细胞死亡模式,progenitor-specific内源性基因表达,和细胞的核型隔离。在本文中,我们描述酶分离oligo-lineage term-human胎盘,促进复苏,纤维母细胞,通常称为placenta-derived间充质干细胞与高保真(PDMSCs)。证明了细胞周期和细胞凋亡细胞分析早期和晚期的段落;平均的人口倍增时间,PD-MSC没有显示显著的细胞周期和细胞凋亡的变化模式。此外,基因型分析的细胞分离的胎盘组织大多是孕产妇、胎儿,起源。我们系统特性的细胞隔离来自多个情况下表明这些细胞隔离可重复实现的一般定义msc分化表型和功能标准。(24]。我们证明母亲般地派生PD-MSCs可以大大扩展,不改变显著改变细胞周期和细胞凋亡的模式,显示pluripotency-associated内源性基因表达,并保持其分化能力和稳定的表现型显示改变kayotype通道-通道。在这些实验中,子叶的胎盘msc是孤立的存在于胎盘母性的一面。我们细胞隔离方法的顺序与胰蛋白酶消化的滋养层细胞层和胶原酶消化后剩余的胎盘组织我为获得PD msc被证明是非常有效的。产物的PD-MSCs胶原酶消化成功在8 8胎盘组织和导致人口非常小散射MSC概要,学科之间。至于传播,我们发现PD-MSCs必须在subconfluent文化传播保持MSC,因为支流文化逐渐丧失MSC的身份。通过适当的subconfluent通道,PDMSCs维护他们的表型MSC概要30段落。流式细胞术研究表明表面标记特征有显著的相似性从通道1到30。显微镜观察显示胎盘msc增殖迅速,直到30的前提下通过间充质干细胞的形态学特征和质量属性细胞周期和细胞凋亡等模式,pluripotency-associated内源性基因表达和正常核型。

特征数据超出30还没有通过测试。msc纺锤形纤维母细胞形态。HLA DR的缺失α和HLA博士β1表达,rt - pcr分析,结果表明,胎盘msc可以有效地用于自体和同种异体的移植。msc的分化速度更快,效率和可伸缩的胚胎干细胞相比。软琼脂试验表明,孤立的胎盘msc不拥有任何恶性性质。一些动物和人体试验表明,使用msc与胚胎干细胞并不导致的形成畸胎瘤在活的有机体内(24]。此外,使用术语胎盘msc与胎儿组织的伦理问题,因为他们更少,无论如何会被丢弃。

5。结论

人类term-placenta相对容易和吸引了更少的道德问题。胎盘组织构成一个健壮的MSC的来源。在这项研究中,我们调查了几个参数,即(1)染色体数目,(2)多能性相关的基因表达,(3)孕产妇起源、(4)顺序酶消化(胰蛋白酶其次是胶原酶)作为隔离的方法,(5)细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的模式,这是重要的对他们的主要效用细胞治疗和可能影响其增殖,分化,能力。根据结果,我们得出这样的结论:丰富的多能细胞,迅速扩散,稳定的核型,可塑性和免疫调节特性使胎盘msc临床和组织工程应用的理想选择。然而,使用msc的主要缺点是,需要一个面板的表面标记分离msc的同质性的特征。进一步,与成人msc,相当数量的人类临床试验正在进行中,在临床应用中使用胎盘msc是相对较新。需要额外的研究来证实胎盘msc在医学应用的使用。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢鼓励和支持延长所有学生和员工CSCR和CMC开展研究工作的成功。他们表达他们的感激之情生物技术部门Ramalingaswami奖学金桑杰库马尔和研究支持格兰特(印度生物技术部批准号BT / PR15420 /地中海/ 31/122/2011),印度政府。

补充材料